Descriviamo un metodo per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in Plasmodium falciparum utilizzando CRISPR/Cas9 editing genomico.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malaria è una causa significativa della morbosità e della mortalità in tutto il mondo. Questa malattia, che colpisce soprattutto coloro che vivono nelle regioni tropicali e subtropicali, è causata da infezione con parassiti del plasmodio . Lo sviluppo di farmaci più efficaci per combattere la malaria può essere accelerato da migliorare la nostra comprensione della biologia di questo parassita complesso. Manipolazione genetica di questi parassiti è la chiave per comprendere la loro biologia; Tuttavia, il genoma del p. falciparum è storicamente difficile da manipolare. Recentemente, è stato utilizzato CRISPR/Cas9 editing genomico in parassiti della malaria, consentendo per la proteina più semplice tagging, generazione di atterramenti proteina condizionale e delezione dei geni. L'editing genomico CRISPR/Cas9 ha dimostrato di essere un potente strumento per far progredire il campo della ricerca sulla malaria. Qui, descriviamo un metodo CRISPR/Cas9 per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in p. falciparum. Questo metodo è altamente adattabile ad altri tipi di manipolazioni genetiche, tra cui proteine tagging e knockout del gene.
Introduzione
La malaria è una malattia devastante causata da protozoi parassiti del genere Plasmodium. P. falciparum, il parassita della malaria umana mortale la maggior parte, provoca circa 445.000 morti all'anno, principalmente in bambini sotto l'età di cinque1. Parassiti del plasmodio hanno un ciclo di vita intricato che coinvolgono un vettore zanzara e un ospite vertebrato. Gli esseri umani in primo luogo essere infettati quando una zanzara infetta prende un pasto di sangue. Quindi, il parassita invade il fegato dove cresce, si sviluppa e si divide per circa una settimana. Dopo questo processo, i parassiti vengono rilasciati n....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Continua cultura di p. falciparum richiede l'uso di globuli rossi umani, e abbiamo utilizzato commercialmente acquistato unità di sangue che sono stati spogliati di tutti gli identificatori e resi anonimi. L'Institutional Review Board e l'ufficio di biosicurezza presso l'Università della Georgia esaminato i nostri protocolli e approvato tutti i protocolli utilizzati nel nostro laboratorio.
1. scegliere una gRNA sequenza
- Vai a CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) e seleziona ' Fasta Target'. Sotto 'Target', incollare le 200 coppie di basi dall'estremità 3' dell'open reading frame (ORF) di un gene e 200 ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Uno schema dei plasmidi utilizzati in questo metodo, così come un esempio di una mutazione di scudo sono mostrati nella Figura 1. Come un esempio di come identificare parassiti mutanti dopo trasfezione, risultati da PCRs per controllo integrazione del costruttoglmS ettari - sono riportati in Figura 2. Un'immagine rappresentativa di una piastra di clonazione è illustrata nella Figura 3 per di.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'implementazione di CRISPR/Cas9 a p. falciparum ha aumentato l'efficienza di sia diminuito la quantità di tempo necessario per la modifica del genoma del parassita, rispetto ai precedenti metodi di manipolazione genetica. Questo protocollo completo vengono delineati i passaggi necessari per la generazione di mutanti condizionali utilizzando CRISPR/Cas9 a p. falciparum. Mentre il metodo qui è orientato in modo specifico per la generazione di ettari -glmS mutanti, questa strategia può essere ada.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Muthugapatti Kandasamy presso il nucleo di microscopia biomedica Università della Georgia (UGA) per l'assistenza tecnica e Jose-Juan Lopez-Rubio per aver condiviso i plasmidi pUF1-Cas9 e pL6. Quest'opera è stata sostenuta da archi Foundation Award di D.W.C. e di H.M.K., concede fondi avvio UGA di V.M., sovvenzioni da marzo di Dimes Foundation (Basil o ' Connor Starter Scholar Research Award) di V.M. e US National Institutes of Health (R00AI099156 e R01AI130139) di V.M. e (T32AI060546) a H.M.K.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | Compriamo quelli che sono confezionati singolarmente |
| Acetato di sodio | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Regalo da Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parassitolo. 2011 177:29-34 | |
| Piastre per colture tissutali TPP a 6 pozzetti | MIDSCI | TP92006 | |
| Piastre per colture tissutali TPP da 100 mm (piastra da 12 mL) | Piastre per | ||
| TPP a 96 pozzetti | MIDSCI | TP92096 | |
| Piastre per colture tissutali TPP a 24 pozzetti | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | ||
| T4 DNA Polimerasi | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Unità di filtro per flacone Steritop | Millipore | SCGPU10RE | Puoi utilizzare qualsiasi dimensione che si adatti alle tue esigenze |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generato dal Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generato dal Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Dono dal laboratorio Jose-Juan Lopez-Rubio | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Ipoxantina | Sigma-Aldrich | H9636-25G | |
| Reagente gentamicina | Gibco | 15710-064 | |
| Timidina | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generato dal Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generato dal Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel e PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | Ti consigliamo di provare alcuni lotti per scoprire in cosa cresceranno i parassiti nel miglior |
| di globuli rossi umani | Interstate Blood Bank, Inc | Invia un'e-mail o chiamali direttamente per ordinare | Di solito utilizziamo |
| linea di parassiti O+ blood 3D7 | Disponibile su richiesta | N/A | |
| Brodo di lisogenia (LB) | Fisher | BP1426-2 | Puoi fare il tuo, non è necessario utilizzare esattamente questo |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | Facciamo un brodo 1000X a 100 mg / ml in acqua e immagazziniamo nel -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University a St. Louis | È possibile utilizzare il controllo di caricamento preferito per i western blot. Questo è solo quello che usiamo nel nostro laboratorio |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonale | Prodotto da Roche, venduto da Sigma | 11867423001 | Puoi usare il tuo anticorpo anti-HA preferito |
| Provette da 0,6 mL | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOLLO* Hema 3* Sistema di colorazione manuale (Fissativo+Soluzione I e II) | Fisher | 22-122-911 | Puoi anche usare il colorante |
| giemsaVetrini per microscopio smerigliati di alta qualità Fisherfines - Dimensioni: 3 x 1 in. | Pescatore | 12-544-3 |
Riferimenti
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
