Qui descriviamo una procedura per verificare la migrazione cellule in vitro con un microscopio ottico automatizzato fotocamera. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato ampiamente usato dove la chiusura del graffio è seguita per un periodo determinato. Il microscopio ottico consente un rilevamento affidabile e a buon mercato della migrazione cellulare.
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Articolo metodologico
Ottimizzato Scratch test per test In Vitro della migrazione cellulare con una fotocamera ottica automatizzata
In questo articolo
Sommario
Abstract
Migrazione delle cellule è un processo importante che influenza molti aspetti della salute, come ad esempio la guarigione della ferita e cancro, e, pertanto, è cruciale per lo sviluppo di metodi per lo studio della migrazione. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato a lungo il più comune metodo di in vitro per testare composti con proprietà anti - e pro - emigrazione a causa del sua basso costo e semplice procedura. Tuttavia, un problema spesso segnalati del dosaggio è l'accumulo di cellule attraverso il bordo del graffio. Inoltre, per ottenere dati del dosaggio, immagini di esposizioni diverse devono adottare per un periodo di tempo a nello stesso punto per confrontare i movimenti della migrazione. Analisi di diversi programmi possono essere utilizzati per descrivere la chiusura gratta e Vinci, ma sono ad alta intensità di manodopera, imprecise e cicli di forze delle variazioni di temperatura. In questo studio, dimostriamo un metodo ottimizzato per testare l'effetto di migrazione, ad esempio con le proteine naturale, umani e bovini-lattoferrina e loro peptide N-terminale Lactoferricin sulla linea cellulare epiteliale HaCaT. Un'ottimizzazione cruciale è quello di lavare e gratta e Vinci in PBS, che elimina il suddetto accumulo di cellule lungo il bordo. Questo potrebbe essere spiegato dalla rimozione di cationi, che sono stati indicati per avere un effetto sulla connessione cellulare dei cheratinociti. Per garantire la vera rivelazione della migrazione, pre-trattamento con mitomicina C, un inibitore della sintesi del DNA, è stato aggiunto al protocollo. Infine, dimostriamo l'automatizzato telecamera ottica, che elimina i cicli di temperatura eccessiva, lavoro manuale con analisi di chiusura sul gratta e Vinci, migliorando sulla riproducibilità e garantire un'analisi di sezioni identiche dello scratch nel corso del tempo.
Introduzione
La migrazione è un processo importante che influenza diversi aspetti fisiologici. Nella guarigione delle ferite, migrazione facilita la riepitelizzazione della pelle. Nelle ferite non guariscono, quali ferite croniche, batteri opportunisti causano infezione della ferita, e ferite aperte sono ideali per la crescita di batteri e la formazione di biofilm1,2. Biofilm è una delle cause dello sviluppo di batteri resistenti, che è una delle maggiori minacce per la nostra società moderna3. Nella guarigione della ferita, le cellule immunitarie non possono penetrare il biofilm. Nel cancro, migraz....
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Protocollo
La messa a punto sperimentale non ha alcuna restrizione etici e giuridici ed è stata condotta in accordo con l'Università di Roskilde. Una panoramica della disposizione sperimentale può essere visto in Figura 1 e i meccanismi della telecamera ottica nella Figura 2.
1. preparazione
- Eseguire tutti i passaggi in un banco di flusso laminare sterile pulendo la panchina e tutte le attrezzature con etanolo al 70% prima dell'inizio dell'esperimento.
- Posizionare la fotocamera ottica in un convenzionale incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per garantire le condizioni....
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Risultati
HaCaT è una linea cellulare dei cheratinociti, uno dei tipi più abbondanti delle cellule della pelle. Quando si verifica una ferita, le cellule della pelle iniziano a proliferare e migrare sopra al letto della ferita per chiudere la ferita (Figura 3). Entrambi i processi sono, quindi, della massima importanza per la corretta guarigione.
La camera ottica può seguire entrambi i processi in tempo reale.......
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Discussione
L'importanza dell'immigrazione negli studi di sviluppo, la guarigione della ferita, immunologia ed il cancro ha portato a diversi metodi per studiare la migrazione. Migrazione può essere un'espressione dell'espansione o la chiusura del divario dalle cellule. Più spesso la chiusura del graffio viene testata, come è più facile crescere le cellule in un monostrato e poi fare un graffio che la coltivazione di cellule in una forma specifica di8. Il nostro studio dimostra un metodo ottimizzato per scrat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Consiglio danese per la ricerca indipendente, tecnologia e produzione, concedere #4005-00029
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | Telecamera ottica | |
| Software UniExplorer | Soluzione BioSense ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| Cellula | Donata da Bispebjerg Hospital | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Terreno per HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Siero fetale bovino |
| PBS | Gibco | D837 | senza Mg+ e Ca2+ |
| Matitalina-Streptomicina | Sigma | P0781 | Antibiotici |
| Tripsina (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomicina C | Tocris | 3258 | Inibisce la proliferazione |
| Piastra per microtitolazione | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Incubatore | Panasonic | 37° C, 5% CO2 | |
| Emocitometro | Assistente | Tü rk (0,1 mm) | |
| Pinza ragazzo | Accu-Jet pro |
Riferimenti
- Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
- da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.....
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Ristampe e permessi
