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Articolo metodologico

Generazione del primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane

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⸱

DOI:

10.3791/57688

⸱

19 giugno 2018

 ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Department of Bioengineering, University of California at San Diego

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un metodo scalabile, usando una semplice combinazione di activina A e Id1-sovraespressione di lentivirus-mediata, per generare il primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane.

Abstract

La generazione di grandi quantità di funzionale pluripotenti umane derivate da cellule staminali cardiache progenitori e cardiomiociti di origine campo definito cuore è un pre-requisito per la modellazione di malattia e di terapie basate su cellule cardiache. Abbiamo recentemente dimostrato che i geni di Id sono necessario e sufficiente per specificare i primi progenitori di campo cuore durante lo sviluppo dei vertebrati. Questo protocollo di differenziazione sfrutta questi risultati e utilizza Id1 sovraespressione in combinazione con activina A come potente specificando spunti per produrre prima dei progenitori (FHF-L) campo-come di cuore. D'importanza, progenitori risultanti differenziano in modo efficiente (~ 70 – 90%) in cardiomiociti ventricolari-come. Qui descriviamo un metodo dettagliato per 1) generare Id1-overexpressing hPSCs e 2) differenziare scalabile quantitativi di cryopreservable FHF-L progenitori e ventricolare-come cardiomiociti.

Introduzione

Produzione su larga scala di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs)-derivati progenitori cardiaci e nei cardiomyocytes è un pre-requisito per terapie basate sulle cellule staminali1, modellazione2,3 e la caratterizzazione rapida di malattia nuove vie che regolano il differenziamento cardiaco4,5,6 e fisiologia7,8. Sebbene un certo numero di studi9,10,11,12,13,14,15 precedentemente sono descritti altamente efficiente protocolli di differenziazione cardiache da hPSCs, nessuno ha affrontato l'origine del campo di cuore di cardiomiociti risultanti, nonostante l'identificazione delle differenze significative molecolare tra sinistra (primo campo del cuore) e destra (secondo campo del cuore) cardiomyocytes ventricolari16 e l'esistenza di malattie di cuore congenite cuore specifici del settore; cioè, cuore sinistro ipoplasico sindrome17 o aritmogena displasia ventricolare destra18. Così, la generazione dei progenitori cardiaci e cardiomiociti di origine campo cuore definito da hPSCs sta diventando una necessità al fine di aumentare la loro rilevanza come terapeutico e malattia strumenti di modellazione.

Questo protocollo si basa sulla sovraespressione costitutiva di Id1, recentemente identificato5 primo cuore campo specificando spunto che in combinazione con activina A, è necessario e sufficiente per avviare cardiogenesis in hPSCs. In particolare, Cunningham et al. (2017) 5 Visualizza che indotta da Id1 progenitori express specificamente primo campo del cuore (HCN4, TBX5) ma non secondo marcatori di campo di cuore (SIX2, ISL1) come subiscono differenziazione cardiaca. Inoltre, gli autori mostrano anche che gli embrioni di topo transgenico manca l'intera famiglia di Id dei geni (Id1-4), sviluppare senza formare prima cuore campo cardiaco dei progenitori, mentre più mediale e posteriore progenitori cardiaci ( secondo campo del cuore) può ancora formare, suggerendo così che Id proteine sono essenziali per avviare primo cuore cardiogenesis campo in vivo. Convenientemente, progenitori Id1-indotta possono essere crioconservati e spontaneamente differenziare in cardiomiociti visualizzazione ventricolare-come le caratteristiche, compreso l'espressione di marcatori specifici ventricolare (IRX4, MYL2) e ventricolare-come i potenziali di azione.

