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Articolo metodologico

Valutare la fattibilità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia ospite-microbo In Vitro Gut

11K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/57699

⸱

4 luglio 2018

 ,  , 
1Center for Microbial Ecology and Technology (CMET), Ghent University

In questo articolo

Sommario

Interazioni ospite-microbo intestino sono stati valutati utilizzando un approccio innovativo che unisce una comunità orale sintetica, la digestione gastrointestinale in vitro e un modello dell'epitelio dell'intestino tenue. Presentiamo un metodo che può essere adattato per valutare l'invasione delle cellule degli agenti patogeni e multispecie biofilm, o anche per testare la capacità di sopravvivenza dei probiotici formulazioni.

Abstract

L'interazione tra host e microbiota è stato a lungo riconosciuto e ampiamente descritto. La bocca è simile ad altre sezioni del tratto gastrointestinale, come microbiota residente si verifica e impedisce la colonizzazione di batteri esogeni. Infatti, più di 600 specie di batteri si trovano nella cavità orale, e un singolo individuo può trasportare circa 100 diversi in qualsiasi momento. I batteri orali possiedono la capacità di aderire alle varie nicchie nell'ecosistema orale, così diventando integrato all'interno della comunità microbica residente e favorire crescita e sopravvivenza. Tuttavia, il flusso di batteri nell'intestino durante la deglutizione è stato proposto a perturbare l'equilibrio del microbiota. Infatti, la somministrazione orale di p. gingivalis spostato composizione batterica nella microflora ileale. Abbiamo usato una comunità sintetica come una rappresentazione semplificata dell'ecosistema naturale orale, per delucidare la sopravvivenza e la vitalità dei batteri orali sottoposti a condizioni di transito gastrointestinale simulata. Quattordici specie sono stati selezionati, sottoposti in vitro salivare, gastrica e processi di digestione intestinale e presentati a un modello di vari compartimenti cellulari contenenti cellule Caco-2 e HT29-MTX per simulare l'epitelio della mucosa intestinale. Questo modello ha servito a svelare l'impatto di ingestione batteri su cellule coinvolte nella circolazione enteroepatica. Uso delle Comunità di sintetiche permette di controllabilità e riproducibilità. Così, questa metodologia può essere adattata per valutare la vitalità del patogeno e successive modifiche associate all'infiammazione, capacità di colonizzazione delle miscele di probiotici, e in ultima analisi, batterico potenziale impatto sulla circolazione presistemica.

Introduzione

Gli esseri umani convivono con i batteri, che sono presenti presso lo stesso numero di cellule umane1. Quindi, è di fondamentale importante ottenere una comprensione globale del microbioma umano. La cavità orale è un ambiente unico, in quanto è diviso in parecchi più piccoli habitat, contenendo così una grande varietà di batteri e biofilm in quei luoghi diversi. Essendo un ecosistema aperto, alcune specie in bocca può essere transitori visitatori. Tuttavia, alcuni microrganismi colonizzano presto dopo la nascita e forma organizzata biofilm2. Questi si trovano sulla superficie dei denti sopra il crepaccio gengiva, subgingival interstiziale, linguetta, superfici mucose e protesi dentali e materiali da otturazione3. I batteri possono essere presenti anche come flocculi e cellule planctoniche nel lume del canale del dente, intervallate da tessuto della polpa necrotica o sospeso in una fase fluida.

C'è attivo, continuo cross-talk tra cellule dell'ospite e il microbiota residente4. Batteri comunicano all'interno e tra le specie, e solo una piccola percentuale dei colonizzatori naturale possa aderire ai tessuti, mentre altri batteri allegare Questi colonizzatori primari. Per esempio, l'associazione di cella tra microrganismi è essenziale per integrare colonizzatori secondari nel biofilm orali e costruzione di reti complesse di interazione cellule microbiche4. Circa il 70% degli aggregati batterici in un campione di saliva sono formate da Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP., Veillonella SP. e non identificato Bacteroidetes. F. nucleatum è un colonizzatore intermedio nel biofilm subgengivale e aggregati con i colonizzatori tardi gingivalis del p., T. denticola e Tannerella forsythia, che sono implicati in periodontitis5. In più, Streptococcus mitis occupa habitat sia mucoso e dentale, mentre S. sanguinis e S. gordonii preferiscono colonizzare denti3. Così, S. sanguinis è presente in incisivi inferiori e canini, mentre Actinomyces naeslundii è stato trovato in anteriori superiore6.

