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Articolo metodologico

Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

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⸱

DOI:

10.3791/57685

⸱

7 giugno 2018

 ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Baylor College of Medicine, 2Interdepartmental Graduate Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l'analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.

Abstract

Microambiente tumorale immuni (tempo) recentemente è stato riconosciuto come un mediatore critico di risposta al trattamento nei tumori solidi, soprattutto per le immunoterapie. Recenti progressi clinici nell'immunoterapia evidenziano l'esigenza di metodi riproducibili caratterizzare accuratamente e completamente il tumore e suoi associati si infiltrano in immuni. Digestione enzimatica del tumore e l'analisi cytometric di flusso permettono ampia caratterizzazione di numerosi sottoinsiemi delle cellule immuni e fenotipi; Tuttavia, profondità di analisi è spesso limitata dalla fluoroforo restrizioni sul design del pannello e la necessità di acquisire campioni di grande tumore di osservare rari popolazioni immuni di interesse. Così, abbiamo sviluppato un metodo efficace e ad alta produttività per la separazione e arricchendo l'infiltrato immune tumore dai componenti del tumore non immune. La digestione di tumore descritto e separazione centrifuga basati su densità tecnica permette separato caratterizzazione del tumore e tumore immuni si infiltra in frazioni e preserva la vitalità cellulare e quindi, fornisce un'ampia caratterizzazione del tumore stato immunologico. Questo metodo è stato usato per caratterizzare la vasta eterogeneità immuni spaziale nei tumori solidi, che dimostra ulteriormente la necessità di tecniche di analisi immunologiche coerente intero tumore. Nel complesso, questo metodo fornisce una tecnica efficace ed adattabile per la caratterizzazione immunologica dei tumori murini solidi sottocutanei; come tale, questo strumento può essere utilizzato per caratterizzare meglio le caratteristiche immunologiche tumorale e nella valutazione preclinica di nuove strategie immunoterapeutiche.

Introduzione

Il tempo soppressivo recentemente è stato riconosciuto come un marchio di garanzia di cancro ed è conosciuto per svolgere un ruolo significativo nello sviluppo, progressione e nella protezione dei cancri solidi del tumore così come mitigare la loro suscettibilità all'immunoterapia1. Il tempo è composto di numerosi cellulari sottoinsiemi e fenotipi, che forniscono approfondimenti critici dello stato immunologico del tumore. Questi sottoinsiemi immunologici possono essere ulteriormente stratificati nelle cellule del linfocita o origine mieloide, che insieme costituiscono la maggior parte della risposta immunitaria innata e adattativa2,3. I recenti progressi nel campo dell'immunoterapia del cancro hanno dimostrato che strategie di immunoterapia (cioè, gli inibitori di checkpoint immuni, recettore chimerico antigene T-cellule, ecc.) hanno il potenziale di indurre cancro durevole regressioni; Tuttavia, rimangono relativamente inefficace nel tumore solido cancri4,5. Numerosi gruppi hanno mostrato la transenna critica che il tempo può svolgere il trattamento successo6,7, e così, ci rimane la necessità di valutare con precisione le nuove immunoterapie in ambito pre-clinico, occupandosi in particolare del loro capacità di modulare o superare il tempo8.