Qui descriviamo un metodo semplice e scalabile per generare il primo cuore campo-come (FHF-L) cardiaci progenitori e ventricolare-come cardiomiociti da hPSCs overesprimenti Id1. Una caratteristica importante di questo protocollo è la possibilità di disaccoppiare la generazione di cellule progenitrici cardiache da produzione del cardiomyocyte successive utilizzando un passaggio di crioconservazione conveniente. In sintesi, questo protocollo vengono illustrate le operazioni necessarie (1) generare Id1-overexpressing hPSCs, (2) generare progenitori cardiaci FHF-L da hPSCs, (3) crioconservare progenitori risultanti, e (4) riprendere la differenziazione di cellule progenitrici cardiache FHF-L e generare altamente arricchito (> 70 – 90%) battendo ventricolare-come cardiomiociti.

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Protocollo

1. infezione e preparazione di Virus Id1

  1. Generare il lentivirus overesprimenti Id1 co-trasfettando pCMVDR8.74, pMD2.G e pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: plasmide #107735) nelle cellule HEK293T. Raccogliere le particelle virali, filtrato, purificare dal surnatante e conservare a-80 ° C come Kitamura et al. (2003) 19. in alternativa, produrre Id1 lentivirus commercialmente inviando pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR a un fornitore di produttori di lentivirus.
    Attenzione: Si prega di seguire norme di sicurezza lentivirali e protocolli standard di funzionamento.
    Nota: Importante: titolo del virus ottimale dovrebbe essere almeno 108 109 Transducing unità/mL (TU/mL).
  2. Prima dell'infezione, cappotto un pozzetto di una piastra ben 96 con 50 µ l di reagente di rivestimento, in genere una miscela di proteine gelatinosa secreta dalle cellule di sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm (Vedi Tabella materiali).
  3. Dissociare un pozzetto di cellule staminali pluripotenti coltivate in un piatto ben 6 aggiungendo 1 mL di PBS senza Ca2 + e Mg2 + e con 0,5 mM EDTA.
    Nota: Tempo di dissociazione varia da 3 – 10 min. Quando più dell'80% delle cellule sono staccate dal fondo della piastra, procedere al passaggio successivo.
  4. Raccogliere sospensione cellulare con pipetta sterile in provetta plastica centrifuga da 15 mL.
  5. Neutralizzare il reagente di dissociazione con 5 mL di PBS contenente Ca2 + e Mg2 +.
  6. Cellule di pellet per centrifugazione (200 x g per 3 min).
  7. Rimuovere il surnatante e flick delicatamente il tubo per sloggiare il pellet.
  8. Risospendere le cellule in 1 mL di media delle cellule staminali.
  9. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato seguendo le istruzioni del fornitore.
  10. Cellule vitali piastra 20.000 per rivestito di pozzo (piastra a 96 pozzetti) in 50 µ l di cellule staminali media completati con inibitore di via di 2 µM RHO/ROCK (Vedi tabelle 1 e 2).
  11. Dopo 24 h, monitorare per adesione cellulare e sostituire il supporto con 100 µ l della cellula formativa media completati con 2 inibitore di via di µM RHO/ROCK e 6 ng/mL di bromuro di hexadimethrine (Vedi tabelle 1 e 2), uno h prima dell'infezione lentivirale.
    Nota: Le cellule dovrebbero essere ben fissate alla parte inferiore della piastra.
  12. Scongelare Id1-lentivirus su ghiaccio.
  13. 3 µ l di lentivirus purificato per pozzetto (titolo del virus dovrebbe essere tra 108 109 TU/mL) e poi trasferire la placca incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2, 20% O2).
  14. infezione post-virale 24h, aggiungere 100 µ l di media fresco delle cellule staminali in cellule infettate.
  15. infezione post-lentivirali di 48h, Sostituisci virus contenente file multimediali con 200 µ l di cellule staminali fresche media completati con 1 con puromicina µ g/mL.
  16. Aggiornamento media al giorno con 200 µ l di cellule staminali media completati con 1 con puromicina µ g/mL.
  17. Quando culture raggiungono 80% confluency, dissociare le cellule utilizzando 200 µ l di PBS senza Ca2 + e Mg2 + + 0,5 mM EDTA (per un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti).
  18. Raccolta di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga.
  19. Neutralizzare il reagente di dissociazione con 5 mL di PBS contenente Ca2 + e Mg2 +.
  20. Cellule di pellet per centrifugazione (200 x g per 3 min).
  21. Rimuovere il surnatante e flick delicatamente il tubo per sloggiare il pellet.
  22. Risospendere le cellule in 1 mL di cellule staminali media completati con inibitore di via di 2 µM RHO/ROCK.
  23. Trasferire tutte le celle (1 mL) di un bene di una piastra 12-pozzetti rivestiti.
  24. Dopo 24 h, monitor per il collegamento delle cellule ai media bene e sostituire con 1 mL di cellule staminali media completati con inibitore di via di RHO/ROCK 2 µM e bromuro di hexadimethrine 6 ng/mL, una h prima della trasduzione.
  25. Scongelare Id1-lentivirus su ghiaccio.
  26. Aggiungere 5 µ l di virus purificato per pozzetto (12-pozzetti).
  27. infezione post-lentivirali di 24 h, Sostituisci virus contenente media con 1 mL di cellule staminali fresche media completati con 3 con puromicina µ g/mL.
  28. 48h post infezione lentivirale, sostituire virus contenente media con 1 mL di cellule staminali fresche media completati con 6 con puromicina µ g/mL.
  29. Quando culture raggiungono 80% confluency, dissociare le cellule con 500 µ l di PBS senza Ca2 + e Mg2 + e con 0,5 mM EDTA (per un pozzetto di una piastra 12-pozzetti).
  30. Trasferire la metà (250 µ l) della sospensione cellulare in un pozzetto di un reagente di rivestimento rivestito piastra a 6 pozzetti contenenti 2 mL di cellule staminali media completati con inibitore di via di 2 µM RHO/ROCK.
  31. Utilizzare l'altra metà (250 µ l) del campione per l'estrazione di RNA e qRT-PCR al fine di determinare lentivirali-mediata Id1 i livelli di espressione, come Colas et al. (2012) 4.
    Nota: Importante: se i livelli di espressione di mRNA Id1 sono inferiori a 0,005 piega dei livelli di espressione di GAPDH (vedere tabella 3 per primer qRT-PCR), ripetere il processo di infezione come descritto sopra, fino a quando i livelli di espressione di Id1 superano il soglia.

