Un'analisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il potenziale di membrana mitocondriale delle cellule dopo l'esposizione all'ipossia/riossigenazione con o senza un agente protettivo.

Abstract

Tempestivo ed efficace riperfusione dell'arteria coronaria occlusa è la migliore strategia per ridurre la dimensione di infarto del miocardio in pazienti con un segmento ST elevato di infarto miocardico. Tuttavia, riperfusione di per sé può provocare ulteriore del cardiomyocyte, un fenomeno noto come lesione di riperfusione. L'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), con la diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP), o la depolarizzazione mitocondriale, è universalmente riconosciuto come il passaggio finale di riperfusione ed è responsabile mitocondriale e morte dei cardiomiociti. JC-1 è una tintura cationica lipofilica che si accumula in mitocondri a seconda del valore di MMP. Più alto è il MMP, più JC-1 si accumula nei mitocondri. La quantità crescente di JC-1 in mitocondri può essere riflessa da uno spostamento di emissione di fluorescenza da verde (~ 530 nm) al rosso (~ 590 nm). Quindi, la riduzione del rapporto dell'intensità di fluorescenza rosso/verde può indicare la depolarizzazione dei mitocondri. Qui, prendiamo vantaggio di JC-1 per misurare MMP, o l'apertura di mPTP in miociti cardiaci umani dopo ipossia/riossigenazione, rilevato tramite flusso cytometry.

Introduzione

Malattia coronarica è la principale causa di morte in tutto il mondo. Il trattamento della scelta per ridurre la lesione ischemica e limitando la dimensione di infarto in pazienti con ST-segmento elevato l'infarto miocardico è tempestiva ed efficace riperfusione miocardica via primaria intervento coronarico percutaneo (PCI)^{1, 2}. Tuttavia, riperfusione determina danni aggiuntivi, che possono rappresentare fino al 30% della dimensione finale infarto³. È universalmente riconosciuto che il poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP) non è solo centrale nella morte delle cellul....

Protocollo

1. preparazione dei reagenti e soluzioni

1. Preparare il supporto completo di miociti cardiaci umani (HCMs) aggiungendo 25 mL di miscela di supplemento del miocita crescita medio a 500 mL di Medium di crescita del miocita secondo le istruzioni del produttore. Conservare a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.
2. Preparare la soluzione di Tongxinluo (TXL) sciogliendo il polvere ultrafine TXL in privo di siero e glucosio di Dulbecco modificato medio dell'Aquila (DMEM) e regolare la concentrazione di TXL a 400 µ g/mL aggiungendo DMEM (per maggiori dettagli, cfr.¹¹). Conservare a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.
....

Risultati

Prima di eseguire il test di JC-1 per valutare i cambiamenti di MMP, si consiglia vivamente che gli esperimenti condotti per confermare le condizioni correttamente impostato dai ricercatori. Come dimostrano i risultati di citometria a flusso (Figura 2), rispetto al gruppo normale, ipossia/riossigenazione (H/R) significativamente indotta l'apoptosi di HCMs (Annessina V + /PI±), che indica che avevamo stabilito un modello basato su cellule di I / R (± 45.00 2.1.......

Discussione

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il MMP delle cellule dopo essere stati esposti per H/R. rilevato dall'analisi di JC-1, MMP delle cellule è indipendente da fattori quali dimensione mitocondriale, forma e densità che possono influenzare la fluorescenza di singolo-componente segnali di¹⁴. Di conseguenza, i risultati dell'analisi di JC-1 sono relativamente affidabili. Inoltre, è conveniente e risparmio di tempo per eseguire l'analisi di JC-1. Questo test ha un .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit per il saggio del potenziale della membrana mitocondriale con JC-1	Beyodtime, Cina	C2006	Nel kit ci sono JC-1 soluzione madre (200&volte;), tampone di colorazione madre (5&volte;) e CCCP (10mM)
Tongxinluo polvere ultrafine	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Cina	071201
Annexin V-FITC/PI Kit	Becton-Dickinson, USA	556547
DMEM	Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA	11966-025
Miociti cardiaci umani	Promocell, Germania	C-12810
Terreno di crescita dei miociti (SupplementMix)	Promocell, Germania	C-39275
Terreno di crescita dei miociti (pronto all'uso)	Promocell, Germania	C-22070	utilizzato con l'integratore di terreno di crescita dei miocitiMix
GENbox	BioMé rieu, Marcy l' Etoile, Francia	96127	Catalizzatore da 2,5 litri
(AnaeroPack)	MITSUBISHI GAS CHEMICAL  SOCIETÀ, INC., Giappone	Indicatore anaerobico C-1
	BioMé rieu, Marcy l' Etoile, Francia	96118
Citometro a flusso	Becton-Dickinson, USA	FACSAria 2
BD FACSDiva Software	Becton-Dickinson, USA		Versione8.0.1
Provetta per campioni	Corning science, USA	352054	12*75mm
PBS	Hyclone, USA	SH30256.01