Gli sforzi attuali per caratterizzare il tempo in genere utilizzano entrambi microscopia o flusso cytometry insieme strategie per identificare immuni cellulari sottoinsiemi e loro caratteristiche9,10di contrassegno dell'anticorpo. Queste due strategie forniscono informazioni in modo univoco diverse, come la microscopia permette spaziale apprezzamento dei sottoinsiemi cellulare e citometria a flusso fornisce throughput elevato e più ampia quantificazione dei cambiamenti cellulari. Nonostante i recenti miglioramenti in immunoistochimica multisala fluorescente l'ottimizzazione di sistemi di imaging spettrale, che ora possono supportare fino a 7 parametri, dimensioni pannello limitato rendono vasto livello immunitario profilatura difficile e così questa tecnica è spesso riservati per più concentrata di analisi. Di conseguenza, citometria a flusso rimane uno del sistema immunitario più ampiamente usato tecniche di profilatura. Nonostante il suo uso diffuso nella caratterizzazione di tempo, i metodi utilizzati per la lavorazione e colorazione sono molto variabili. Più spesso protocolli utilizzano un tumore dissociando enzima (cioè, collagenasi, DNasi, ecc.) e metodi di dissociazione manuale per raggiungere sospensioni unicellulari, seguita da anticorpo che macchia e analisi7. Nonostante i vantaggi di ciascun metodo, numerosi gruppi hanno dimostrato la notevole variabilità che può essere indotta attraverso queste tecniche11. Questo rende la croce-Studio comparazioni di profilatura di microambiente del tumore estremamente difficile, anche quando valutare lo stesso modello di tumore murino. Inoltre, questi metodi forniscono un potenziale limitato per valutare il tumore cellulare e immunitaria tumore infiltrarsi componenti in modo indipendente, dal momento che entrambi i componenti sono sparpagliati dopo la digestione. Quantità di campione limita quindi multi-pannello di colorazione e di analisi, che diventa un grosso problema durante il tentativo di caratterizzare sottoinsiemi immunologiche rare (cioè, tumore-specifiche cellule T)12. Tecniche più recenti come massa cytometry, o citometria a tempo di volo (CyTOF), permettono di alto-dimensionali analisi fenotipica di sottopopolazioni cellulari con alcuni sistemi di supporto disegni pannello superiore a 42 parametri indipendenti13. Nonostante l'enorme potenza di tecnologia CyTOF in profilatura immuni, resta limitato a causa di spese, competenze di analisi e l'accesso all'apparecchiatura. Inoltre, molti protocolli di CyTOF consiglia di purificazione dei sottoinsiemi immuni per migliorare i rapporti segnale-rumore14, e quindi suggeriamo che il nostro metodo di arricchimento poteva essere utilizzato a monte dell'analisi CyTOF per migliorare la qualità dei dati.

Qui descriviamo una digestione microambiente del tumore e analisi metodo che incorpora immunitaria tumore infiltrarsi separazione. Lo scopo di questo metodo è quello di consentire indipendente high throughput profilatura del si infiltra in sistema immunitario in tumore e frazioni cellulari del tumore per la più ampia caratterizzazione del microambiente tumorale. Utilizzando questo metodo, noi dimostrare ulteriormente l'importanza di eseguire analisi di intero tumore, come un modello di tumore solido sottocutaneo è stato trovato per avere significativa eterogeneità spaziale immunologica. Nel complesso, questo metodo può più accuratamente e costantemente confrontare tra campioni perché arricchisce per sottoinsiemi immuni cellulari all'interno del tumore e permette per la profilatura indipendente delle cellule del tumore e frazioni immunitarie di un tumore.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine.

1. digestione e raccolto tumore

Nota: Il tempo richiesto per il raccolto è ~ 3-5 min/tumore e il tempo necessario per l'elaborazione è ~ 1 h + 2-3 min/tumore.