2. hPSCsId1 manutenzione

  1. Cultura hPSCsId1 a 6 pozzetti-piastre e crescere in 3 mL per pozzetto di cellule staminali media completati con 6 con puromicina µ g/mL.
  2. Quando hPSCsId1 raggiunge 80% confluency, cellule di passaggio come aggregati (rapporto di divisione 1:6) utilizzando il reagente privo di enzima dissociazione seguendo linee guida fornitore e crescere in 3 mL per pozzetto di cellule staminali media completati con 6 con puromicina µ g/mL.

3. preparazione di hPSCsId1 per differenziazione

  1. Ricoprire una piastra 12-pozzetti con 500 µ l di reagente di rivestimento.
  2. Quando hPSCsId1 raggiungere 90% confluency dissociare le cellule aggiungendo 1 mL di PBS senza Ca2 + e Mg2 + e con 0,5 mM EDTA per pozzetto per 5 – 10 minuti controllare il processo di dissociazione ogni minuto, e una volta 80% delle cellule sono dissociate dalla piastra , procedere al passaggio successivo.
  3. Raccolta di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga.
  4. Neutralizzare il reagente di dissociazione con 5 mL di PBS contenente Ca2 + e Mg2 +.
  5. Cellule di pellet per centrifugazione (200 x g per 3 min).
  6. Rimuovere il surnatante e flick delicatamente il tubo per sloggiare il pellet.
  7. Risospendere le cellule in 2 mL di cellule staminali media completati con inibitore di via di 2 µM RHO/ROCK.
  8. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
  9. Cellule di piastra 300.000 per pozzetto in 1 mL di cellule staminali media supplementato con inibitore di via di 2 µM RHO/ROCK con puromicina. 6 µ g/mL e piastra di trasferimento incubatore di coltura del tessuto.
  10. Aggiornamento media giornalmente con 2 mL di cellule staminali media completati con 6 con puromicina µ g/mL, fino a raggiungono culture confluency di 90%. A questo punto, avviare differenziazione cardiaca (passo successivo).

