Questo lavoro fornisce un metodo per la realizzazione di piattaforme microfluidici basati su gocciolina e l'applicazione di microsfere di poliacrilammide per l'amplificazione di PCR di microsfere. Il metodo di microsfere-PCR permette di ottenere single-stranded DNA ampliconi senza separare DNA double-stranded.
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Articolo metodologico
Un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-PCR amplificazione per ampliconi di DNA Single-Stranded
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Basato su goccia microfluidica consentono la produzione affidabile di microsfere omogenee nel canale di microfluidica, fornendo controllata, dimensioni e morfologia delle microsfere ottenute. Una microsfera copolimerizzato con una sonda di DNA coprocoltura con successo è stato fabbricato. Diversi metodi quali la PCR asimmetrica, digestione esonucleasi e isolamento su biglie magnetiche rivestite con streptavidina possono essere utilizzati per sintetizzare DNA a singola elica (ssDNA). Tuttavia, questi metodi non possono utilizzare in modo efficiente grandi quantità di altamente purificato ssDNA. Qui, descriviamo un protocollo di PCR di microsfere dettagliare come ssDNA può essere amplificato in modo efficiente e separato da dsDNA semplicemente pipettando da una provetta di reazione di PCR. L'amplificazione di ssDNA può essere applicato come potenziali reagenti per i microarray del DNA e DNA-SELEX (sistematica evoluzione di ligandi di arricchimento esponenziale) processi.
Introduzione
DNA a singola elica (ssDNA) è stato ampiamente considerato come un elemento di riconoscimento molecolare (MRE) grazie alle sue proprietà intrinseche per l'ibridazione DNA-DNA1,2. Lo sviluppo di sistemi sintetici ssDNA può portare ad applicazioni biologiche quali DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostica e molecolare di rilevamento integrato basato su interazioni complementari4,5.
Fin qui, le particelle di polimero di scala micrometrica sono state dimostrate con successo utilizzando dispositivi ....
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Protocollo
1. realizzazione di una piattaforma di Microfluidic PDMS
- Preparare 20 mL di liquido prepolimero PDMS con polimero di base e catalizzatore in un rapporto di volume di 10:1. Versare 10 mL del liquido PDMS su uno stampo SU-8 preparato su un wafer di silicio per la parte superiore della rete microfluidica. Per la parte inferiore piatta, versare lo stesso volume di liquido PDMS sul wafer di silicio senza una struttura di stampo.
Nota: La rete di microfluidica è progettata in un programma CAD e poi convertita in un photomask al fine di fabbricare un master utilizzando il processo di fotolitografia tipico (vedere Figure supplementari). Questo ma....
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Risultati
La piattaforma di fabbricato polimerici microfluidici basati su gocciolina è costituito da due strati PDMS (Figura 1a). Vengono utilizzati tre tipi di reti di canali microfluidici per la generazione di microsfere: geometria 1) flusso di messa a fuoco, come mostrato in Figura 1b, 2) un canale serpeggiante per miscelare la soluzione io e soluzione II e 3) un canale di polimerizzazione per microsfere solidificazione. L'altezza di tu.......
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Discussione
Contaminanti di dsDNA sono un problema importante in ssDNA amplificazione. Rimane difficile minimizzare dsDNA amplificazione in convenzionale di amplificazione in PCR asimmetrica15. Inoltre, anche se miglioramenti tecnici per la generazione di ssDNA hanno permesso di aumentare l'efficienza di rendimento del campione, ssDNA isolamento è ancora problematico a causa di suoi alti costi e rendimenti di depurazione incompleta.
PCR asimmetrica è uno dei più impegnativi metodi .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Ringraziamenti
Questo studio è supportato da un progetto intitolato "programma di ricerca cooperativa per agricoltura Science & Technology Development (progetto n ° PJ0011642) "finanziato dal governo di sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Questa ricerca è stata sostenuta in parte anche da una sovvenzione (NRF-2017R1A2B4012253) del programma di ricerca scienza base attraverso la Fondazione di ricerca nazionale (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT & futuro pianificazione, Repubblica di Corea. Questa ricerca è stata anche sostenuta da una sovvenzione (N0000717) del programma di educazione per creativi e convergenza industriale finanziato dal Ministero del commercio, indu....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| polidimetilsilossano liquido, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Componenti del chip |
| 40% Acrilammide: soluzione bis (19:1) | Bio-rad | 1610140 Componenti dell'oligo-microsfera copolimerizzabile | |
| Persolfato di ammonio, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Indurente di acrilammide:bis soluzione |
| N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiammina, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalizzatore di persolfato di ammonio |
| Olio minerale | Sigma Aldrich | M5904 | Tabella 1. Soluzione III. Componente dei reagenti a microsfera |
| sonde oligonucleotidiche complementari marcate con Cy3 | sintetizzato | da Bioneer | , Tabella 3. Informazioni sulla sequenza |
| Sonda marcata con acridito ssDNA | sintetizzata Bioneer | Tabella | 1. Soluzione I. Componente dei reagenti a microsfere |
| Tris | Biosesang | T1016 | Componenti del tampone TE, soluzione tampone pH |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Componenti del tampone TE, rimozione dello ione (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | Microscopio confocale per amplificazione del DNA |
| Carl Zeiss | LSM 510 | Identificazione dell'esposizione degli oligonucleotidi della superficie della microsfera | |
| Microscopio ottico | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Calcolo del numero di microsfere |
| Termociclatore T100 | Bio-rad | 1861096 | amplificazione del DNA |
| Corona portatile | Electro-Technic | BD-20AC Laboratorio Trattamento Corona Trattamento | idrofilo |
| Piastra riscaldante | Come una | HI-1000 | per l'indurimento di PDMS liquido |
| Pompa a siringa | kd Scientific | 78-1100 | Flusso uniforme del compressore della Soluzione I e della Soluzione II |
| Kohands | KC-250A | Controllo del flusso dell'ematocitometro | |
| a linea chiara | Sigma | Aldrich Z359629 | Calcolo del numero di microsfere |
Riferimenti
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al. Aptabody-aptatop....
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Ristampe e permessi