  1. Eutanasia di topi per inalazione di anidride carbonica e spray ogni mouse giù con etanolo al 70% prima della raccolta per evitare la contaminazione di capelli. Chirurgicamente rimuovere tumori sottocutanei dai topi e garantire che i tumori sono privi di qualsiasi tessuto contaminante (cioè, capelli, pelle, peritoneo, ecc.). Posizionare ogni tumore in 1,8 mL di base RPMI-1640 media senza siero bovino fetale (FBS) in una piastra a 24 pozzetti. Per raccolti più abbondanti, mantenere piastre fredde sul ghiaccio per preservare la vitalità cellulare.
    Nota: Se è richiesta la sterilità, necessario essere eseguita in una cappa di biosicurezza con strumenti chirurgici sterili (cioè, forbici, pinze, ecc.), come pure qualsiasi ulteriore procedura tutte le dissezioni di tumore. I tumori con il diametro più lungo tra 0,5 - 1 cm sono ottimali, e tumori maggiori o minori richiederanno ridimensionamento dei reagenti.
  2. Usare le forbici per tagliare i tumori in meno di 1 mm3 pezzi all'interno di ciascun pozzetto.
  3. Preparate un 10 x cocktail di digestione sciogliendo collagenosi sono a 10 mg/mL, collagenasi IV a 2.500 U/mL e dnasi I a 200 U/mL in base RPMI-1640 media (senza FBS).
    Nota: La digestione cocktail può essere preparata un giorno in anticipo e conservata a-20 ° C; Tuttavia, una conservazione prolungata non è raccomandata come enzimi perderà l'attività nel corso del tempo una volta sciolto.
  4. Aggiungere 200 µ l di 10 x cocktail di dissociazione contenente collagenasi I, IV collagenosi e dnasi I per ciascun pozzetto con il mm 13 pezzi.
  5. Consentire ai campioni di digerire per 1h a 37 ° C agitando leggermente a 60-100 rpm usando un agitatore orbitale.
    Nota: L'elevazione della temperatura a 37 ° C durante la digestione enzimatica può causare l'attivazione delle cellule immuni.
  6. Dopo 1 h, neutralizzare la reazione aggiungendo 1 mL di terreno RPMI-1640 completati con 5% FBS e 2 mM EDTA in ciascun pozzetto.
  7. In un colino di cella di 40 µm seduto sulla cima di un tubo di centrifuga da 50 mL, pipettare la digestione di tumore e i restanti pezzi di tumore.
    Nota: Tagliare la punta al largo di punta di una pipetta da 1 mL per il trasferimento più facile della digestione tumore al filtro.
  8. Utilizzare un pistone della siringa da 10 mL per disaggregare meccanicamente i pezzi del tumore attraverso il colino. Sciacquare periodicamente il filtro con 2 mL di completati RPMI-1640 media (contenente 5% FBS) e ripetere fino a quando il filtro cella è chiaro del tumore.
    Nota: 4-10 mL circa di media totale dovrebbe essere sufficiente adeguatamente sciacquare il filtro del tumore.
    Nota: Posizionare il campione sul ghiaccio fino al completamento di questo passaggio per tutti i campioni preservare la vitalità cellulare.
  9. Regolare ogni 50 mL provetta dello stesso volume utilizzando il supporto di RPMI-1640 completato.
    Nota: La regolazione del volume è fondamentale per il bilanciamento della centrifuga. Saltare questo passaggio potrebbe provocare lesioni personali o danni della centrifuga.
  10. Centrifugare le sospensioni delle cellule (5 min, 805 x g, 4 ° C), eliminare i sovranatante e risospendere in 2 mL di completati RPMI-1640 media.
    Nota: Un aggregato di cellule può formare dopo la centrifugazione che è difficile risospendere. Utilizzare una pipetta sierologica da 5 mL e mescolare velocemente per rompere in su prima di procedere.

2. separazione delle frazioni cellulari del tumore e immunitario

Nota: Il tempo necessario per questo passaggio è circa 1 h.

  1. Aggiungere 3 mL di terreno di gradienti di densità sul fondo di una provetta da centrifuga da 15 mL. Preparare ed etichettare il numero necessario di provette per ogni tumore.
  2. Strato da 2 mL di sospensione cellulare del tumore in cima il mezzo di gradienti di densità pipettando lentamente lungo il lato del tubo per evitare la miscelazione dei due strati.
  3. Posizionare i tubi a più livelli nella centrifuga e spin per 20 min a 805 x g, 20 ° C, con freno non.
    Nota: È estremamente importante verificare il corretto bilanciamento e assicurarsi che nessun freno viene utilizzato durante la centrifugazione. Qualsiasi interruzione di questo processo si tradurrà in strato di miscelazione e il recupero completo del campione sarà difficile.
  4. Trasferire con cautela il tumore infiltrante del leucocita (TIL) strato e lo strato superiore media ad un nuovo tubo da 15 mL utilizzando una pipetta di trasferimento. Eliminare tutti i rimanenti densità gradiente terreno e risospendere il pellet di tumore nella parte inferiore del tubo in 2 mL di RPMI-1640 completati.
    Nota: Dopo la centrifugazione ci saranno quattro livelli visibili dall'alto verso il basso che corrispondono rispettivamente a: media, TILs, densità gradiente medio e pellet cellulare del tumore. Vedere la Figura 2A per un esempio dei vari strati.
  5. Centrifugare l'entrambi TIL e campioni di tumore in separano tubi (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il surnatante.
  6. Risospendere il campione TIL in 200 µ l e il pellet di tumore in 2 mL di completati RPMI-1640 media. Tenere sul ghiaccio per preservare la vitalità.

3. placcatura e colorazione

Nota: Il tempo richiesto per la placcatura è 30 s/tumore; il tempo richiesto per la marcatura di superficie è 1h; il tempo necessario per la colorazione intracellulare è 40 min; il tempo necessario per l'analisi di citometria a flusso è 1 - 4 min/tumore.

