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Articolo metodologico

Intracranica Subarachnoidal itinerario dell'infezione per indagare ruoli di biofilm di Streptococcus suis nella meningite in un modello di infezione del topo

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DOI:

10.3791/57658

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1 luglio 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, 2Key Lab of Animal Bacteriology, Ministry of Agriculture, 3OIE Reference Lab for Swine Streptococcosis, 4School of Medicine, Tsinghua University, 5Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo l'itinerario subarachnoidal intracranica dell'infezione nei topi per studiare i ruoli dei biofilm nella meningite Streptococcus suis . Questo modello di infezione è anche adatto per studiare la patogenesi di altre meningite batterica e l'efficacia di nuovi farmaci contro la meningite batterica.

Abstract

Streptococcus suis è non solo un importante agente patogeno batterico di suini in tutto il mondo, ma anche un agente zoonotico emergente. In esseri umani e maiali, la meningite è una manifestazione importante di infezioni da S. suis . Un modello di infezione adatto è uno strumento essenziale per comprendere i meccanismi delle malattie causate da agenti patogeni. Diversi itinerari dell'infezione nei topi sono stati sviluppati per studiare la patogenesi dell'infezione da S. suis . Tuttavia, i percorsi intraperitoneali, intranasali ed endovenosa dell'infezione non sono adatti per studiare i ruoli dei componenti di superficie di S. suis nella meningite direttamente nel cervello, come la matrice extracellulare da biofilm. Anche se l'inoculazione intracisternal è stato utilizzato per infezione da S. suis , il sito di iniezione precisa non è stata descritta. Qui, l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione è stata descritta in un modello murino per studiare i ruoli di biofilm in S. suis meningite. S. suis cellule planctoniche o biofilm dello stato sono stati iniettati direttamente nello spazio subaracnoideo dei topi attraverso il sito di iniezione si trova 3,5 mm rostrale dal bregma. L'analisi istopatologica e aumentata espressione di mRNA di TLR2 e citochine del tessuto cerebrale da topi iniettati con le cellule di biofilm stato indicato chiaramente che S. suis biofilm svolge ruoli definitivi in S. suis meningite. Questo itinerario dell'infezione ha evidenti vantaggi rispetto ad altre vie di infezione, permettendo lo studio dell'interazione ospite-batterio. Inoltre, esso consente l'effetto di componenti batteriche sulla risposta immune dell'ospite direttamente nel cervello per essere valutati e imita ingresso batterica nel sistema nervoso centrale. Questo itinerario dell'infezione può essere esteso per indagare i meccanismi della meningite causate da altri batteri. Inoltre, può anche essere utilizzato per testare l'efficacia di farmaci contro la meningite batterica.

Introduzione

Streptococcus suis (S. suis) è un importante agente patogeno batterico di suini in tutto il mondo, causando gravi malattie tra cui la meningite, polmonite, setticemia, endocardite e artrite1. È anche un agente zoonotico emergente. Finora, è stato segnalato che nove sierotipi possono causare infezione in esseri umani, compreso i sierotipi 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 e 312,3,4. In esseri umani e maiali, la meningite è uno dei principali segni clinici delle infezioni da S. suis . In Vietnam e Thailandia, S. suis è la principale causa della meningite in adulti5. Biofilm microbici sono microrganismi che aderiscono a vicenda e sono concentrati in un'interfaccia; Essi sono essenziali per la virulenza batterica, sopravvivenza in ambienti diversi e Antibiotico-resistenza5. I biofilm sono in genere circondati da una matrice extracellulare che generalmente contiene polisaccaridi, proteine e DNA6. Quest'ultimo è in grado di suscitare la risposta infiammatoria dell'ospite e di produzione di citochina7. Formazione di biofilm è stata segnalata per essere coinvolti nella meningite streptococcica in studi precedenti. Biofilm contribuiscono alla meningite da Streptococcus agalactiae in un modello di pesce tilapia e formazione di biofilm è stato rivelato all'interno dei tessuti del cervello e nei dintorni di meningea superfici in vivo attraverso Inoculazione intra-addominale8. Durante la meningite, lo streptococco pneumoniae è in uno stato di biofilm e batteri in un tale stato di biofilm erano più efficaci nell'induzione della meningite in un modello di infezione del mouse9. Inoltre, nel nostro precedente studio, lo stato di biofilm associato S. suis nel cervello del topo contribuisce alla virulenza batterica di sopravvivenza analisi10. Tuttavia, la prova diretta per il coinvolgimento di biofilm in S. suis meningite richiede ulteriori indagini.