4. differenziazione di hPSCsId1 in primo cuore campo-come progenitori cardiaci (FHF-L CPs)

  1. Per il formato 12-pozzetti, avvia differenziazione (giorno 0) sostituendo media delle cellule staminali con 1,5 mL di terreno di induzione (tabella 1) completati con activina A (100 ng/mL) (Vedi tabella 2 per consigliato volumi e activina A concentrazioni per piastra diversi formati).
  2. Il giorno 1 (24 h dopo l'inizio del differenziamento), sostituire il supporto con 2 mL di media di induzione senza activina A (per pozzetto di una piastra 12-pozzetti).
  3. Il giorno 3, sostituzione supporti con 2 mL di media di induzione senza activina A (per pozzetto di una piastra 12-pozzetti).
  4. Il giorno 5, raccogliere FHF-L CPs per la crioconservazione (passo successivo).
    Nota: Importante: crioconservazione è preferito a questo punto, in quanto consente di sganciare la generazione di cellule progenitrici cardiache da successive del cardiomyocyte produzione e biobanca grandi lotti di cellule. Nota che in alternativa, giorno 5 CPs FHF-L può essere passato a un piatto appena rivestito per continuare la differenziazione, fare riferimento ai punti 5.1-5.5 a CPs passFHF-L e quindi procedere a passo 6.5 per differenziazione.

5. Crioconservazione di FHF-L CPs

  1. Aspirare tutti i media da pozzetti contenenti giorno 5 CPs FHF-L e rapidamente aggiungere 1 mL di caldo (37 ° C) 1 x contenenti enzimi reagente di dissociazione (Vedi Tabella materiali). Posizionare la piastra nell'incubatore coltura del tessuto.
  2. Dopo 1 min, agitare la piastra lateralmente nell'incubatrice.
  3. Dopo 2 minuti (tempo totale), rimuovere la piastra dall'incubatrice e aggiungere 1 mL di media di 10% FBS.
  4. Delicatamente dispensare le celle su e giù con una pipetta da 5 mL per facilitare il distacco delle cellule dalla piastra.
  5. Raccogliere la sospensione cellulare delle cellule del tubo e della pallina una centrifuga mediante centrifugazione a 200 x g per 3 min
  6. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di reagente di crioconservazione.
  7. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
  8. Aggiungere il reagente di crioconservazione (Vedi Tabella materiali) ad un volume sufficiente di crioconservare celle a concentrazione desiderata (in genere 5-10 x 106 cellule/mL).
  9. Trasferire le cellule a fiale di crioconservazione e posizionare fiale nel dispositivo (1 ° C/min) di raffreddamento e posizionare il dispositivo di raffreddamento in congelatore a-80 ° C durante la notte.
  10. Dopo 24 h, trasferire flaconcini congelati in azoto liquido per stoccaggio a lungo termine.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