Inoltre, il microbioma indigeno svolge un ruolo nel mantenimento della salute umana2. Microbiota residente partecipa alla formazione immune e nell'impedire l'espansione di agente patogeno. Questa resistenza di colonizzazione si verifica perché i batteri nativi possono essere meglio adattati al fissaggio su superfici e più efficienti a metabolizza le sostanze nutritive disponibili per la crescita. Sebbene ceppi probiotici sopravvivono al passare gastrointestinale e rimangono attive, la persistenza di batteri autoctoni inghiottito da una posizione superiore del tratto gastrointestinale non è stato completamente descritto. Così, abbiamo sottoposto una comunità artificiale, rappresentante dell'ecosistema orale, alle condizioni di transito gastrointestinale simulata. Attuabilità delle cellule batteriche è stata valutata utilizzando un modello multicomparto che assomiglia l'epitelio intestinale. Simulatori di intestino attuale offrono riproducibilità adatto in termini di analisi della comunità microbica luminal7. Tuttavia, adesione batterica e l'interazione ospite-microbo separatamente sono indirizzate, come combinazione di linee cellulari con comunità microbiche è impegnativo8. Al contrario, vi presentiamo un quadro che fornisce spiegazione meccanicistica potenziale di colonizzazione successo eventi segnalati sull'interfaccia dell'intestino. Infatti, questo modello può essere congiuntamente utilizzato con un modello statico dell'intestino per valutare l'impatto delle comunità microbiche su host superficie segnalazione.

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Protocollo

1. ceppi e condizioni della coltura

Nota: La comunità orale sintetica è stata composta da ceppi comunemente presenti in microbioma orale3.

  1. Ottenere i seguenti ceppi da americano tipo Culture Collection (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Lo streptococco gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) e Streptococcus mitis (ATCC 49456).
  2. Veillonella parvula dal Leibniz Institute DSMZ-tedesco collezione di microrganismi e colture cellulari (DSM 2007), Streptococcus sanguinis dall'insieme di batteri BCCM/LMG (LMG 14657) di acquisire e utilizzare Streptococco salivarius ceppo TOVE-R9e Streptococcus oralis10.

2. sviluppo di un rappresentante della Comunità multispecifica del microbioma orale

Nota: Generare una comunità sintetica per simulare la potenziale capacità di adesione dei batteri orali per l'epitelio intestinale in vitro . Crescere batteri su piastre di agar sangue completati con 5 Emina μg/mL, 1 µ g/mL menadione e defibrinato sterile 5% sangue di cavallo, come descritto in Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11. In breve:

  1. Sciogliere 100 mg di Emina in 2 mL di NaOH M 1, aggiungere 100 mL di acqua distillata in autoclave. Conservare in un contenitore scuro. Sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 µm prima di aggiungere al mezzo.
  2. Sciogliere 100 mg del menadione in 20 mL di etanolo al 96%. Sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 µm prima di aggiungere al mezzo.
  3. Preparare 1 L di terreno agar sangue (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore e autoclave. Lasciate raffreddare prima di aggiungere il sangue di cavallo e i supplementi. Mescolare e versare le piastre.
  4. Preparare brodo modificate cervello cuore infusione (BHI) come precedentemente segnalati12. Aggiungere 5 μg/mL di Emina e 1 μg/mL del menadione dopo sterilizzazione in autoclave.
  5. Dispensare 9 mL di terreno in provette Hungate e chiudere con un tappo di gomma e ghiera di alluminio. Svuotare i tubi con N2Co2 (90% / 10%).
  6. Recuperare 1 mL di terreno anaerobico con una siringa e metterlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Scegliere singole colonie di ogni specie batteriche, risospendere in mezzo e trasferire nuovamente dentro il BHI modificate anaerobica. Incubare per 48 h a 37 ° C, ad eccezione di S. salivarius, che devono essere incubate per 24 h.
  7. Se necessario, confermare la purezza delle culture prima del montaggio della Comunità sintetica. In breve:
    1. Estrarre il DNA dalle colture del liquide come Hernandez-Sanabria et al. (2010) 13 e amplificare il gene del rRNA 16S, utilizzando i primers 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) e 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT) e il seguente programma: 5 minuti a 95 ° C, 30 cicli di 95 ° C per 1 min, 55 ° C per 1 min e 72 ° C per 1,5 minuti, seguita da una fase di estensione finale di 5 min a 72 ° C.
    2. Purificare il prodotto di PCR con uno spot pubblicitario kit (Vedi Tabella materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Eseguire la reazione di sequenziamento dei prodotti purificati in un volume totale di 10 μL contenente 0,5 μL di colorante (Vedi Tabella materiali), 3,2 pmol di primer M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2.0 μL di sequenziamento buffer 5x e 20 ng di modello, utilizzando un sistema commerciale sequenziamento con kit (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Abbiamo avuto questa procedura eseguita in commercio.
    4. Eseguire una ricerca BLAST su tutte le sequenze (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) per determinare il taxon più noto e confrontare con la sequenza del ceppo originario utilizzando lo strumento online di RDP classificatore (http://rdp.cme.msu.edu/) e il SINA Servizio di allineamento (https://www.arb-silva.de/aligner/).
  8. Misurare il numero di cellulare alla fine dell'incubazione, tramite flusso cytometry e macchia SYBR Green/propidio ioduro, come descritto nella Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11. Diluire le culture a 105 cellule mL-1, utilizzando modificato BHI.
  9. Aggiungere 1 mL di S. mitis in 75 mL di BHI anaerobica e incubare fino alla fase stazionaria (6h). In seguito, raccogliere 0,75 mL di ogni ceppo diluito e mescolare in condizioni anaerobiche.
  10. Una volta che tutte le culture sono state mescolate, prendere 1 mL del microcosmo e aggiungere i 75 mL di BHI. Incubare la comunità sintetica sotto il 10% di CO2, 10% H2, 80% N2 per 48 h a 37 ° C e 200 giri/min (Vedi Tabella materiali).
  11. Misurare la densità delle cellule come in 2.8. prima di presentare la Comunità per il modello di cellulare. Composizione della Comunità può essere valutato con quantitativa Real-Time PCR, utilizzando i primers e ricottura temperature nella tabella 1 di Slomka et al. (2017) 10. Inoltre, utilizzare amplicon di gene del rRNA 16S per fornire informazioni sui membri iniziali presenti13,14. Per entrambi i protocolli conferma di identità, utilizzare cDNA come modello per indicare i batteri attivamente trascrizione proteine e utilizzare il DNA come un modello per rivelare la presenza/assenza dei ceppi.

3. pratiche di coltura cellulare generale

Nota: Per gli aspetti generali della coltura delle cellule, gli autori si riferiscono al Maestro e Stacey (2007)15. Ottenere linee cellulari usate da collezione di autenticato Cell Culture europee (Caco-2 ECACC 86010202 e HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, sanità pubblica in Inghilterra, UK). Reagenti per colture cellulari possono essere acquistati (Vedi Tabella materiali), se non diversamente specificato.