Modelli animali di infezione da S. suis sono stati sviluppati nei topi utilizzando intraperitoneale (i.p.)11, intranasale (i.n.)12, endovenosa (i.v.)13e gli itinerari di intracisternal (i.c.) di infezione14, 15 , 16. Tuttavia, le vie di i.p., i.n. e i.v. di infezione non sono adatte per studiare i ruoli dei componenti di superficie di S. suis nella meningite direttamente nel cervello. Questi includono matrice extracellulare da biofilm. Anche se l'inoculazione di i.c. è stato usato per infezione da S. suis , il sito di iniezione precisa non è stata descritta in quei fascicoli. Al contrario, le coordinate stereotassiche del sito di iniezione per inoculazione subarachnoidal intracranica chiaramente è stato descritto in un precedente studio17. Questo ha permesso il facile riconoscimento del punto di inoculazione e più semplicistico protocollo sperimentale. Inoltre, l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione imita ingresso batterica nel sistema nervoso centrale da seni o l' orecchio medio17e la relazione tra l'orecchio medio e la meningite causata da S. suis è stato dimostrato da Madsen et al.18. Inoltre, applicando l'itinerario subarachnoidal intracranica dell'infezione nei topi, abbiamo dimostrato che S. suis piccolo RNA rss04 contribuisce alla meningite nel nostro precedente studio10.

Nello studio presente, l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione è stato utilizzato nei topi per indagare i ruoli di biofilm in S. suis meningite. Topi sono stati infettati con cellule planctoniche o cellule stato biofilm di S. suis da questo itinerario dell'infezione. L'analisi istopatologica e aumentata espressione di mRNA di TLR2 e citochine dal tessuto di cervello di topi iniettati con le cellule di biofilm stato chiaramente indicato che il biofilm di S. suis contribuisce alla meningite.

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Protocollo

Gli esperimenti di infezione del mouse sono stati approvati dal laboratorio animale monitoraggio Comitato della provincia di Jiangsu, Cina ed eseguiti nel laboratorio animale Center of Nanjing Agricultural University (permesso numero: SYXK (Su): 2017-0007).

1. preparazione di batteri

Nota: Il ceppo virulento di S. suis sierotipo 2 P1/7 è stato isolato da un maiale malato con meningite19. Ceppo P1/7 è stato coltivato in brodo Todd-Hewitt (THB, formula per litro di THB: Heart Infusion, 3,1 g neopeptone, 20,0 g; destrosio, 2,0 g; cloruro di sodio, 2,0 g; fosfato disodico, 0,4 g; carbonato di sodio, 2,5 g) e placcato su Todd-Hewitt agar (THA, formula per litro di THA: Heart Infusion, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; destrosio, 2,0 g; cloruro di sodio, 2,0 g; disodio fosfato, 0,4 g; carbonato di sodio, 2,5 g; agar, 15,0 g) a 37 ° C e 5% CO2.

  1. Raccolta di ceppo cellule planctoniche P1/7
    1. Raccogliere 5 mL di cellule planctoniche da cultura Mid-registro fase (OD600= 0,6), centrifugare per 3 min a 8000 × g e poi lavare 3 volte con PBS.
    2. Risospendere le cellule con 5 mL di glicerolo al 25% in THB, aliquotare in 5 provette e quindi conservare a-80 ° C.
  2. Raccolta di ceppo cellule di stato biofilm P1/7
    1. Prendere 20 mL di una coltura durante la notte e aggiungere a 180 mL di THB fresco; dividere la cultura diluita in 10 piastre di coltura rotondo ugualmente e poi mettere le piastre in un incubatore a 37 ° C in 5% CO2 per 24 h.
    2. Dopo l'incubazione, agitare la piastra delicatamente per risospendere i batteri che non hanno aderito alla piastra e quindi eliminare il surnatante tramite aspirazione.
      Nota: Agitare la piastra delicatamente ed evitare risospendere il sedimento.
    3. Aggiungere 5 mL di PBS per raccogliere le cellule di stato del biofilm, risospendere il sedimento completamente e poi trasferire il campione ad un nuovo tubo.
    4. Sottoporre ad ultrasuoni le celle di stato di biofilm dall'ultimo passaggio con i seguenti parametri: 60 W, 4 cicli, 5 s s on e 10 off.
    5. Centrifugare per 3 min a 8000 × g e conservare il supernatante a-80 ° C.
      Nota: Il supernatante può contenere componenti di biofilm e può essere utilizzato per risospendere i biofilm di batteri prima dell'infezione come descritto negli esperimenti sugli animali (passaggio 3).
    6. Risospendere il sedimento con glicerolo 25% 10ml in THB e quindi memorizzare le celle di stato biofilm a-80 ° C.