6. FHF-L CP differenziazione in cardiomiociti ventricolari-come

  1. Trasferimento fiale FHF-L CPs congelati giorno 5 da deposito di azoto liquido nel contenitore di ghiaccio secco.
  2. Posizionare le fiale in bagnomaria a 37 ° C per 2 o 3 min, fino a sospensione cellulare è sciolto completamente.
    Nota: Importante: il processo di scongelamento è tempo-sensibile. Esponendo le cellule ai media crioconservazione per una quantità eccessiva di tempo (cioè, 10 min) farà diminuire la vitalità cellulare.
  3. Trasferire le cellule a 15 o 50 mL Centrifuga tubo, a seconda del numero di flaconcini scongelati.
  4. Versare goccia a goccia (5 gocce ogni 30 secondi) pre-riscaldata (37 ° C) cardiogeno media (tabella 1) alla soluzione di cella. Continuare questo processo fino a una media di crioconservazione di 1:3: rapporto media cardiogeno è raggiunto. A questo punto, aumentare il tasso di aggiunta di supporti cardiogeno fino a 01:10 media di crioconservazione: cardiogeno media rapporto è raggiunto.
    Nota: Importante: variazioni di osmolarità rapido aumenterà la morte delle cellule durante il processo di scongelamento; Pertanto, aggiunta goccia a goccia di cardiogeno media come descritto sopra è altamente raccomandato.
  5. Centrifugare a pellet e sospensione delle cellule mediante centrifugazione (200 x g per 3 min).
  6. Rimuovere il surnatante e delicatamente flick provetta da centrifuga per sloggiare il pellet cellulare.
  7. Risospendere le cellule con media cardiogeno completati con inibitore di via di 2 µM RHO/ROCK.
    Nota: La vitalità cellulare può variare da disgelo al disgelo e, in generale, > 65% redditività predice l'efficienza buona placcatura.
  8. Diluire concentrato sospensione cellulare con media cardiogeno completati con inibitore di via di 2 µM RHO/ROCK per ottenere la concentrazione di cella desiderata per la placcatura (Vedi tabella 2 per piastra diversi formati).
    Nota: Importante: si noti che l'efficienza cardiaca differenziazione può diminuire se le cellule sono seminate troppo scarsamente.
  9. Cellule di seme sulla piastra.
  10. Tenere la piastra nella coltura del tessuto cappa per 20 min prima di trasferirlo a incubatore di coltura del tessuto.
  11. Il giorno 6 di differenziazione, controllare il collegamento delle cellule.
    Nota: Progenitori cardiaci sono crioconservati il giorno 5 della differenziazione. 24 h dopo lo scongelamento le cellule sarebbe il giorno 6 della differenziazione.
    Nota: La presenza di cellule (morte) galleggiante è comune.
  12. Il giorno 7, aspirare il 50% dei mezzi di comunicazione e sostituire con una pari quantità di fresco cardiogeno media.
    Nota: L'aggiunta di inibitore di via di RHO/ROCK ai media cardiogeno non è necessaria dopo questo punto.
  13. Sostituire il 50% dei mezzi di comunicazione con i media cardiogeno ogni altro giorno.
  14. Nota battendo spontanea che viene visualizzata tra 11 e 13 giorno.
  15. Il giorno 15, quantificare l'efficienza cardiaca differenziazione dall'immunofluorescenza usando DAPI (macchia di nucleo) e gene: ACTC1 (marcatore pan-cardiaco).

7. l'approvazione e la manutenzione di cardiomiociti ventricolari-come

Nota: Di giorno 14 – 16, un monostrato di contrarre spontaneamente cardiomyocytes ventricolari-come dovrebbe essere ottenuto. A questo punto, si suggerisce di dissociare e ri-piastra cardiomyocytes al fine di omogeneizzare la cultura e impedire alle cellule di scollegamento dalla piastra.

