In questa ricerca, dimostriamo un metodo privo di etichetta del neutrofilo separazione da clinica delle secrezioni bronchiali mediante operazione di ciclo chiuso della microfluidica inerziale a spirale. Il metodo proposto sarebbe espandere i dosaggi clinici in vitro per varie malattie respiratorie.
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Articolo metodologico
Label-free del neutrofilo arricchimento da secrezione di paziente-derivato della via aerea utilizzando microfluidica inerziale Closed-loop
In questo articolo
Sommario
Abstract
Delle secrezioni bronchiali contengono un gran numero di cellule immuno-correlati, ad esempio, neutrofili, macrofagi e linfociti, utilizzabile come una risorsa importante per valutare una varietà di malattie polmonari, sia per scopi di ricerca e clinici. Tuttavia, a causa della natura eterogenea e viscosa del paziente muco, non c'è attualmente nessun metodo di dissociazione affidabile che non danneggia le cellule immuni ospite nella secrezione paziente delle vie respiratorie. In questa ricerca, vi presentiamo un metodo di preparazione del campione che utilizza microfluidica inerziale per la valutazione del sistema immunitario del paziente. Indipendentemente dalla proprietà fluidica eterogenee dei campioni clinici, il metodo proposto consente di recuperare oltre il 95% dei neutrofili da campioni di secrezione delle vie respiratorie che vengono diluiti 1.000 con millilitri di soluzione fisiologica pulito. Di ricircolo nel flusso di output concentrato al serbatoio del campione iniziale, un'alta concentrazione, il recupero e la purezza delle cellule immunitarie sono forniti; ricircolo è considerato un compromesso per l'operazione di basata su siringa di singolo conduzione della microfluidica inerziale. L'operazione di regolazione della spirale microfluidica fornisce leucociti senza disturbo fisico o chimico, come dimostrato da phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-indotto rilascio dell'elastasi dei neutrofili ordinati.
Introduzione
Poiché le celle sono incapsulate in una grande quantità di muco nelle secrezioni delle vie respiratorie, la valutazione funzionale dei leucociti mediante saggio in vitro è stata ostacolata. Ditiotreitolo (DTT) è il più comune buffer di lisi di dissociare e omogeneizzare l'espettorato per l'analisi citologica e rilevamento dei mediatori fornendo al contempo tollerabile attuabilità delle cellule isolate1,2. Tuttavia, DTT può interferire con gli antigeni di superficie associato dei neutrofili delle vie respiratorie, causando l'interruzione della funzione del neutrofilo ad esempio elastasi e mieloperossidasi (MPO) versione2,3. Pertanto, sono stati condotti pochi studi di funzione del neutrofilo umano della via aerea con neutrofili periferici di anima, che non possono rivelare le caratteristiche fisiologiche della polmonare4. Nel frattempo, microfluidica inerzia ha fatto progressi nell'isolare cellule da vari pazienti BIOMATRICI5,6. L'equilibrio tra le forze inerziali ascensore e Dean trascinamento consente di allineare la particella/cella in base alle loro dimensioni, che permette la separazione di particelle privo di etichetta7. Il nostro gruppo precedentemente introdotto un metodo di preparazione del campione per la circolazione del tumore le cellule8,9, agenti patogeni nel sangue8, cellule da una sospensione cultura10,11, 12ed i leucociti polimorfonucleari (PMNs) dal sangue13,14.
Qui, presentiamo un protocollo per preparare le cellule immuni dalle secrezioni delle vie aeree di un paziente con circuito chiuso inerziale microfluidica per un'analisi a valle in vitro , ad esempio, il saggio di elastasi del neutrofilo (NE). Questo metodo fornisce alta concentrazione e il recupero, soprattutto quando c'è una sovrapposizione significativa nella direzione laterale della cella/particella da cui la cellula/particelle di interesse deve essere rimosso, che è osservata comunemente in campioni clinici. Di ricircolo interno parete (IW)-messo a fuoco grandi particelle o cellule torna al tubo di campionamento, la particella o cella di interesse concentrati nel serbatoio originale, mentre fluidi di sfondo con aggregati di piccole mucina passano attraverso il serbatoio di scarico. Nonostante la proprietà fluidica eterogenee dei campioni clinici, il metodo proposto recupera costantemente superiore al 95% dei neutrofili da campioni di secrezione delle vie respiratorie che vengono diluiti 1.000 con una soluzione pulita Salina (~ 1 mL). Al contrario, il metodo di lisi presenta una vasta gamma di PMNs tassi di recupero a seconda delle condizioni del campione. Proposta di protocollo cattura leucociti in modo privo di etichetta senza nessun danno fisico o chimico, che fornisce la possibilità di raccogliere le cellule delicate da clinicamente impegnativo biometria con procedure mini-invasive.
