La prova di infezione di pianta: Spray e ferita-mediata di inoculazione con la pianta patogeno Magnaporthe Grisea

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per testare la virulenza della pianta con la pianta patogeno Magnaporthe grisea. Questa relazione contribuirà alla proiezione su grande scala di patotipi di funghi isolati e servire come un ottimo punto di partenza per la comprensione dei meccanismi resistenti delle piante durante l'allevamento molecolare.

Abstract

Piante possiedono un potente sistema per difendersi contro le minacce potenziali dei funghi patogeni. Per piante sul piano agricolo importanti, tuttavia, attuali misure di lotta contro tali agenti patogeni hanno dimostrato troppo conservatore e, quindi, non sufficientemente efficaci e possono potenzialmente rappresentare rischi ambientali. Pertanto, è estremamente necessario identificare i fattori di resistenza ospite per assistere nel controllo malattie delle piante naturalmente attraverso l'identificazione di germoplasma resistente, l'isolamento e caratterizzazione di geni di resistenza e l'allevamento molecolare di cultivar resistenti. A questo proposito, c'è bisogno di stabilire un metodo di inoculazione accurata, rapida e su larga scala per allevare e sviluppare i geni di resistenza della pianta. Il riso blast agente patogeno fungoso Magnaporthe grisea cause sintomi di grave malattia e le perdite di rendimento. Recentemente, M. grisea è emerso come organismo modello per lo studio dei meccanismi delle interazioni pianta-fungo patogeno. Quindi, segnaliamo lo sviluppo di un metodo di test di virulenza di pianta che è specifico per M. grisea. Questo metodo fornisce per inoculazione di spruzzo con una sospensione conidial e ferendo inoculazione con cubetti di micelio o goccioline di conidial sospensione. Il passaggio chiave del metodo ferentesi inoculazione per foglie di riso indipendente è di rendere le ferite sulle foglie delle piante, che evita qualsiasi interferenza causata da resistenza di penetrazione ospite. Questo spray/ferendo protocollo contribuisce per lo screening rapido, accurato e su larga scala di patotipi degli isolati di M. grisea . Questo integrato e metodo di infezione sistematica impianto servirà come punto di partenza eccellente per ottenere una prospettiva ampia di problemi in patologia vegetale.

Introduzione

Esplosione di riso, causata da M. grisea, è una delle malattie più gravi per riso varietà in tutto il mondo^1,2. Il processo mediante il quale M. grisea infetta piante ospiti comprende una produzione di conidi e collegamento di superficie, una germinazione di conidi e appressorium formazione, una formazione del peg di penetrazione e differenziazione di IFA infettiva, e una malattia diffusa ³. tutte queste fasi sono comuni in molti altri funghi patogeni vegetali e, infatti, un blocco di ogni singola fase previene l'infezione delle piante ospiti. Grazie alla sua importanza economica e trattabilità genetica, M. grisea è emerso come organismo modello per lo studio dei meccanismi delle interazioni pianta-fungo patogeno^1,4. Pertanto, studiare la base molecolare di questi stadi di sviluppo in M. grisea contribuirà a delucidare i meccanismi molecolari sottostanti fungine patogenicità e l'identificazione di geni bersaglio candidato per lo screening e il romanzo di progettazione fungicidi⁵.

Recenti rapporti riguardo M. grisea infezione si sono concentrati sui meccanismi molecolari delle fasi pre-penetrazione, soprattutto il conidiation, la formazione di appressorium, i pioli di penetrazione e la crescita infettive^{3, 6}. Pertanto, è essenziale per sviluppare un protocollo dettagliato per eseguire il test M. grisea infezione. Qui, presentiamo un metodo dettagliato per un test di infezione che utilizza l'analisi di un'infezione dello spruzzo-mediata con una sospensione conidial e l'inoculazione delle ferite con spine miceliale di M. grisea. In questo rapporto, il protocollo si concentra sulla cultura dei ceppi, la preparazione della soluzione conidiation per la spruzzatura e l'inoculazione micelio spina-mediata delle piante con M. grisea. Questi passaggi vengono descritti in dettaglio qui di seguito e una vista schematica che mostra l'intero flusso di lavoro del metodo e una lesione tipica sono riportati nelle figure 1 e 2, rispettivamente.

