Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.
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Articolo metodologico
Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La riparazione delle rotture a doppio filamento (DSBs) nel DNA è un processo altamente coordinato, rendendo necessaria la formazione e la risoluzione di complessi di riparazione della multi-proteina. Questo processo è regolato da una miriade di proteine che promuovono l'associazione e dissociazione delle proteine a queste lesioni. Grazie in gran parte alla capacità di eseguire schermi funzionali di una vasta libreria di proteine, c'è un maggiore apprezzamento dei geni necessari per la riparazione di rottura del DNA double-strand. Schermi di inibitore spesso knockout o chimici identificano proteine coinvolte nei processi di riparazione utilizzando tossicità aumentata come indicatore per una proteina che è necessaria per la riparazione DSB. Sebbene sia utile per identificazione romanzo proteine cellulari coinvolte nel mantenimento della fedeltà del genoma, analisi funzionale richiede la determinazione di se la proteina di interesse promuove la localizzazione, la formazione o la risoluzione di complessi di riparazione.
L'accumulo di proteine di riparazione può essere facilmente individuata come distinti foci nucleari da microscopia di immunofluorescenza. Così, associazione e dissociazione di queste proteine nei siti di danno del DNA può essere letta osservando questi fuochi nucleari intervalli rappresentativi dopo l'induzione di rotture a doppio filamento del DNA. Questo approccio può anche identificare proteine del fattore di riparazione mis-localizzata, se difetti di riparazione non si verificano simultaneamente con incompleti ritardi nella riparazione. In questo scenario, lunga durata rotture a doppio filamento del DNA possono essere progettate esprimendo un'endonucleasi di taglio raro (ad es., SceI) in cellule dove il sito di riconoscimento per l'enzima suddetto è stato integrato nel genoma della cellula. La lesione risultante è particolarmente difficile da risolvere come fedele riparazione reintrodurrà il sito di riconoscimento dell'enzima, che richiede un altro giro di clivaggio. Di conseguenza, vengono eliminate le differenze nella cinetica della riparazione. Se non si formano complessi di riparazione, localizzazione è stato ostacolato. Questo protocollo descrive la metodologia necessaria per identificare le modifiche nella cinetica di riparazione, nonché la localizzazione della proteina di riparazione.
Introduzione
Ogni giorno, ogni cellula nel corpo umano è bombardato con un 10.000 stimato DNA lesioni1. Questa minaccia esistenziale ci mette a rischio di mutazioni, oncogenesi, nonché delle cellule morte. Per proteggere la fedeltà del genoma, le cellule di mammiferi si sono evolute per rispondere a danno del DNA con una complessa serie di associazioni di proteina e modifiche. Questa risposta è organizzata in più percorsi, conosciuti collettivamente come il DNA danni risposta (DDR)2,3. Il DDR è costituito dall'accumulo di proteine di riparazione del DNA alle lesioni del DNA, coordinate sia temporalm....
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Protocollo
Siete pregati di notare che questo protocollo è stato scritto per U2OS celle contenenti un sito di riconoscimento-SceI18. Le celle non devono essere U2OS ma devono contenere il sito SceI. Il protocollo potrebbe essere necessario essere regolato (ad es., numero di cellule seminate e tempi di incubazione) a seconda del tipo di celle utilizzate.
1. definire la cinetica di formazione di complessi di riparazione DSB
- Crescere le cellule U20S-DRGFP su una piastra di coltura del tessuto 10 cm fino a 85 – 90% confluenti.
- Rimuovere il supporto e incubare a temperatura ambiente (TA) in 3 mL di EDTA ....
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Risultati
Figura 1 illustra la selezione della discriminazione rumore corretto per la quantificazione di maxima/fuochi usando ImageJ. Le immagini unite di DAPI e la proteina di riparazione di interesse sono sul pannello di sinistra. Figura 1A Mostra una discriminazione di rumore di 90 e segna il numero corretto dei fuochi. I nuclei sul bordo (raffigurato con una freccia rosa) e i fuochi di fuori dei nuclei (raffigurati con una freccia gial.......
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Discussione
L'analisi del DNA danni riparazione in generale e la riparazione delle rotture del DNA double-stranded in particolare è un'area attiva di ricerca, poiché le sue conseguenze estendono su tumorigenesi a biologia di base6,20. Questo dettagli di manoscritto un approccio che analizza con precisione il contributo delle proteine RAD51 e γ-H2AX alla risoluzione di DSBs attraverso HR. guardando al futuro, questo metodo può essere usato per delucidare ulteriori funzioni de.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Grazie a Joel Sanneman e Dr. Philine Wangemann del nucleo di microscopia confocale, finanziato da la Kansas State University College di medicina veterinaria, per il loro sostegno degli sforzi per sviluppare questa tecnica. pCBASceI era un regalo di Maria Jasin (Addgene plasmide # 26477) 30. Le cellule U2OS DR-GFP erano un regalo gentile da Maria Jasin18.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini coprioggetti da 12 mm | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldeide (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| Piastra a 24 pozzetti | VWR | 82050-892 | |
| Piastra inferiore in vetro a 96 pozzetti | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Plugin Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formati per ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, Alto glucosio | ThermoFisher Scientific 12100046 | ||
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Capra Anti-Coniglio IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Perossido di idrogeno | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | Istituto Nazionale di Sanità (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector Addgene | 26477 | ||
| Smalto per unghie- Insta Dri | Sally e Hansen | Chiaramente Veloce (103) | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| Reagente antidissolvenza ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Reagente di trasfezione TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
Riferimenti
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J.
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Ristampe e permessi