  1. La manutenzione e il passaggio delle linee di cellule Caco-2 e HT29-MTX
    Nota: Le cellule Caco-2 e HT29-MTX ordinariamente sono coltivate in recipienti di coltura del tessuto2 25 cm contenenti la completati DMEM medio (tabella 1). Le cellule vengono tripsinizzate quando viene raggiunta la confluenza di 60 – 70%.
    1. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare dai palloni. Lavare due volte con 5 mL di PBS senza /Mg Ca ++++.
    2. Aggiungere 2 mL di una soluzione di 0,5 mg/L di tripsina e acido etilendiamminotetraacetico 0,22 g/L (EDTA). Distribuire la soluzione di tripsina muovendo delicatamente il pallone. Rimuovere 1,5 mL di soluzione di tripsina e incubare la beuta a 37 ° C per 10 min.
    3. Controllare al microscopio se le cellule si staccano dalla superficie del pallone. Incubare per ulteriori 5 minuti, se necessario.
    4. Aggiungere 5 mL di terreni di coltura cellulare completati al pallone per inattivare la tripsina. Dispensare su e giù per ottenere una sospensione omogenea singola cella.
    5. Immediatamente, prendere un 50 µ l aliquota della sospensione cellulare e mescolare con soluzione sterile di Trypan blu 0,4% in una proporzione di 1:1 (v/v) per le cellule Caco-2 o 1:5 v/v per HT29-MTX. Mix di pipettaggio e carico in una camera di conteggio (Vedi Tabella materiali).
    6. Contare le cellule vitali (cellule bianche brillanti) sotto il microscopio (Vedi istruzioni del produttore).
    7. Seme in un fiasco di nuovo ad una densità di 4 x 105 cellule/cm2 e 1 x 104 cellule/cm2, per Caco-2 e HT29-MTX, rispettivamente.
      Nota: (1) Caco-2 cellule differenziano e formano giunzioni strette, una volta raggiunta la confluenza. È estremamente importante evitare over-confluency prima trypsinization. Crescita eccessiva delle cellule nella beuta possa causare errori in distacco cellulare dopo ciuffi trypsinization e/o cellulare. (2) le cellule HT29-MTX sono diproduzione cellule con alta attività metabolica16. Queste caratteristiche possono causare un veloce acidificazione dei terreni di coltura delle cellule, soprattutto se le cellule sono ad alta densità. Tampone HEPES possa essere aggiunti al terreno di coltura delle cellule (tabella 1) per mantenere il pH tra 7 e 7.2. Se il pH scende, il mezzo può essere scambiati quando confluenza è inferiore al 50%. Tuttavia, se confluenza > 50%, la coltura delle cellule deve essere suddivisa.

4. montaggio di un modello di vari compartimenti cellulari che simula l'interfaccia di ospite-microbo Gut

Nota: Completare la co-cultura in doppia pozzetti di alloggiamento (diametro 24mm, poro taglia 0,4 μm; Vedi Tabella materiali).

  1. Aggiungere 1,5 mL di terreni di coltura cellulare completo al compartimento apicale e 2 mL al basale. Pre-Incubare per 20 – 30 minuti per ottenere una distribuzione uniforme della sospensione delle cellule quando semina.
  2. Tripsinizzano la cultura delle cellule Caco-2 e HT29-MTX come descritto nella sezione 3. La procedura di trypsinization dovrà essere seguita con precisione per ottenere una distribuzione omogenea di entrambe le linee cellulari, in una sospensione singola cella, senza grumi.
  3. Contare le cellule vitali come descritto in 3.1.8.
  4. Regolare la densità delle cellule a 6.5 x 104 cellule/cm2 in una proporzione di 90/10 delle cellule Caco-2/HT29-MTX.
  5. Omogeneizzare le sospensioni cellulari e aggiungere il corrispondente volume di cellule Caco-2 e HT29-MTX in un contenitore sterile preriempito con terreni di coltura cellulare completati. Rimuovere il supporto pre-incubato dal lato apicale della camera di aspirazione.
  6. Delicatamente miscelare la sospensione delle cellule pipettando e trasferire 1,5 mL al compartimento apicale degli inserti da camera. La procedura di semina richiede una costante omogeneizzazione della sospensione delle cellule, come le cellule tendono a sedimenti. A seconda dell'esperienza dell'utente e della velocità di lavoro, la sospensione cellulare deve essere mescolato dopo 1 – 3 pozzi di erogazione.
  7. Spostare piastre delicatamente avanti e indietro e poi a destra a sinistra a destra (5 – 10 volte) per ottenere un uniforme diffusione delle cellule nel pozzo. Trasferimento in incubatrice e ripetere il movimento delle placche.
  8. Mantenere la co-coltura delle cellule Caco-2/HT29-MTX per 15 giorni, rinfrescante compartimenti apicale e basale ogni 2 giorni con DMEM completati. Dopo questo tempo, i terreni di coltura delle cellule sono modificabili a DMEM completati senza soluzione di antibiotico/antimicotico.
  9. Mantenere il sistema fino a 20 – 21 giorni post-semina aggiornando il mezzo ogni 2 giorni.
  10. Misurare l'integrità della barriera epiteliale prima di iniziare l'analisi, utilizzando un sistema elettrico di resistenza (Vedi tabella materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
    1. Garantire che le attrezzature TEER sono completamente carica (> 24 ore) prima di iniziare le misurazioni.
    2. Scollegare l'apparecchiatura TEER dall'alimentazione elettrica e coprire con un sacchetto di plastica autoclave. Fare un buco nel sacchetto per introdurre l'elettrodo e collegare la porta di ingresso sul misuratore. Spruzzare con 70% di etanolo/acqua (v/v) prima di introdurre l'apparecchiatura TEER nel mobile del flusso.
    3. Per disinfettare l'elettrodo, immergere le punte dell'elettrodo nella soluzione di etanolo/acqua (v/v) di 70% per 15 min. Consenti all'aria secca per 15 s. Risciacquare l'elettrodo in terreni di coltura delle cellule pre-riscaldato.
    4. Prendere le cellule fuori l'incubatrice e permettono alle cellule di venire a temperatura all'interno del flusso mobile.
    5. Assicurarsi che il metro sia scollegato dal caricabatterie. Impostare il selettore di modalità su ohm e accendere l'alimentazione.
    6. Misurare la resistenza di cella immergendo l'elettrodo con la punta più corta nell'inserto e la punta più a lungo fuori del pozzo. Tenere l'elettrodo ad angolo 90° per l'inserimento della piastra.

