Qui, vi mostriamo come utilizzare un dosaggio di legatura di prossimità (PLA) per visualizzare MST1/MST2 eterodimerizzazione in celle fisse con alta sensibilità.
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Articolo metodologico
Rilevamento di eterodimerizzazione di isoforme della proteina usando un'analisi in Situ vicinanza legatura
In questo articolo
Sommario
Abstract
Interazioni proteina-proteina regolamentati sono un principio guida per molti eventi di segnale, e l'individuazione di tali eventi è un elemento importante nella comprensione di come tali percorsi sono organizzati e come funzionano. Ci sono molti metodi per rilevare le interazioni proteina-proteina in cellule, ma relativamente pochi può essere utilizzati per rilevare le interazioni tra proteine endogene. Uno di questi metodi, il dosaggio di legatura di prossimità (PLA), ha diversi vantaggi per raccomandare l'uso. Rispetto ad altri comuni metodi di analisi di interazione proteina-proteina, PLA ha relativamente alta sensibilità e specificità, possa essere eseguita con la manipolazione di cellule minimal e, nel protocollo descritto nel presente documento, richiede solo due target-specifici anticorpi derivati da specie diverse (ad es., da topo e coniglio) e un reagente specializzato: un set di anticorpi secondari che sono oligonucleotidi covalentemente legati a specifiche che, quando ha portato in prossimità di un altro, creare un amplificabile piattaforma per in situ PCR o rotolamento dell'amplificazione del cerchio. In questa presentazione, mostreremo come applicare la tecnica PLA per visualizzare le modifiche in prossimità di MST1 e MST2 nelle celle fisse. La tecnica descritta in questo manoscritto è particolarmente applicabile per l'analisi di studi di segnalazione delle cellule.
Introduzione
Rottura di MST1/Hippo segnalazione è stata collegata a disturbi dello sviluppo e carcinogenesi1. Nei mammiferi, attivano le chinasi MST1 e MST2 (fosforilare) MOB1 e LATS1/2, il secondo dei quali poi fosforila ed inattiva co-l'attivatore trascrizionale Yes-associated protein (YAP)2. Nella sua forma attiva (unphosphorylated), YAP ha attività oncogena, migliorando la trascrizione dei geni di proliferazione delle cellule; al contrario, quando YAP è inattivato dalla via del Hippo, è soppressa la proliferazione cellulare e apoptosi promosso3. Nei tessuti, MST1 e MST2 esiste principalmente come attivo om....
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Protocollo
1. preparazione delle soluzioni
- Preparare soluzione fissante: paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS 1X. Per 10ml, prendere 2,5 mL di 16% PFA e aggiungere 7,5 mL di PBS 1X.
Pericoli: PFA è cancerogeno a basse dosi. Fumi e contatto con la pelle sono pericolosi. Conservare a-20 ° C. - Preparare la soluzione di permeabilizzazione: 0,1% Triton X-100 in PBS 1X. Per 100 mL di soluzione, aggiungere 100 µ l di Triton X-100 in 100 mL di 1X PBS. Conservare a temperatura ambiente (TA).
- Preparare il tampone di lavaggio: 1 x TBST. Per 1 L, prendere 100 mL di 10 x TBS, 890 mL di dH2O e 10 mL di Tween 20 (10%).
- Prepara....
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Risultati
Abbiamo usato l'analisi PLA per testare l'interazione tra MST1 e MST2 in HEK-293 e integrazione socio-sanitaria. Le cellule erano fissi, permeabilizzate e macchiate con vari anticorpi, seguiti dall'amplificazione in situ secondo il protocollo PLA (Figura 1). Per documentare il livello di MST1/MST2 eterodimerizzazione, le cellule sono state macchiate con gli anticorpi MST1 e MST2 (Figura 1A, 1C e 1 G). Co.......
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Discussione
Abbiamo trovato utile utilizzare vetrini camera per questo esperimento, come è molto conveniente eseguire l'esperimento con diverse linee di cellule (14-16) e non c'è nessuna necessità di cambiare il campione ogni volta durante l'analisi in microscopia. Alcune complicazioni possono sorgere, ad esempio un aumentato rischio di contaminazione incrociata con gli anticorpi. Pertanto, consigliamo di lavare ogni pozzetto singolarmente anziché utilizzare una vaschetta di Coplin, nonostante l'aumento della durata dell'esperimento.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'intero laboratorio Chernoff per contribuire alla ottimizzazione e convalida del presente protocollo, in particolare Maria Radu e Galina Semenova. Ringraziamo anche Andrey Efimov della struttura cellulare Imaging presso il Fox Chase Cancer Center. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal NIH (R01 CA148805) a JC.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini da camera | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 pozzetti, vetrino in vetro |
| Sonda PLA Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contiene 1x soluzione bloccante, 1x diluente anticorpale |
| Sonda PLA Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contiene 1x soluzione bloccante, 1x diluente anticorpale |
| Tamponi di lavaggio, flurescenza | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contiene il tampone di lavaggio A e il mezzo di montaggio del tampone di lavaggio B |
| reagenti di rilevamento | Sigma-Aldrich DUO82040 | Rosso Sigma-Aldrich DUO92008 contiene 5x legatura, 1x ligasi, 5x rosso di amlificazione, 1x polimerasi | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Segnalazione | cellulare | 9102s | |
| Segnalazione | 5726s | pERK anticorpo | |
| MST2 anticorpo | Segnalazione cellulare | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 anticorpo |
| 16% Paraformaldeide | Microscopia elettronica scienze | 15710 | Diluire al 4% PFA in PBS per soluzione di fissaggio |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | Per preparare Triton x-100 allo 0,1% in 1xPBS per la soluzione di permeabilizzazione |
| Microscopia confocale | Leica TCS SP8, 63x | Analisi delle immagini con il software ImageJ |
Riferimenti
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J.
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Ristampe e permessi
