Qui, presentiamo un protocollo per la localizzazione di multi-colore delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule vive. Per allegare fluorofori, proteine self-etichettatura sono usate. Proteine, trova in scomparti di diverse membrane dell'organello stesso, possono essere localizzati con una precisione di ~ 18 nm.
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Articolo metodologico
Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Conoscenza circa la localizzazione delle proteine in subcomparti cellulare è fondamentale per capire la loro funzione specifica. Qui, presentiamo una tecnica di Super-risoluzione che permette per la determinazione del microcompartments che sono accessibili per le proteine generando localizzazione e tracciamento di mappe di queste proteine. Inoltre, da microscopia localizzazione multi-colore, la localizzazione e tracciamento profili delle proteine in diversi subcomparti sono ottenuti simultaneamente. La tecnica è specifica per le cellule vive e si basa sull'imaging ripetitivo delle proteine di membrana mobile singolo. Le proteine di interesse sono geneticamente fuso con specifici, i cosiddetti self-etichettatura tag. Questi tag sono enzimi che reagiscono con un substrato in modo covalente. Coniugato di questi substrati sono coloranti fluorescenti. Reazione delle proteine enzima-etichetta con la fluorescenza etichettato risultati di substrati in proteine con etichettate. Qui, tetrametilrodamina (TMR) e silicio rodamina (SiR) vengono utilizzati come coloranti fluorescenti attaccati ai substrati degli enzimi. Utilizzando concentrazioni di substrato nel pM a Nm, Sub-stechiometrico etichettatura è raggiunto che si traduce in segnali distinti. Questi segnali sono localizzati con ~ 15 – 27 nm precisione. La tecnica permette per l'imaging multi-colore di singole molecole, per cui il numero di colori è limitato dalla disponibili coloranti membrana permeabile e il repertorio di enzimi con etichetta automatica. Per determinare la localizzazione dell'enzima di controllo di qualità (Pten) mostreremo la fattibilità della tecnica-indotta della chinasi 1 (PINK1) in diversi compartimenti mitocondriali durante l'elaborazione in relazione alle altre proteine di membrana. Il test per vere interazioni fisiche tra proteine diversamente con etichetta singole di singola molecola FRET o co-rilevamento è limitato, però, perché i gradi d'etichettatura Bassi diminuiscono la probabilità di avere due proteine adiacenti con l'etichetta allo stesso tempo. Mentre la tecnica è forte per l'imaging di proteine nei compartimenti di membrana, nella maggior parte dei casi non è opportuno determinare la localizzazione delle proteine solubili altamente mobile.
Introduzione
L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un metodo di imaging per localizzare e tenere traccia di proteine di membrana singola all'interno di cellule vive. Noi chiamiamo questo metodo di rilevamento e localizzazione microscopia (TALM)1,2. Come microscopia di ricostruzione ottica stocastica (tempesta)3 e microscopia a fluorescenza fotoattivazione localizzazione ((F) PALM)4,5, TALM è una tecnica di localizzazione singola molecola-basato fluorescenza. Tuttavia, è distinto in modo che la mobilità delle proteine di mem....
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Protocollo
Il seguente protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca istituzione locale.
1. metodi
-
Coltura cellulare
- Coltivare le cellule, per esempio le cellule HeLa (carcinoma della cervice umana), in un matraccio di cultura cellulare T25 contenente 5 mL di medium di crescita a 37 ° C e 5% CO2.
Nota: Per l'imaging, dividere le celle su preparati vetrini coprioggetti (Vedi punti 1.3 e 1.4) e tenere in mezzo di imaging.
- Coltivare le cellule, per esempio le cellule HeLa (carcinoma della cervice umana), in un matraccio di cultura cellulare T25 contenente 5 mL di medium di crescita a 37 ° C e 5% CO2.
-
Transfezione delle cellule
Nota: Utilizzare linee cellulari che esprimono stabilmente le proteine etichettate quando possib....
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Risultati
Analisi di imaging e colocalizzazione di multi-colore può contribuire a determinare la localizzazione sub-organellari delle proteine. Abbiamo dimostrato questo in precedenza con la fosfatasi citosolica e tensin omologo, PINK1, che ha diverse sedi sub-mitocondriali dovute alla sua lavorazione da proteasi mitocondriale17. PINK1 è un fattore importante, garantendo la funzionalità mitocondriale34,35. Per determ.......