2. scansione analisi di microscopia elettronica (SEM)

  1. Difficoltà il biofilm raccolti stato cellule e cellule planctoniche usando paraformaldeide al 4% per 12-24 h a 4 ° C.
  2. Sciacquare i campioni rapidamente con acqua distillata e disidratare i campioni in sequenza con una crescente concentrazione di etanolo (25%, 50%, 70%, 90% e 100%) per 30 min in ogni soluzione.
  3. Rispettare i campioni essiccati per titolari con nastro biadesivo in metallo e infine trattarle in un evaporatore con oro e Palladio.
  4. Osservare i campioni da un microscopio elettronico a scansione utilizzando i seguenti parametri: EHT (Extra alta tensione) = 10 kV; WD (distanza di lavoro) = 7.0 o 8.0 mm; Ingrandimento = 5000 ×; Segnale A = SE1.

3. animale esperimenti

  1. Utilizzare SPF 6-settimana-vecchi topi BALB/c femminili in questo studio. Infettare tutti i topi attraverso l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione cui sito di iniezione è situato 3,5 mm rostrale dal bregma. Le coordinate stereotassiche del sito di iniezione sono stati chiaramente descritti da Chiavolini et al17.
    1. Per l'analisi istopatologica, infettare due gruppi di topi (5 topi per gruppo) utilizzando cellule planctoniche o biofilm stato cellule ad una dose di 3 × 107 unità formanti colonie (CFU), e un altro 5 topi sono stati iniettati con PBS come controllo.
    2. Per la rilevazione dell'espressione del mRNA di TLR2 e citochine nel cervello, infettare altre due gruppi di topi (6 topi per ogni gruppo) utilizzando cellule planctoniche o biofilm stato cellule ad una dose di 3 × 107 CFU.
    3. Determinare il numero di batteri vitali di diluizioni seriali a THA di placcatura.
    4. Eutanasia tutti i topi a di post-infezione 12 h per ulteriori ricerche.
      Nota: Glicerolo a stock medio deve essere rimosso prima dell'infezione. Sia le cellule planctoniche e biofilm celle di state recuperate da-80 ° C vengono lavate 3 volte con PBS. Quindi, le cellule planctoniche sono risospese con PBS e diluite alla dose appropriata per l'infezione; biofilm stato cellule sono risospese con il surnatante stored (dal punto 1.2.5) e diluite alla dose appropriata per l'infezione. Il volume per l'infezione non dovrebbe essere più di 50 µ l.
  2. Rilevare l'espressione del mRNA di TLR2 e citochine nel tessuto cerebrale
    1. Estratto il RNA totale dal tessuto di cervello utilizzando un kit di estrazione di RNA.
      1. Per ogni mouse, è possibile utilizzare tessuto cerebrale tutta per l'estrazione di RNA. Dividere del tessuto di cervello intero in 5 provette. Prenda al tessuto cerebrale 100mg e aggiungere 1 mL di soluzione di lisi in ogni provetta contenente la matrice lisante fornita dal kit.
      2. Elaborare il tubo in un omogeneizzatore per 40 s con un'impostazione del 6.0 e poi Centrifugare la provetta a 12000 × g e 4 ° C per 5 min.
      3. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase superiore ad un nuovo tubo del microcentrifuge.
      4. Incubare il campione trasferito per 5 min a temperatura ambiente; aggiungere 300 µ l di cloroformio, vortexare per 10 s e poi incubare per 5 min a temperatura ambiente.
      5. Centrifugare la provetta a 12000 × g e 4 ° C per 5 min. trasferire la fase superiore ad un nuovo tubo.
      6. Aggiungere 500 µ l di etanolo assoluto freddo al tubo, prima di esso invertente per 5 volte e quindi conservare il campione a-20 ° C per almeno 1 h.
      7. Centrifugare la provetta a 12000 × g e 4 ° C per 15 min e rimuovere il surnatante. Lavare la pallina con 500 µ l di etanolo 75% freddo privo di RNasi H2O.
      8. Rimuovi l'etanolo, aria secca il pellet per 5 min a temperatura ambiente e risospendere il RNA in 100 µ l di RNAsi-libera H2O.