5. batterica sopravvivenza seguenti In Vitro condizioni transito gastrointestinale

Nota: Preparare digestione simulata fluidi seguendo il protocollo di Minekus et al. (2014) 17, con le modifiche descritte di seguito. Preparare tutte le diluizioni con acqua ultrapura. Filtro-sterilizzare tutte le soluzioni attraverso un filtro di 0,22 µm ed eseguire la procedura di digestione in condizioni sterili.

  1. Digestione orale:
    1. Posizionare 3 mL della comunità batterica in una provetta sterile da 50 mL, mescolare con 3 mL di fluido di saliva simulata (SSF), contenente (in mmol L-1): KCl, 15,1; KH2PO4, 3,7; NaHCO3, 6,8; MgCl2(H2O)6, 0.5, (NH4) CO3, 0,06; HCl, 1.1; CaCl2(H2O)2, 0.75. Aggiungere 75 U/mL di α-amilasi da saliva umana tipo IX-A e 2 g/L mucina da tipo II di stomaco suino per la SSF.
    2. Incubare la miscela per 2 min a 37 ° C e 100 giri/min. Raccogliere un campione di 2 mL per estrazione del DNA e quantificazione di citometria a flusso (S1).
  2. Digestione gastrica:
    1. Aggiungere 4 mL di liquido gastrico simulato (SGF), contenente (in mmol L-1): KCl, 6,9; KH2PO4, 0,9; NaHCO3, 25; NaCl, 47.2; MgCl2(H2O)6, 0,1, (NH4) CO3, 0,5; HCl, 15,6; CaCl2(H2O)2, 0,075. Inoltre, la SGF contenute 2 g/L di mucina da tipo II di stomaco suino.
    2. Misurare il pH e regolare il pH 3 con 1M HCl, se necessario. Incubare a 37 ° C e 100 giri/min. Raccogliere un campione di 2 mL (S2).
  3. Piccolo intestino digestione:
    1. Aggiungere 4 mL di liquido intestinale simulato (SIF) che contiene (in mmol L-1): KCl, 6,8; KH2PO4, 0,8; NaHCO3, 85; NaCl, 38,4; MgCl2(H2O)6, 0,33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0.3; per il tubo di digestione.
    2. Se necessario, regolare a pH 7 con 1 M NaOH. Incubare a 37 ° C e 100 giri/min. Raccogliere un campione di 2 mL (S3).

6. capacità di colonizzazione batterica seguenti In Vitro condizioni transito gastrointestinale