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Protocollo
La raccolta del campione è stata approvata dall'Università di Pittsburgh Institutional Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Tutti gli esperimenti sono eseguiti sotto una cappa di biosicurezza con i dispositivi di protezione personale.
1. dispositivo fabbricazione e Litografia Soft
Nota: Litografia soft Standard tecniche15,16 sono stati utilizzati per creare il microchannel di polidimetilsilossano (PDMS).
- Mescolare il precursore PDMS in un rapporto di 10:1 di base e polimerizzazione di agente.
- Versare 30 g della miscela precursore PDMS sullo stampo in alluminio micro-lavorato (vedere la Figura 1 per le dimensioni) e 20 g della miscela precursore PDMS sul 100mm di Petri.
Nota: La capsula di Petri è utilizzato per rendere la pellicola spessa di PDMS (~ 3 mm) per strato di supporto. Strato di supporto di PDMS fornisce proprietà superficie fisica uniformi in tutta la microfluidica. In alternativa, può essere utilizzato un sottile film PDMS su vetrino. Lo stampo master con dimensioni canale specifico è stato progettato e fabbricato da micro-fresatura sul foglio di alluminio. Il canale spirale utilizzato in questo studio era un microchannel 8-anello a spirale con un ingresso e due uscite, con il raggio aumentando da 8 mm a 24 mm per la separazione efficiente basato su dimensioni. - Inserire lo stampo e la capsula di Petri in un essiccatore sotto vuoto per degassare fino a quando non ci sono bolle sono visibili sulla superficie, in genere 5-10 min uso casa-vuoto per un essiccatore.
- Rilasciare il vuoto e inserire lo stampo e la capsula di Petri in forno a 90 ° C per 1 h.
Nota: Una piastra riscaldante o altri strumenti di riscaldamento possono essere utilizzati invece di un forno. - Rimuovere la muffa e la capsula di Petri dal forno e lasciar raffreddare a temperatura ambiente per 10 min.
- Accuratamente tagliare il contorno e perforare i fori di accesso fluido sul dispositivo utilizzando un perforatore di 2 mm.
Nota: La dimensione del punzone può variare a seconda delle dimensioni della guida tubolare o fluida. - Aderire un nastro sul lato del canale del dispositivo e pellicola spessa di PDMS e sbucciare accuratamente con una pinza per rimuovere la polvere.
- Trattare entrambi i lati del canale del dispositivo e pianura PDMS con plasma ad aria e legame con strato di supporto preparato di pianura PDMS (Figura 1A).
- Posizionare il chip sul vetrino 50 x 70 mm e metterlo in forno a 70 ° C per almeno 30 min migliorare la forza di legame.
2. tracheale secrezione raccolta dai pazienti ventilati meccanicamente
Nota: Secrezioni tracheali possono essere ottenute da pazienti ventilati meccanicamente durante la cura normale routine delle vie respiratorie utilizzando un protocollo modificato rispetto ai metodi convenzionali per accogliere il paziente ventilato standard, adulto. I campioni sono stati de-identificati e inviati immediatamente per l'elaborazione.
- Se l'aspirazione trachea è indicato, è possibile utilizzare un catetere per estrarre delle secrezioni bronchiali.
- Far avanzare il catetere attentamente a metà strada nel tubo endotracheale e instillare 5 mL di soluzione salina normale sterile 0,9% da una siringa preriempita da 10 mL.
- Quando il catetere viene fatto avanzare completamente o si incontra resistenza, aspirare le secrezioni e raccogliere in un contenitore di raccolta dell'espettorato sterili.
- Raccogliere 10 mL di secrezioni tracheali in un contenitore sterile dell'espettorato e posizionarlo sul ghiaccio. Inviare campioni immediatamente per l'elaborazione.
3. preparazione del campione tracheale secrezione
Nota: Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti sotto una cappa di biosicurezza con i dispositivi di protezione personale.
- Disperdere 1ml di campioni di secrezione delle vie respiratorie in 9 mL di tampone fosfato salino (PBS) utilizzando una siringa di plastica da 10 mL (per una diluizione di 10 x). Utilizzare una pipetta smussata per omogeneizzare il campione di muco.
- Ceppo il diluente con un colino di cella di nylon 40 µm per rimuovere grandi blocchi o coaguli di sangue, che possono bloccare il foro di accesso di microfluidica o il canale. Posizionare il campione sul ghiaccio dopo l'elaborazione.