      9. Incubare il RNA per 5 min a temperatura ambiente e determinare la concentrazione di RNA con un RNA bioanalyzer.
    2. Eseguire sintesi di cDNA, compreso eliminazione del DNA genomico (gDNA), utilizzando un termociclatore con un kit di reagenti di trascrizione inversa (RT).
      1. Aggiungere 1 µ g di RNA da un tubo contenente 2 µ l di buffer di eliminazione 5 x gDNA, 1 µ l di enzima eliminazione gDNA e privo di RNasi H2O fino a quando il volume raggiunge 10 µ l. Incubare per 2 min a 42 ° C.
      2. Aggiungere 10 µ l di master mix (1 µ l di enzima RT mescolare I, 1 µ l di miscela di Primer RT, 4 µ l di tampone 2: 5x e 4 µ l di RNAsi-libera H2O) per la soluzione di reazione dall'ultimo passo e poi mescolare delicatamente. Procedere immediatamente con la reazione di RT: 37 ° C per 15 min e poi 85 ° C per 5 s.
      3. Eseguire l'analisi quantitativa di PCR (RT-qPCR) in tempo reale, utilizzando una macchina PCR Real-Time con un kit SYBR RT-qPCR. Aggiungere 10 µ l di enzima: 2x, 0,8 µ l di primer forward, 0,8 µ l di primer reverse, 0,4 µ l di 50 x ROX riferimento Dye II, 2 µ l di modello di cDNA e privo di RNasi H2O fino a un volume totale di 20 µ l.
      4. Eseguire ogni esempio in triplice copia utilizzando i seguenti parametri termici: 30 s a 94 ° C, seguiti da 40 cicli di 5 s a 95 ° C e 34 s a 60 ° C, con una fase finale di 15 s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C e 15 s a 95 ° C. Primer per RT-qPCR sono elencati nella tabella 1. Geni housekeeping B2m e 18s rRNA sono stati usati come controlli interni.
    3. Calcolare la variazione relativa piega sulla base del metodo 2-ΔΔCt .
  3. Osservazione delle sezioni istologiche
    1. Dopo la fissazione di 24h con formalina al 10%, è possibile ricostruire il tessuto cerebrale fisso in dimensioni appropriate di pezzi di tessuto a 2-3 mm.
    2. Mettere i pezzi di tessuto in una cassetta di incorporamento e immergere in una nuova soluzione fissante per disidratazione con un essiccatore di vuoto automatico.
    3. Estrarre il tessuto fisso e si disidratano in sequenza in aumento delle concentrazioni di etanolo (70%, 80%, 95%, 95% e 100%) per 30 min in ogni soluzione.
    4. Transparentize il campione con xilene per 15 min, immergerlo nel liquido paraffina a 60 ° C per 90 min e quindi incorporare utilizzando una macchina per l'incorporamento.
    5. Tagliare il tessuto di blocco incorporato di paraffina a fette di 3 µm, affianca la fetta sull'acqua a 45 ° C e poi asciugare all'aria.
    6. Incubare la sezione per 3 h a 60 ° C, macchia utilizzando il haematoxylin ed eosina (lui) metodo e sigillare con la gomma neutra.
    7. Osservare i cambiamenti istopatologici del cervello con un microscopio ottico. Un sistema di classificazione del quattro-punto è stato utilizzato per valutare i cambiamenti istologici. Utilizzare un test spaiato t per l'analisi statistica.
      Congestione/emorragia: assente, Punteggio 0; piccola area di congestione/emorragia focale, Punteggio 1; grande area di congestione/emorragia focale, o più siti di piccola zona di congestione/emorragia focale, Punteggio 2; fino a tre siti di grande congestione/emorragia focale, Punteggio 3; diffusa congestione/emorragia, Punteggio 4.
      Necrosi: assente, Punteggio 0; necrosi focale, Punteggio 1; diffusa presenza di cellule necrotiche 1-10, Punteggio 2; i fuochi di necrosi confluente, Punteggio 3; vasta necrosi confluente, Punteggio 4.
      L'infiltrazione delle cellule infiammatorie: assente, Punteggio 0; pochi e focale infiltrazioni, Punteggio 1; multifocale infiltrazione o infiltrazioni con formazione di aggregati, Punteggio 2; fino a tre aggregati, Punteggio 3; e più di quattro aggregati, Punteggio 4.