  1. Aspirare tutti i media da pozzi e rapidamente aggiungere 1 mL di pre-riscaldata (37 ° C) 1 x contenenti enzimi reagente di dissociazione.
    Nota: 1 x enzima contenente volumi di reagente di dissociazione variano a seconda del formato del piatto, ma deve coprire completamente la parte inferiore della superficie del bene.
  2. Piatto del trasferimento in un incubatore di coltura del tessuto.
  3. Scuotere delicatamente piastra lato ogni 2 min all'interno dell'incubatrice per accelerare il processo di distacco.
  4. Dopo 5 – 15 min, quando 80% al 100% delle cellule sono staccato dal fondo della piastra, rimuovere la piastra dall'incubatrice e inibire enzimi contenenti attività di reagente di dissociazione: 1x aggiungendo un volume uguale di media di 10% FBS.
    Nota: Il tempo di incubazione con dissociazione di enzima-contenente 1 x per questo processo varia da lotto a lotto.
  5. Raccogliere sospensione cellulare in una provetta per centrifuga.
  6. Mescolare la sospensione cellulare con pipetta e conteggio celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
  7. Diluire la sospensione cellulare alla concentrazione di cella desiderata (Vedi tabella 2 per piastra diversi formati) con mezzi di manutenzione completati con inibitore di via di 2 µM RHO/ROCK.
  8. Dopo la semina cardiomyocytes sulla piastra, distribuire uniformemente le cellule e permettono alle cellule di fissare per 10 – 20 min prima del trasferimento della piastra a incubatore di coltura del tessuto.
  9. 24 h dopo ri-placcatura, monitorare il recupero e collegamento delle cellule.
    Nota: La presenza di cellule (morte) galleggiante è comune. 48 – 72 h dopo ri-placcatura, cardiomyocyte dovrebbe riprendere la contrazione spontanea.
  10. Per mantenere la cultura dei cardiomiociti, sostituire il 50% dei mezzi di comunicazione con mezzi di manutenzione ogni altro giorno fino all'utilizzo di cardiomiociti ventricolari-come per esperimenti successivi.

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Risultati

Generazione di hPSCs ID1 linee
hPSCs sono infettati con un lentivirus che mediano la sovraespressione Id1 (Figura 1A). Una volta che vengono generati hPSCId1 , espressione del transgene è quantificata mediante qRT-PCR (Figura 1B). Solo le lineeId1 hPSC esprimendo Id1 mRNA a livelli superiori a 0,005 pi...

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Discussione

Per successo differenziazioni, assicurarsi di seguire attentamente le istruzioni elencate sopra. Inoltre, qui si evidenziano i parametri chiave che influenzano fortemente i risultati di differenziazione. Prima di iniziare una differenziazione, dovrebbero essere osservati i seguenti tre parametri morfologici: una morfologia di staminali di hPSCsId1, un'ad alta compattazione cellulare e una confluenza alta (> 90%) della cultura al giorno 0. A tale proposito, meglio si creano condizioni di differenziazione ottima...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del laboratorio Colas per utili discussioni e recensioni critiche del manoscritto. Questo studio è stato sostenuto dalla NIH/NIEHS R44ES023521-02 e CIRM DISC2-10110 concede a Dr. Colas.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo ACTC1SigmaA7811
Activina AStem Cell TechnologiesHu Recom Activina A
Antibiotico Antimicotico (Anti-Anti)Thermo Fisher Scientific 15240062
integratore di B27 senza - insulinaThermo Fisher ScientificA1895601
Integratore di B27 senza - vitamina A ThermoFisher Scientific12587001
anticorpo CDH5R& D SystemsAF938
CryoStor CS10Stem Cell Technologies7930Reagente di crioconservazione
DMEM ad alto glucosioMediatech10-013-CV 
DPBS con Ca & MgCorning21-030-CV
EDTAThermo Fisher Scientific15575-038
FBSVWR89510-186
Kit potenziale membrana FluoVolt  Thermo Fisher ScientificF10488Per l'acquisizione del potenziale d'azione ottica, fare riferimento a McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum ReplacementGibco10828010
Matrigel, Growth Factor ReducedCorning356231Coating reagent
mTeSR1 media kit StemCell Technologies5850
PBS senza Ca & mgcorning21-040-CV
penicillina-streptomicinagibco
puromicina Acros227422500
ReLeSRStem Cell Technologies5872Reagente di dissociazione privo di enzimi
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
Anticorpo TAGLNAbcamab14106
delle cellule staminalidi tiazovicina72254Inibitore della via RHO/ROCK
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605 -010Reagente di dissociazione contenente enzimi 1X
Bustine di miscela di soluzioni Tyrodes   SigmaT2145-10X1L(Per l'acquisizione del potenziale d'azione ottica, fare riferimento a McKeithan et al. 2017)
Integratore di B27 Thermo Fisher Scientific 17504044 Tecnologie

Riferimenti

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