Protocollo

1. spray inoculazione con una sospensione di M. grisea conidi

1. Coltura fungosa per M.grisea
   1. Preparare il terreno di coltura agar (OTA) pomodoro fiocchi d'avena per ceppi fungini.
   2. Pesare 30-50 g di farina d'avena, aggiungere questo a 800 mL di acqua distillata/deionizzata (ddH₂O) e far bollire per 30 min in pentola elettrica.
   3. Filtrare il succo bollito farina d'avena nel becher attraverso un pezzo di garza.
   4. Aggiungere 150 mL di succo di pomodoro e 20 g di agar per il filtrato nel becher e aggiungere ddH₂O fino a 1.000 mL.
2. Preparazione di materiali sperimentali
   1. Mettere a bagno circa 50 semi di cultivar di riso (Oryza sativa) Lijiangxintuan-heigu (LTH), ddH₂O per 3 d o immergere circa 50 semi di orzo (Hordeum vulgare cv Golden Promise) ddH₂O per circa 1 d.
   2. Avvolgono i semi di riso o di orzo in garza umida e li germinare su carta umida filtro in circa 30 capsule di Petri con un diametro di 10 cm x 10 cm a 28 ° C. Il tempo di germinazione del seme di riso è circa 2-3 d, il tempo di germinazione del seme di orzo è circa 2 d. L'umidità relativa nella serra è circa il 70%.
   3. Piantare le piantine di riso o di orzo in vaso utilizzando il terreno di impregnazione in autoclave e irrigazione e poi coprirli con uno strato di vermiculite.
   4. Collocare le piante in una serra adatto o crescita armadio a 25 ° C per circa 1 ~ 2 settimane.
   5. Tagliare 3 strati di carta da filtro nei circoli con forbici chirurgiche sterili (ogni cerchio dovrebbe avere un diametro di 8 cm) e metterli su piatti di plastica sterile di 100 mm.
   6. Aggiungere ddH₂O ad ogni piatto in ammollo la carta da filtro.
   7. Assicurarsi che la carta da filtro è completamente bagnata, ma non aggiungere acqua supplementare.
   8. Rimuovere l'acqua in eccesso con una pompa a vuoto.
   9. Foglie di Place 2 stuzzicadenti sterili nella piastra di coltura per supportare il riso e orzo; spazio gli stuzzicadenti ~ 2-3 cm di distanza.
   10. Raccogliere le foglie del riso 2 settimane dopo la semina i semi o prendere le foglie dell'orzo 7D dopo la semina i semi.
   11. Utilizzando 4 - 6 foglia piantine di riso e orzo, tagliare la parte inferiore del gambo a ~ 5 cm dall'alto e raccogliere le foglie.
3. Protocollo di inoculazione di spruzzo
   1. Il ceppo fungo sulle piastre di OTA in un Incubatore termostatico (25 ° C) per ~ 4 d della coltura.
   2. Aggiungere mL ~ 2 di ddH₂O utilizzando un 0,5 - pipetta da 5 mL per ogni piatto 4-giorno-vecchio.
   3. Con un ciclo di inoculazione, raschiare il micelio del ceppo di selvaggio-tipo di M. grisea e il ceppo mutante in detriti dei miceli.
   4. Raccogliere i detriti di Miceli e trasferirlo in una nuova piastra OTA. Prendere i detriti di Miceli e colpo secco nel banco pulito.
   5. Coprire la piastra con 3 strati di garza per assicurare l'umidità necessaria per la crescita di conidi in una serra a 25 ° C nel corso della giornata (14 h) e 23 ° C nella notte (10 h) per 24-48 h.
   6. Aggiungere 2 mL di ddH₂O ad ogni piatto e raschiare delicatamente i conidi con tamponi di cotone sterile, seguiti da una filtrazione attraverso 2 strati di carta per lenti. Fare attenzione a non graffiare la superficie del terreno di coltura.
   7. Trasferire la sospensione di conidi in una nuova provetta da 50 mL con una pipetta di 100-1.000 µ l.
   8. Centrifugare per 5 minuti, a un minimo di 5.000 x g e a 25 ° C.
   9. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet per dare 2 x 10⁴ conidi / mL in un 0.025% soluzione di Tween-20 (v/v). La soluzione di Tween-20 è di solito circa 10-20 mL.
   10. Versare la sospensione di spore in uno spruzzatore portatile.
   11. Spay circa 10 mL della sospensione conidial sulle foglie delle piantine di riso 2-settimana-vecchio o orzo riso foglie delle piantine d'orzo 7-giorno-vecchio e li Incubare a 25 ° C in una camera buia, umida per ~ 24 h. Spray le piante di controllo con 0.025% soluzione di Tween-20 (v/v).
   12. Trasferire le foglie in un'altra camera umida sotto una luce fluorescente a 25 ° C per un fotoperiodo di 12 h.
   13. Registrare i sintomi di malattia a 5 d dopo l'inoculazione. Esaminare le lame di riso e orzo malato di ~ 6 cm di lunghezza. La valutazione standard è secondo il sistema di punteggio per resistenza all'esplosione dell'International Rice Research Institute (IRRI). I dettagli del sistema di punteggio per resistenza all'esplosione sono riportati nella tabella 1.
   14. Fotografare le foglie per valutare l'infezione dei ceppi testati. L'infezione è stata valutata dal numero di lesioni per 3,6 cm².