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Risultati

Analisi SEM è stato effettuato per esaminare la formazione di biofilm nelle circostanze sperimentali. Come illustrato nella Figura 1, c'è una differenza significativa nella formazione del biofilm tra cellule planctoniche (Figura 1A) e stato biofilm (Figura 1B). Analisi SEM ha mostrato che il biofilm batteri erano in ciuffi e più livelli e sono stati racchiusi nella m...

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Discussione

L'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione qui descritto ha ovvi vantaggi sopra altri itinerari dell'infezione. Esso consente ai ricercatori di studiare l'interazione ospite-batterio e l'effetto di componenti batteriche sulla risposta immune dell'ospite direttamente nel cervello, che mimano ingresso batterica nel sistema nervoso centrale. Così, questo itinerario dell'infezione può essere esteso per indagare i meccanismi della meningite causate da altri batteri. Inoltre, può anche essere utilizzato per tes...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina [2017YFD0500102]; la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina [31572544]; il laboratorio chiave dello stato di biologia eziologico veterinaria [SKLVEB2016KFKT005]; l'agricoltura di Shanghai applicato tecnologia sviluppo programma, Cina [G2016060201].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Todd Hewitt Brodo(THB)Becton, Dickinson and CompanyDF0492078Sciogliere 30 g di polvere in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min.
AgarDSBIO16C0050Sciogliere 15 g di polvere in 1 L di THB. Autoclave a 121 gradi per 15 min.
Sistema di purificazione dell'acqua di riferimento Milli-QMerck KGaAZ00QSVCUSsenza Dnasi/ Rnasi
NaClTianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd10019318Sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO3, 0,27 g di KH2PO4 in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min. Utilizzare KOH per regolare il pH a 7,4.
Na2HPO3Xilong Scientific Co., Ltd9009012-01-09Sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO3, 0,27 g di KH2PO4 in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min. Utilizzare KOH per regolare il pH a 7,4.
KClXilong Scientific Co., Ltd9009017-01-09Sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO3, 0,27 g di KH2PO4 in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min. Utilizzare KOH per regolare il pH a 7,4.
KH2PO4Xilong Scientific Co., Ltd9009019-01-09Sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO3, 0,27 g di KH2PO4 in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min. Utilizzare KOH per regolare il pH a 7,4.
KOHXilong Scientific Co., Ltd9009014-01-09Sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,42 g di Na2HPO3, 0,27 g di KH2PO4 in 1 L di acqua purificata. Autoclave a 121 gradi per 15 min. Utilizzare KOH per regolare il pH a 7,4.
GlycerolSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618Diluito con un volume uguale di acqua purificata, autoclave a 121 gradi per 15 min
4% di paraformaldeideSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd80096675
diluito 10 volte con acqua purificata per il fissaggio.
EtanoloSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
CloroformioSionpharm Chemical Reagent Co., Ltd10006818
SpctrophotometerDeNovix Inc.DS-11 +
Frantoio cellulare a ultrasuoniNingBo Scientz Biotechnology Co., LtdJY96-IIN
CentrifugaHitachi Koki Co., LtdCT15RE
FrigoriferoAucma Co., LtdDW-86L500
Microscopio elettronico a scansioneZeissEVO-LS10
FastRNA Pro Green KitMP Biomedicals# 6045-050
FastPrep-24 InstrumentMP Biomedicals116005500
Instrument per PCRSensoQuest GmbH1124310110
QuantStudio 6 FlexThermo Fisher Scientific4485689
SYBR Premix Ex Taq IITakara Biomedical Technology (Beijing) Co., LtdRR820A
Kit di reagenti PrimeScript RT con gommaper gDNATakara Biomedical Technology (Beijing) Co., LtdRR047A
Processatore di tessuti completamente chiusoLeica Biosystems Nussloch GmbHASP200S
Modulo di inclusione in paraffina riscaldataLeica Biosystems Nussloch GmbHEG1150H
Microtomo rotativo semiautomaticoLeica Biosystems Nussloch GmbHRM2245
Bagno d'acqua per sezioni di paraffinaLeica Biosystems Nussloch GmbHHI1210
Autostainer XLLeica Biosystems Nussloch GmbHST5010
Agilent 2100Agilent TechnologiesG2939A
Microscopio otticoOlympusBX51
25% Glutaraldehyde Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 30092436

Riferimenti

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