- Disperdere il diluente di ciascun campione utilizzando un volume di 100 x di tampone PBS, risultante in un 1.000 x sospensione diluita. Posizionare il campione sul ghiaccio durante l'operazione di dissociazione intero.
4. organizzazione sperimentale
Nota: Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti sotto una cappa di biosicurezza con i dispositivi di protezione personale.
- Assemblare il PDMS chip con la guida fluida da applicare flusso uniforme a ciascuno dei microcanali quattro spirale (Figura 1B).
Nota: I quattro canali sono stati utilizzati per aumentare il throughput di parallelizzazione, nonché ottimizzazione della densità delle cellule e del volume della sospensione risultante. La guida fluida è progettata e realizzata con una stampante 3D del tipo di stereolitografia con resina trasparente. L'ingresso e la porta di uscita della guida fluida utilizzare connettori Luer femmina per facilità di connessione e stabile tenuta durante l'operazione. - Collegare un connettore Luer maschio da 1/16 pollici per l'ingresso e la presa di parete interna (IW) porta di uscita del muro esterno (OW) della guida fluida e un tubo in silicone per la sospensione del campione.
- Inserire le punte smussate a ciascuna estremità dell'ingresso e uscite per raggiungere il fondo del serbatoio del campione.
- Collegare la pompa peristaltica con il tubo di aspirazione.
- Posizionare l'estremità della tubazione di aspirazione e tubo di uscita di IW nel serbatoio del campione e posizionare l'estremità del tubo di uscita di OW nel serbatoio dei rifiuti (Figura 1, D).
- Posizionare il tubo da 50 mL di filtrato PBS senza calcio e magnesio al serbatoio del campione.
- Inizi a pompare ad un tasso di flusso debole (~ 1 mL/min) per innescare il dispositivo.
Nota: Quando bolle vengono catturate nel canale, spingere la parte superiore del canale con la pinzetta per destabilizzare ed eliminare bolle d'aria. Quando il dispositivo è completamente riempito con soluzione tampone, sostituire il tubo di PBS per preparare la provetta del campione di secrezione delle vie respiratorie. - Quando il campione è posto nel serbatoio del campione, accendere la pompa peristaltica e impostare la velocità di flusso a 4 mL/min (Figura 1, D).
- Quando il volume del campione raggiunge il volume designato (~ 1 mL), spegnere l'apparecchio e scollegare la tubazione del silicone.
Nota: Il metodo proposto è più efficiente a ridurre un grande volume di diluente (> 50 mL) in un volume di micro-provetta (~ 1 mL) (Figura 2).
5. analisi di citometria a flusso di
Nota: Per confrontare i metodi di dissociazione (microfluidica e Lisi), citometria a flusso con immunofluorescenza è stato utilizzato.
- Aggiungere isotiocianato di fluorescina (FITC) - anticorpo monoclonale di topo coniugato anti-umano CD66b e allophycocyanin (APC) - mouse anti-CD45 anticorpo monoclonale umano alle sospensioni iniziale (punto 3.3) e sospensioni risultante (passo 4.9) (200 µ l di coniugato di ciascun anticorpo) nel rapporto di 01:25 v/v.
- Incubare i campioni a 4 ° C al buio per 30 min.
- Analizzare entrambi i campioni su un citometro a flusso per quantificare il PMNs.
Nota: La popolazione che è positiva doppia FITC-APC, CD45 e CD66b positivo era considerata neutrofili. Recupero è stato calcolato dal rapporto tra il numero totale delle cellule dell'input e la sospensione risultante.
6. NE rilascio analisi
Nota: Per confrontare le funzionalità dell'isolato del neutrofilo dal metodo microfluidica e Lisi, un kit di test NE è stato utilizzato.
- Aggiungere PMA (fornito nel kit di dosaggio) per ogni sospensione risultante (ottenuta al punto 4.9) ad una concentrazione finale di 50 nM.
- Incubare i campioni a 37 ° C per 2 h.
- Centrifugare le sospensioni a 300 x g per 10 min.
- Trasferire 10 µ l di ciascun supernatante a una piastra a 96 pozzetti (fornita nel kit di dosaggio).
Nota: Una micropiastra da 96 pozzetti con fondo piatto e polistirolo nero può essere utilizzata come bene. - Aggiungere 90 µ l di tampone diluito (fornito nel kit di dosaggio) in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 10 µ l del substrato dell'elastasi (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, fornito nel kit di dosaggio).
- Incubare per 1,5 h a 37 ° C.
- Leggere la piastra a 96 pozzetti utilizzando un fluorometro ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 525 nm.
