Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) da fibroblasti derivata pazienti di sindrome di Li-Fraumeni (LFS), differenziazione delle iPSCs tramite cellule staminali mesenchimali (MSCs) di osteoblasti e modellazione in vivo tumorigenesi utilizzando osteoblasti derivati paziente LFS.
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Articolo metodologico
Modellazione di Osteosarcoma con la sindrome di Li-Fraumeni paziente-derivato indotto Pluripotent Stem Cells
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sindrome di Li-Fraumeni (LFS) è un disordine ereditario dominante autosomal del cancro. I pazienti con LFS sono predisposti a un tipo di vari tumori, compreso osteosarcoma..--una delle malignità primaria non ematologica più frequente nell'infanzia e nell'adolescenza. Di conseguenza, LFS fornisce un modello ideale per studiare questa malignità. Approfittando delle metodologie iPSC, osteosarcoma LFS-collegato può essere modellato con successo differenziando LFS iPSCs paziente alle cellule staminali mesenchimali (MSCs) e quindi di osteoblasti, le cellule di origine per gli osteosarcomi. Questi osteoblasti LFS ricapitolano proprietà oncogeniche di osteosarcoma, fornendo un sistema di modello attraente per delineare la patogenesi di osteosarcoma. Questo manoscritto viene illustrato un protocollo per la generazione di iPSCs da fibroblasti pazienti di LFS, differenziazione delle iPSCs per MSCs, differenziazione di cellule staminali mesenchimali di osteoblasti e tumorigenesi in vivo utilizzando osteoblasti LFS. Questo modello di malattia di iPSC può essere esteso per identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici per LFS-collegati di osteosarcoma.
Introduzione
Tra il 2006 e 2007, parecchi risultati di svolta dai laboratori di DRS. Shinya Yamanaka e James A. Thomson ha condotto allo sviluppo di pluripotenti indotte (iPSCs) le cellule staminali1,2,3. Di riprogrammare le cellule somatiche con definiti fattori trascrizionali a forma iPSCs, i ricercatori sono stati in grado di generare cellule con caratteristiche chiave, vale a dire, pluripotenza e auto-rinnovamento, che era precedentemente pensato solo esistono in cellule staminali embrionali umane (hESC). iPSCs potrebbe essere generato da qualsiasi individuo o il paziente e non ha dov....
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Protocollo
Questo lavoro è stato approvato da The University of Texas Health Science Center a Houston (UTHealth) Animal Welfare Committee. Gli esperimenti vengono eseguiti in stretta conformità con le norme stabilite dal centro UTHealth per la medicina del laboratorio animale & cura (CLAMC) che è accreditato dall'associazione americana per laboratorio Animal Care (AAALAC International). I soggetti umani in questo studio rientrano Scenario un ("No Human Subjects Research"), come definito nella documentazione di NIH SF424. Pertanto, non ha bisogno di alcuna approvazione comitato etico di UTHealth ricerca umana.
1. generazione di LFS iPSCs (
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Risultati
Questo protocollo presenta le procedure incluse LFS iPSC generazione MSC differenziazione, differenziazione degli osteoblasti e in vivo nella tumorigenesi analisi usando osteoblasti LFS MSC-derivato.
Schema per la generazione di LFS iPSCs dai fibroblasti utilizzando un virus Sendai disponibile in commercio kit di riprogrammazione è mostrato in Figura 1A. Sendai virus-ha basato la consegna d.......
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Discussione
Per raggiungere una maggiore efficienza di differenziazione di MSC, alcuni aspetti sono fondamentali. Uno è la condizione di cultura di iPSCs prima dell'inizio della differenziazione di MSC. Il protocollo presentato nel manoscritto si basa su precedenti studi 9,17. iPSCs devono essere coltivate su MEFs per almeno 2 settimane. Mantenere iPSCs in buone condizioni su MEFs sono critiche per celle fissare la piastra rivestite con gelatina per il differenziamento di MS.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
R. Z. è supportato da UTHealth innovazione per cancro Prevenzione ricerca formazione programma corso Fellowship (prevenzione del cancro e Istituto di ricerca del Texas concedere RP160015). J.T. è supportato dal programma Ke Lin dell'Università ospedale affiliato prima di Sun Yat-sen. D.-F.L. è lo studioso CPRIT nella ricerca sul cancro e supportato da NIH via indipendenza Premio R00 CA181496 e CPRIT premio RR160019.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Plastic ware | |||
| 100 mm Piatto | Corning | 430107 | |
| 60 mm | Corning | 430166 | |
| Piastra a 6 pozzetti | Falcon | 353046 | |
| 12 pozzetti | 353043 | ||
| Falcon | 48 pozzetti | 353078 | |
| 1 mL Punta per pipetta | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µ L Punta per pipetta | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 & micro; L Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| Pipetta sierologica da 5 mL | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| Pipetta sierologica da 10 mL | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| Pipetta sierologica da 25 mL | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| Provetta da 50 mL, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| Provetta da 15 mL, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Materiali di coltura e reagenti | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Kit di riprogrammazione Sendai | Invitrogen | A16517 | Kit di riprogrammazione del virus Sendai commerciale |
| Corning hESC Matrice qualificata Corning 354277 | Matrice a membrana basale | ||
| CF1 MEF, irradiata | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV& | |
| alpha; MEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Siero di ricambio | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillina-Streptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Aminoacidi non essenziali | Corning | 25-025-CI | |
| Soluzione di L-glutammina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| FGF-basico umano (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| PDGF-AB UMANO RICOMBINANTE | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Desametasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Acido ascorbico | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Soluzione di passaggio StemMACS XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Soluzione di passaggio commerciale |
| Soluzione di distacco cellulare Accutatse | Corning | 25-058-CI | Soluzione di distacco cellulare |
| Tiazovivin (inibitore ROCK) | Calbiochem | 420220 | |
| Soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenasi, Tipo II | ThermoFisher | 17101015 | |
| R& Anticorpo umano NANOG | D System | AF1997 | |
| OCT4 Anticorpo (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Umano/Topo SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R& Sistema D | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Topo Anti-Umano TRA-1-81 Antigene | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Asino Anti-Capra IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Capra Anti-Coniglio IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Topo Anti-Umano CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Topo Anti-Umano CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Topo Anti-Umano CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Topo Anti-Umano CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Topo Anti-Umano CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Siero d'Asino | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Siero di capra | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Kit di colorazione con fosfatasi alcalina II | Stemgent | 00-0055 | |
| Rosso di alizarina S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Reagente TRIzol | ThermoFisher | 15596018 | |
| Cloroformio | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-propanolo | ThermoFisher | A416-4 | |
| Etanolo, assoluto, grado di biologia molecolare | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNasi I, privo di RNasi (1 U/µ L) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), senza fenolo | Corning | 354262 | |
| 1 mL Siringa con punta a slittamento, 26 gauge x 5/8 pollici | DB Biosciences | 309597 |
Riferimenti
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult h....
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Ristampe e permessi