  1. Centrifugare 2 mL della digestione nell'intestino tenue, per 10 min a 2.650 x g.
  2. Rimuovere il supernatante e mescolare il pellet batterico con 5 mL di DMEM completati senza antibiotici e antimicotici.
  3. Macchia e quantificare le cellule intatte/danneggiato utilizzando un citometro a flusso (Vedi Tabella materiali), come descritto da Hernandez-Sanabria et al. (2017) 11.
  4. Regolare la densità delle cellule a 105 vitali cellule/mL diluendo in DMEM completati senza antibiotici e antimicotici.
  5. Rimuovere il supporto apicale del sistema transwell e aggiungere 1,5 mL di sospensione batterica. Co-coltura del sistema per 2 h in condizioni di coltura cellulare generale (37 ° C, umidità 95%, 5% CO2).
    Nota: Questo tempo può essere esteso fino a 48 ore, a seconda del protocollo sperimentale necessaria. La co-coltura possa essere mantenuta in un incubatore diverso da quello utilizzato per la manutenzione ordinaria delle cellule, per evitare contaminazioni.
  6. Misurare i valori TEER dopo l'incubazione, per valutare l'integrità della barriera epiteliale, come descritto in 4.11.
  7. Al termine dell'incubazione, rimuovere supporti apicali e raccogliere 0,5 mL per ulteriori analisi (S4). Un sottocampione di media può essere utilizzato per la valutazione di attuabilità delle cellule dall'analisi di lattato deidrogenasi (LDH) (Vedi Tabella materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
  8. Aggiungere 0,5 mL di 10 millimetri di N-acetilcisteina in HBSS (NAC-buffer) per solubilizzare il muco prodotto da HT29-MTX e recuperare batteri aderiti. Incubare le piastre a 37 ° C per 1 h, sotto agitazione (135 giri/min, Vedi Tabella materiali).
  9. Recuperare il NAC-HBSS in un tubo del microcentrifuge (S5) e lavare due volte le cellule con 1 mL DPBS.
  10. Aggiungere 0,5 mL di 0.5% Triton X-100 (w/v) in cima i monostrati, frantumare le cellule pipettando, recuperare il liquido e vortexare per 1 min velocità è fondamentale per evitare di danneggiare le cellule batteriche con il detersivo.
  11. Centrifugare le cellule per 5 min a 2.650 x ge separare il surnatante (S6) e il pellet (S7).

7. esempio analisi

Nota: Analizzare campioni raccolti (S1-S7) per valutare la vitalità batterica e adesione potenziali alle cellule intestinali, seguendo una digestione gastrointestinale simulata.

  1. Vitalità batterica: passare campioni S1-S5 due volte attraverso una 0,45 µm e quantificare le cellule batteriche usando la macchiatura delle cellule vive/morte e flusso cytometry, come indicato al punto 2.811.
  2. Potenziale di adesione: preparare diluizioni seriali (-1 -8) per S1-S6 e streak 10 µ l in agar sangue e modificati piastre BHI. Incubare a 37 ° C in condizioni anaerobiche per 24 – 48 h. piastra lo stesso volume di S7 non diluito.
    1. Identificazione tassonomica dei batteri aderiti:
      1. Scegli diverse colonie con un ciclo di cultura e risospendere ciascuno su 10 µ l di acqua priva di nucleasi. Raccogliere 4 µ l di questa sospensione e utilizzarlo come modello per l'amplificazione di PCR del gene del rRNA 16S utilizzando i primer e le condizioni descritte nella 2.7.1.
      2. Eseguire sequenziamento seguendo il protocollo in 2.7.3 e convalida della sequenza utilizzando la procedura inclusa in 2.7.4.
  3. Fare ulteriori analisi a valle come totale estrazione del DNA, qPCR quantificazione e/o 16S rRNA amplicone Ordina, estrazione del RNA e trascrittomica profiling come desiderato.
    Nota: La quantificazione di citometria a flusso è stata eseguita immediatamente dopo il campionamento. Come controllo per celle a membrana-permeabilized, è stato utilizzato un campione esposto a 70 ° C per 3 min. Rumore di fondo è stata valutata misurando con citometria a flusso, i liquidi di digestione o campioni ottenuti dal modello della coltura cellulare senza batteri. Ogni campione è stata misurata in triplice copia.