2. ferendo l'inoculazione con cubetti di micelio o goccioline di Conidial sospensione di M. grisea

1. Utilizzando un ago anatomico, raschiare tre ferite lunghe 2-3 cm in vene principali di fogli staccati riso e orzo; fare attenzione a non per penetrare le foglie.
2. Mettere le foglie raschiate su stuzzicadenti e spruzzare un 0,02% Tween-20 soluzione sulle foglie per formare uno strato di goccioline (v/v).
3. Tagliare una spina miceliari 0,5 x 0,5 cm per ogni ceppo di M. grisea (ceppi wild-type e mutanti, complemento, o altri ceppi di prova) da una piastra OTA.
4. Mettere i tappi miceliari o 25 µ l gocce di sospensione conidial sui feriti lascia e incubare le foglie a 25 ° C in una camera umida per 3-8 d.
5. Esaminare le lesioni al post-inoculazione d 5-7. Il metodo di esame è lo stesso come è stato per il metodo di inoculazione di spray (Vedi punto 1.3.13).
6. Esaminare le lame di riso e orzo malato di ~ 6 cm di lunghezza e fotografarli per valutare l'infezione dei ceppi testati. L'infezione è stata valutata dal numero di lesioni per 3,6 cm².

Risultati

L'intero flusso di lavoro per la tecnica è illustrata nella Figura 1. I dosaggi di infezione della pianta sono stati effettuati su semenzali del riso suscettibili 14-giorno-vecchio (o. sativa cv CO-39) o suscettibile 7-giorno-vecchio orzo lascia (H. vulgare cv Golden Promise)^7,8,9. Per verificare un'infezione sulle foglie di riso, una sospensione co...

Discussione

Geni di resistenza di malattia pianta svolgono un ruolo essenziale nella prevenzione delle infezioni da agenti patogeni, tra cui funghi patogeni^1,12. Esplosione di riso è stato utilizzato come modello per comprendere la natura delle strutture di popolazione dell'agente patogeno e per identificare geni della pianta resistenza⁴. Pertanto, è necessario esaminare il genotipo di resistenza di malattia e genotipi di avirulenza delle principali v...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Carta da filtro	marchio GE Healthcare (Svezia)
Provetta da 50 mL	CORNING(Amercia)	430290
Centrifuga	Eppendorf(Amercia)	5804R
Piatto di coltura	Thermofisher(Amercia)	150326
Pipetta da 0,5-5 mL	Eppendorf
Pipetta 100-1000uL	Eppendorf	4920000083
Pompa a vuoto	Leybold	D25B
Ago di dissezione	FST	26000-35
Incubatore	MEMMERT	PYX313
Anello di inoculazione	Greiner Bio One	731175

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