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Discussione
Qui, una tecnica per la localizzazione di singola molecola di colore doppio delle proteine della membrana cellulare è stata presentata. Seguendo il protocollo, le proteine di membrana sono fuse a proteine che reagiscono con le tinture della rodamina TMR e SiR coniugato ai loro rispettivi substrati con etichetta automatica. Rodamina coloranti sono luminose e fotostabili e pertanto consentono di imaging ripetitivo1. Per performance di successo, alcuni condizioni e argomenti critici devono essere ten.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare il gruppo di biofisica e Jacob Piehler presso l'Università di Osnabrück per supporto continuo, Wladislaw Kohl per assistenza tecnica e preparazione del materiale e il Consiglio di CellNanOs per la fornitura di microscopi per l'uso. Il progetto è stato finanziato il 944 SFB.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| (acido 2-(4-(2-idrossietil)-1-piperazinil)-etansolfonico, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: divisore di fascio dicroide | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Specchio policroico, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | fuori produzione |
| Dulbecco´ s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x (senza Ca & | Sigma-Aldrich & Co. | ||
| Earle´ s MEM senza rosso fenolo, senza L-Glutammina e senza NaHCO3 contenente l'1% di FBS, lo 0,1% di HEPES, lo 0,1% di NEAA, lo 0,1% di Alanil-L-Glutammina e il 34,78% di carbonato acido di sodio (NaHCO3 0,75g/l) | Terreno di imaging | ||
| Earle´ s terreno essenziale minimo (MEM) con rosso fenolo, contenente l'1% di siero fetale bovino superiore (FBS), lo 0,1% di HEPES (acido 2-(4-(2-idrossietil)-1-piperazinil)-etansolfonico, 1 M) e lo 0,1% di aminoacidi non essenziali (NEAA) | Terreno di crescita | ||
| EF: filtro di emissione passa-banda | quadbandpass AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| Telecamera EMCCD | Andor | Andor iXON 897 | Telecamera EMCCD |
| Filtro di emissione Cubetti filtranti QuadView, arancione | AHF analysentechnik | F39-637 | passa-banda 582 - 619 nm |
| Filtro di emissione Cubetti filtranti QuadView, rosso | Chroma | passa-banda 655 - 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Siero fetale bovino) superiore | Biochrom | S0615 | |
| Perle fluorescenti: TetraSpeck™ Microsfere, 0,1 & micro; m, fluorescente blu/verde/arancione/rosso scuro | Thermo Fisher Scientific | T7279 | microsfere fluorescenti |
| Glutammina | Biochrom | #0951C | |
| cellule HeLa | DSMZ | ACC-57 | Cellule di carcinoma cervicale dalla paziente Henrietta Lacks |
| Hela cells CI::p aGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View Software | |
| di elaborazione delle immagini | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Olio da immersione - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Microscopio a epifluorescenza invertita | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | Laser a emissione 561 |
| nm 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emissione |
| MATLAB | MathWorks | versione R2013a | |
| MEM con soluzione salina bilanciata di Earle 2,2 g/L di NaHCO3, glutammina stabile senza PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM con soluzione salina bilanciata di Earle con 2,2 g/L di NaHCO3, glutammina stabile, fenolo Biochrom | FG-0325 | ||
| MitoTracker. Colorante rosso profondo FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| MitoTracker® Colorante FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Polarizzazione ottica multimodale che mantiene la fibra monomodale | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tü Bingen | rivestimento vetrino coprioggetti | |
| aminoacidi non essenziali (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polietilenglicole) 10 % | Carl Roth GmbH | Codice 0263.1 | rivestimento vetrino coprioggetti |
| Penicillina/Streptomicina | Biochrom | #0122E | |
| Plasmide per l'espressione PINK1-Halo7-Tag | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poli-L-lisina (1,2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | gatto. No.P9155 | rivestimento vetrino coprioggetto |
| RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | rivestimento vetrino coprioggetto / Motivo del recettore Intergrin | |
| Silicio Rodamina legata a HaloTag®-Ligando (SiRHTL) | regalo personale da Kai Johnson | tintura | |
| Software analisi plugin | auto-scritto C. P. Richter, Biophysik Osnabrü ck | SLIMFAST 16g | |
| Tetrametilrodamina / SNAP-Cell® TMR-Star collegato a SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | colorante |
| Tetrametilrodamina legato a HaloTag®-Ligando (TMRHTL) | Promega | G8251 | colorante |
| TIRF | condensatore Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensatore |
| TIRF software di controllo del microscopio | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF obiettivo | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Tripsina/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Acqua H2O 99,5 % Rotipuran® Basso organico | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |
Riferimenti
- Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
- Appelhans, T., Busch, K.
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Ristampe e permessi