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Risultati

Questo protocollo conduce alla generazione di un modello adatto di delucidare la sopravvivenza e la vitalità dei batteri orali sottoposti a condizioni di transito gastrointestinale simulata. I conteggi delle cellule intatte da singoli ceppi è di circa 108 cellule mL-1 prima della creazione della Comunità sintetica, mentre il microcosmo multispecifica contenuto superiore al 90% di cellule vitali durante la creazione di comunità ( Figura 1A

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Discussione

Il microbioma orale è un elemento chiave nella salute umana, come recentemente riportato da diversi autori20,21. I risultati precedenti suggeriscono che l'ingestione di saliva che contiene grandi carichi di batteri può influenzare l'ecosistema microbico dell'intestino tenue, che è uno dei principali siti per l'adescamento immune. La combinazione di un modello statico di digestione gastrointestinale superiore con l'interfaccia host rappresentato dalle cellule epit...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario della Fondazione di ricerca Fiandre a Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria è un postdoctoral fellow supportato da Flanders innovazione e imprenditorialità (Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie, IWT).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
<> CEPPI
Aggregatibacter actinomycetemcomitans American Type Collezione di coltureATCC 43718
Fusobacterium nucleatum American Type Culture CollectionATCC 10953
Porphyromonas gingivalis American Type Culture CollezioneATCC 33277
Prevotella intermedia Collezione di cultura di tipo americanoATCC 25611
Streptococcus mutans Collezionedi cultura di tipo americanoATCC 25175
Streptococcus sobrinus Collezionedi cultura di tipo americanoATCC 33478
Actinomyces viscoso American Tipo Collezione di colturaATCC 15987
Streptococcus salivarius  TOVE-R
Streptococcus mitis American Type Collezione di coltureATCC 49456
Streptococcus sanguinis BCCM/LMG Collezione di batteriLMG 14657
Veillonella parvula Leibniz Institute DSMZ-Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulariDSM 2007
Streptococcus gordonii American Type Collezione di coltureATCC 49818
CELL LINES
Caco-2 cellsCollection of Authenticated Cell Cells86010202
HT29-MTXCollezione Europea di Certified Cell Cultures 12040401
REAGENTI E MATERIALI DI CONSUMO
Brain Heart Infusion (BHI) brodoOxoidCM1135
Blood Agar 2OxoidCM0055Blood Agar medium
MenadioneSigmaM9429
HeminSigmaH9039
5% sangue di cavallo defibrinato sterileE& O LaboratoriesLtd,P030
Kit InnuPREP PCRpureAnalytik Jena845-KS-5010250Kit di purificazione PCR
BigDye Applied Biosystems4337454colorante per il sequenziamento ABI
Prism BigDye Terminator v3.1 kit di sequenziamento del cicloApplied Biosystems4337456
SYBR  Green IInvitrogenS7585
Ioduro di propidioInvitrogenP1304MP
Fiasche di coltura T25 non rivestite, trattate con colture cellulari, ventilate, steriliVWR734-2311
Soluzione di tripsina-EDTASigma-AldrichT3924-100ML
Soluzione di Trypan Blue
0,4%, liquido, filtrato sterile		Sigma-AldrichT8154 
PBSGibco14190250
terreni di coltura cellulare DMEM, con tecnologie GlutaMAX e PyruvateLife31966-047
Inserti per colture cellulari con membrana in poliestere Corning TranswellSigma-AldrichCLS3450-24EA
Mucina da stomaco suino di tipo II   Sigma-AldrichM2378
Siero fetale bovino inattivatoGreiner Bio One758093
Antibiotico-Antimicotico (100X)Gibco15240062
Triton X 100 per biologia molecolareSigma-AldrichT8787 
DPBS senza calcio, magnesioGibco14190-250
Kit per il test di citotossicità Pierce LDHThermo Fisher Scientific88953
Corning HTS Transwell-24 pozzetto, dimensione dei pori 0,4 e micro; mCorning Costar Corp3450
Acqua priva di nucleasiServa Elettroforesi28539010
EQUIPMENT
Camera di conteggio Neubauer migliorataCarl RothT729.1
BD Accuri C6 Citometro a flussoBD Biosciences653118
OmogeneizzatorePowerLyzer 24MoBio13155
T100 TermociclatoreBioRad186-1096
Sistema di risciacquoCustommade-InnOva
4080 Agitatore per incubatoreNew Brunswick Scientific8261-30-1007Agitatore per
incubatore CO2Memmert GmbH & Co.ICO150med
Millicell ERS (Sistema di resistenza elettrica)EMD Millipore, Merck KGaAMERS00002
Millipore Milli-Q academic, sistema di acqua ultra puraMillipore, Merck KGaA-Shaker
(ROCKER 3D basic)IKA4000000Shaker per 6.10
European 2.10

Riferimenti

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