Nota: Il livello di NE era diviso per il numero PMN dall'analisi di citometria a flusso.
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Risultati
Abbiamo raggiunto trasparente cellula immunitaria sospensioni con entrambi dissociazione di mucolysis e microfluidica DTT (Figura 3A). Dissociazione di microfluidica raccolti in media 4,40 x 105 PMNs (2.1 x 104 a 5.60 x 105 PMNs, n = 6) dalle vie respiratorie secrezione campioni diluiti 1.000 (volume totale di 50 mL) in 1 mL di sospensione pulito. Rispetto per il DILUENTE iniziale, PMNs 94,0% (CD66b+/CD45+
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Discussione
In inerziale microfluidica, particelle e cellule localizzano in una certa posizione laterale in un micro-canale basato sul loro formato5,18,19,20. Dovuto all'effetto combinato del decano trascina la forza e la forza inerziale ascensore nel microchannel curvo, particelle di grandi dimensioni o i neutrofili (> 10 µm) sono situati all'interno del canale e piccole particelle, aggregati di muco e de...
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Dichiarazioni
Gli autori hanno presentato una domanda di brevetto sulla tecnologia descritta qui.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH/NIAID (R21AI119042) così come il programma di dosaggio NIH U24 campione con parsimonia (U24-AI118656).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Precursore PDMS | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3,9 KG | 10:1 rapporto tra base e agente indurente |
| VWR forno a convezione per gravità VWR | 414005-128 | Precursore PDMS da polimerizzare a 90 gradi. | |
| Piastra di Petri da 100 mm | VWR | 89000-324 | Fabbricazione di PDMS Strato di supporto |
| Harris Uni-core Puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2 mm di diametro o altro a seconda delle dimensioni del tubo |
| Macchina al plasma ad aria | Femto Science | Cute | Trattamento al plasma superficiale per il dispositivo PDMS alla base inferiore. |
| Scivolo in vetro da 2" x 3" | TED PELLA, INC. | 2195 | Per supportare il dispositivo PDMS |
| Tubo in silicone polimerizzato al platino Masterflex, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubo per microfluidica e pompa peristlatica |
| Connettore Luer da 1/16 di pollice, | apparecchio Harvard | PC2 72-1443 | Connettore per guida fluida |
| Tubo Falcon da 50 ml | Raccolta e preparazione | ||
| del campione Corning 21008-940Soluzione salina tamponata con fosfato, 1X senza calcio e magnesio | Corning | 45000-446 | Soluzione tampone per diluire il campione |
| Catetere di aspirazione chiuso Halyard, gomito, canale 14F/ 4,67 mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Catetere di aspirazione per seceazione tracheale |
| 0,9% Sterile Soluzione salina normale, siringa preriempita da 10 ml | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | Per la raccolta della seceazione tracheale dai pazienti |
| SecurTainer™ III Contenitori per campioni, 20 ml | Simport | 1176R36 | Contenitore sterile per la raccolta dell'espettorato (secrezione delle vie aeree) |
| Siringa con punta Luer-Lok, 10 ml | di BD309604 BD | Per pipettare, omogeneizzare il campione di muco e raggiungere il fondo della provetta del campione | |
| BD Ago di riempimento smussato, con BD Luer-Lok Punta: | BD | Per pipettare, omogeneizzare il campione di muco e raggiungere il fondo della provetta del campione | |
| 40µ m filtro cellulare in nylon | Falcon | 21008-949 | Per rimuovere grossi pezzi o coaguli di sangue, che possono ostruire il foro di accesso microfluidico o il canale. |
| Pompa peristaltica (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | funzionamento di microfluidics |
| Citometro a flusso BD LSR II BD | Bioscience | Citometro a flusso LSR II | Quantificazione del rapporto di recupero cellulare |
| Anticorpo monoclonale CD66b coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) | BD Bioscience | 561927 | Immunocolorazione dei neutrofili per l'analisi del citometro a flusso |
| Anticorpo monoclonale CD45 anti-umano coniugato con alloficocianina (APC) | BD Bioscience | 561864 | Immunocolorazione dei neutrofili per l'analisi del citometro a flusso |
| Lettore di piastre | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Lettore di piastre per il test dell'elastasi dei neutrofili, ex485/em525 |
| Kit per il test dell'elastasi dei neutrofili | Cayman Chemical | 600610 | Valutazione della funzionalità dei neutrofili |
| Microsfere YG di fluoresbrite 10.0µ m | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Particelle fluorescenti per esprimere la traiettoria dei globuli bianchi in microfluidica |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