  1. Preparare e conta di targhetta di identificazione un fondo U 96 pozzetti per ogni immunitario macchiatura pannello e una targhetta supplementare per cella.
    Nota: In genere, tre piatti sono preparati in totale: un concentrato del linfocita pannello piatto, un piatto di pannello mieloide-messa a fuoco e un piatto di conteggio delle cellule.
  2. Aliquotare le sospensioni unicellulari in ciascuna della colorazione pannello piastre e un volume impostato nella piastra del conteggio.
    Nota: La piastra di conteggio viene utilizzata per calcolare il numero totale di celle aggiunte ad ogni pannello di colorazione, consentendo in tal modo i conteggi delle cellule accurata della popolazione. Un citometro a flusso con capacità di campionamento e analisi volumetrica di piastra a 96 pozzetti può fornire il numero di cellule per µ l di ciascun campione e quindi, calcolare il numero di celle aggiunte ad ogni pannello di colorazione. Piastre di conteggio possono essere acquistati il giorno seguente dopo la fissazione durante la notte a 4 ° C, risciacquo con buffer di FACs (tampone fosfato salino (PBS) con 2% FBS) e risospendere in un volume di tampone di FACs.
  3. Lavare le cellule due volte con 200 µ l di soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) per campione di centrifugazione (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il supernatante tra ogni risciacquo per rimuovere qualsiasi FBS gratis.
  4. Aggiungere 50 µ l di blocco Fc, mescolare i campioni utilizzando una pipetta multicanale e incubare per 20 min a 4 ° C.
  5. Aggiungere 50 µ l di 2x concentrato anticorpo targeting extracellulare e attuabilità risolvibile macchia miscela, mescolare utilizzando una pipetta multicanale ed incubare per 30 min al buio a RT o 4 ° C.
    Nota: Le esatte condizioni che macchia per l'anticorpo dipendono le istruzioni del produttore. Tutte le diluizioni di colorazione devono essere in DPBS, con nessun FBS aggiunto per evitare la saturazione della tintura attuabilità risolvibile. Si prega di consultare la Tabella dei materiali/attrezzature per le diluizioni ottimale del pannello di colorazione utilizzata in questo manoscritto. Dell'anticorpo e risolvibile vitalità colorazione soluzione è preparato ad una concentrazione di 2 x per fornire un finale 1 x colorazione concentrazione in 100 µ l di volume totale colorazione quando aggiunto al blocco Fc.
  6. Lavare i campioni due volte con tampone di FACs centrifugazione (5 min, 805 x g, 4 ° C) ed eliminando i surnatanti tra ogni risciacquo.
  7. Risospendere in 200 µ l di soluzione di fissazione/permeabilizzazione 1x e incubare per una notte a 4 ° C al riparo dalla luce.
    Nota: L'esperimento può essere messo in pausa durante la notte a questo punto: conservare i campioni a 4 ° C al riparo dalla luce.
  8. Il giorno seguente, centrifugare le piastre (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il surnatante.
  9. Sciacquare una volta con 200 µ l di tampone di permeabilizzazione, centrifugare (5 min, 805 x g, 4 ° C), 1x e scartare il surnatante.
  10. Aggiungere 100 µ l di 1 pannello colorazione x anticorpo intracellulare concentrato preparato in tampone di permeabilizzazione 1x e incubare per 30 min al buio a RT o a 4 ° C (questo dipende dalla colorazione consigli dal produttore).
  11. Sciacquare una volta con permeabilizzazione 1x buffer (5 min, 805 x g, 4 ° C), scartare il surnatante e risciacquare una seconda volta con buffer di FACs (PBS con 2% FBS).
  12. Risospendere i campioni a 300 µ l di tampone di FACs (PBS con 2% FBS), trasferire i campioni a tubi di flusso cytometry ed eseguire analisi di citometria a flusso.

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Risultati

I nostri risultati dimostrano il beneficio significativo di TIL separazione da componenti del tumore non immune, come spiegato nel protocollo. Inoltre, utilizzando il metodo descritto dimostriamo la significativa eterogeneità immunologica dei tumori solidi stabiliti.

Un problema significativo con molte tecniche di dissociazione del tumore è la perdita di vitalità del campione, più spesso a causa delle condizioni difficili digest...

