Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

Sommario

Questo protocollo descrive calorespirometry, la misura diretta e simultanea di dissipazione di calore e di respirazione, che fornisce un approccio non invasivo per valutare il metabolismo energetico. Questa tecnica è utilizzata per valutare il contributo delle vie sia aerobiche e anaerobiche per l'utilizzazione di energia di monitoraggio del flusso totale di energia cellulare.

Abstract

Molte linee cellulari utilizzate nella ricerca biologica e biomedica di base mantengono l'omeostasi energetica attraverso una combinazione di respirazione sia aerobico che anaerobico. Tuttavia, nella misura in cui sia vie contribuiscono al paesaggio della produzione di energia cellulare è costantemente trascurata. Trasformato le cellule coltivate in saturando i livelli di glucosio spesso mostrano una dipendenza in diminuzione su fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP, che viene compensata da un aumento nella fosforilazione del substrato-livello. Questo spostamento nell'equilibrio metabolico permette alle cellule di proliferare nonostante la presenza di tossine mitocondriali. Trascurando l'alterato equilibrio metabolico delle cellule trasformate, i risultati di uno screening farmaceutico potrebbero essere interpretata erroneamente dal potenzialmente effetti mitotoxic non possono essere rilevati utilizzando modello linee cellulari coltivate in presenza di elevati del glucosio concentrazioni. Questo protocollo descrive l'accoppiamento di due potenti tecniche, manometrica e Calorimetria, che consente la valutazione quantitativa e non invadente dei contributi sia aerobici ed anaerobici per la produzione di ATP cellulare. Respirazioni sia aerobici ed anaerobici generano calore, che può essere monitorato tramite calorimetria. Nel frattempo, la misurazione del tasso di consumo di ossigeno può valutare l'entità della respirazione aerobica. Quando sia la dissipazione di calore e consumo di ossigeno sono misurati simultaneamente, il rapporto di calorespirometric può essere determinato. Il valore ottenuto sperimentalmente può essere confrontato all'equivalente di oxycaloric teorico e nella misura della respirazione anaerobica può essere giudicata. Così, calorespirometry fornisce un metodo unico per analizzare una vasta gamma di domande biologiche, tra cui lo sviluppo di farmaci, la crescita microbica e bioenergetica fondamentale sia in normossia e in condizioni di ipossia.

Introduzione

Nei sistemi biologici, il rilascio di calore o entalpia cambiamento durante il metabolismo è in genere monitorati sia direttamente (tramite diretta calorimetria) o indirettamente tramite il consumo di O₂ e/o produzione di CO₂ (via manometrica). Sfortunatamente, quando queste tecniche sono utilizzate in isolamento, informazioni critiche vengono perse, come il contributo delle vie anaerobiche al metabolismo cellulare. Calorespirometry è una potente tecnica che si basa sulla misurazione simultanea di dissipazione di calore e di respirazione. Calorespirometric lavoro pionieristico studiato il metabolismo anaerobico in cellule di mammiferi co....

Protocollo

1. coltura cellulare

1. Mantenere cellule epatocellulari umane di carcinoma (HepG2) nel mezzo dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e ulteriori substrati (10 millimetri di glucosio, glutammina 2 mM e 1 mM piruvato) a 37 ° C in un'incubatrice di coltura delle cellule (5% CO₂ , aria di 95%, 100% di umidità).
   Nota: Utilizzare la precedente formulazione di DMEM quando DMEM viene fatto riferimento nei passaggi successivi per manometrica e calorimetria.
2. Piastra le cellule a 1 x 10⁶ cellule per piastra di coltura di 100 mm e sottocultura loro ogni 7 giorni o prima di raggiungere confluency ....

Risultati

La riproducibilità delle misurazioni calorespirometric dipende da una preparazione del campione corretto e coerente. Campioni preparati da coltura cellulare non devono essere utilizzati se le piastre sono invasi, come i conteggi delle cellule possono diventare imprecisi a causa di agglutinamento. Inoltre, flussi di calore ridotta a causa della diffusione di substrato limitato nelle cellule ragruppate possono verificarsi. Pertanto, quando si utilizza cellule aderenti, è fondamentale per selezionare un piatto con la conflu.......

Discussione

L'obiettivo di calorespirometry è quello di valutare quantitativamente i contributi dei percorsi aerobici ed anaerobici di attività metabolica e ottenere una vista composta di flusso di energia cellulare. Ciò avviene mediante una misura simultanea di dissipazione del calore e flusso di ossigeno seguita da un confronto tra il rapporto CR calcolato con il teorico oxycaloric equivalente. Diversi passaggi critici devono essere considerate per dati riproducibili e affidabili. Il mantenimento di una cultura sterile cellula san.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule HepG2 Tipo	Americano Collezione di colture	HB-8065	Cellule utilizzate per calorespirometria
O2k-Respirometro	Oroboros Instruments	10022-02	Respirometro
LKB 2277 monitor di attività termica (TAM)	Termometrico AB		Termometrico è stato acquistato da TA Instruments
Piruvato di sodio (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	100x soluzione aggiunta al DMEM medio
Siero fetale bovino - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Aggiunto al 10% nel DMEM medio
Trypsn-EDTA (0,25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Reagente per la dissociazione cellulare
Oligomicina da Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Inibitore mitocondriale
Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazone	Sigma	Aldrich C2920	Disaccoppiatore mitocondriale
Corning 100 mm Piatto di coltura trattato con TC	Corning Corporation	430167	Piatto di coltura tissutale
Glucosio, polvere	Thermofisher Scientific	15023021	Glucosio per DMEM medio
Galattosio, polvere	Fischer Scientific	BP656500	Galattosio per DMEM terreno
L-Glutammina (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutammina per DMEM medio
DMEM, senza glucosio	Thermofisher Scientific	11966025	Terreno per colture cellulari