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Discussione

Il tempo è composto di molecole e componenti cellulari diversi e complessi. La prova recente suggerisce che accurata caratterizzazione di questo ambiente in grado di fornire una migliore comprensione del trattamento esito positivo o negativo e può anche aiutare a identificare i meccanismi di resistenza terapeutica. Ad esempio, aumentando i livelli di intratumoral di varie cellule immunosoppressive (cioè, MDSC, cellule T regolatorie, ecc.) possa attenuare le risposte immunitarie effettrici ed abrogare ef...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

JMN riconosce sostegno finanziario dal National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) e dal National Institute of Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) entrambi i National Institutes of Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Questo progetto è stato supportato anche dalla citometria e nucleo di ordinamento delle cellule presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti dal NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 e S10 RR024574) e l'assistenza di esperti di Joel M. Sederstrom.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 12 settimaneJackson Laboratory N/ATopi utilizzati nei nostri studi sui tumori
Linea cellulare di cancro singenico murino MEERAcquisita dal collaboratore N/AE6/E7 Linea cellulare di carcinoma epiteliale tonsillare murino che esprime l'antigene HPV 
Alcool isopropilico al 70% EMD Milipore PX1840
Kit di strumenti chirurgici muriniPrecision InstrumentsMOUSEKITPrincipalmente ha bisogno solo di forbici, pinzette e bisturi.
Piastra a 24 pozzetti Denville Scientific Inc.T1024O qualsiasi piastra a fondo piatto a 24 pozzetti.
RPMI-1640 mediaSigma-AldrichR0883
Collagenasi I EMD Milipore234153
Collagenasi IVWorthington Biochemical CorporationLS004189
DNasi I Sigma-Aldrich11284932001
agitatore orbitale a bassa velocitàBioExpress (fornitore: Genemate) S-3200-LSO qualsiasi agitatore orbitale.
Incubatore termoregolatoreFisher Scientific13-255-27O qualsiasi altro incubatore termoregolato
FBSSigma-AldrichF8192
EDTAAMRESCOE177
1 mL Pipetta e puntaliEppendorf13-690-032O qualsiasi altra pipetta e puntali
40 um Filtri cellulariFisher Scientific22363547
Provette da centrifuga da 50 mlDenville Scientific Inc.C1062-P
Provette coniche da 15 mLDenville Scientific Inc.C1012
Siringa Luer-Lok da 10 mL senza aghiBD309604
Lymphoprep Densità Gradiente MedioSTEMCELL Technologies7811
Pipette di trasferimentoDenville Scientific Inc.P7212
Piastre con fondo a U a 96 pozzetti,Denville Scientific, Inc.
DPBSSigma Aldrich D8573
Set di tamponi di colorazione del fattore di trascrizione FoxP3ThermoFisher Scientific00-5523-00Tampone di Fissazione/Permeabilizzazione e Tampone di Permeabilizzazione
CentrifugaTermoregolata Eppendorf Citometro a flusso 5810 R
Attune NxTThermoFisher ScientificN/APer il conteggio volumetrico di cellule a 96 pozzetti 
Ratto purificato anti-topo CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)  Clone 2.4G2 ThermoFisher Scientific553141Fc Block
LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte blu fissabile, per eccitazione UVThermoFisher ScientificL34962colorazione di vitalità fissabile
(30-F11), APC-eFluor 780ThermoFisher Scientific47-0451-80
TCR beta anticorpo monoclonale (H57-597), APCThermoFisher Scientific17-5961-82
CD8-&alfa; Anticorpo (KT15), PESanta Cruz Biotechnologysc-53473 
Anticorpo monoclonale CD4 (GK1.5), PE-Cianina5ThermoFisher Scientific15-0041-81
MHC Classe II (I-A/I-E) Anticorpo monoclonale (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700ThermoFisher Scientific56-5321-82
Anticorpo monoclonale CD11c (N418), PE-Cianina5ThermoFisher Scientific15-0114-82
F4/80 Anticorpo monoclonale (BM8), eFluor 450Anticorpo48-4801-80
CD11b (M1/70), APCThermoFisher Scientific17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) anticorpo monoclonale (RB6-8C5), PEThermoFisher Scientific12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) anticorpo monoclonale (MIH5), PE-cianina 7ThermoFisher Scientific25-5982-80
Anticorpo monoclonale CD273 (B7-DC) (122), Anticorpo monoclonale PerCP-eFluor 710ThermoFisher Scientific46-9972-82
Ki-67 (B56), BV711BD Biosciences563755
World Anticorpo monoclonale CD45 con monoclonale ThermoFisher Scientific

Riferimenti

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