Articolo metodologico

Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

DOI:

10.3791/57758

⸱

1 giugno 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per spazialmente e temporalmente valutare la presenza del microbiota praticabile nelle viscere di segno di spunta utilizzando un approccio modificato intero-monta l'ibridazione in situ.

Abstract

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Malattie infettive trasmesse da artropodi vettori continuano a costituire una grave minaccia per la salute umana in tutto il mondo. Gli agenti patogeni che causano queste malattie, non esistono in isolamento quando essi colonizzano il vettore; piuttosto, essi probabilmente impegnarsi nelle interazioni con microrganismi residenti nel lume dell'intestino. Il microbiota di vettore ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella trasmissione di patogeni per parecchie malattie trasmesse da vettori. Se i batteri residenti nell'intestino della zecca Ixodes scapularis , il vettore di agenti patogeni umani diversi tra cui burgdorferi di Borrelia, influenzano trasmissione di graduazione degli agenti patogeni non è determinato. Abbiamo bisogno di metodi per caratterizzare la composizione dei batteri associati con l'intestino di graduazione per agevolare una migliore comprensione delle interazioni potenziali interspecie nell'intestino tick. Utilizzo intero-monta in situ ibridazione di visualizzare trascrizioni del RNA associate a particolari specie batteriche consente la raccolta dei dati qualitativi per quanto riguarda l'abbondanza e la distribuzione del microbiota in tessuto intatto. Questa tecnica può essere utilizzata per esaminare le modifiche il milieu di microbiota dell'intestino nel corso del tick alimentazione e può essere applicata anche per analizzare l'espressione dei geni di segni di graduazione. Macchiatura di zecca tutta budella informazioni rendimento lorda distribuzione spaziale del target RNA nel tessuto senza la necessità di ricostruzione tridimensionale e risente meno di contaminazione ambientale, che spesso confonde il sequenziamento-based Metodi frequentemente utilizzati per lo studio di comunità microbiche complesse. Nel complesso, questa tecnica è uno strumento prezioso che può essere utilizzato per meglio capire vettoriale-patogeno-microbiota interazioni e il loro ruolo nella trasmissione della malattia.

Introduzione

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Gli agenti patogeni umani e bestiame, trasmessi da artropodi vettori si trovano in tutto il mondo e rappresentano circa il 20% delle malattie infettive a livello globale1, ma efficace e sicuro vaccini contro la maggior parte di questi agenti patogeni non sono disponibili. Nostra comprensione dell'importanza del ruolo dei microrganismi commensali, simbiotici e patogeni, conosciuti collettivamente come il microbioma2, modulante e plasmare la salute di quasi tutti i metazoi3 si sta espandendo. Ora è evidente che anche Porto di artropodi vettori di agenti patogeni microbiota dell'intestino e questi microbiota vettoriale-collegata hanno dimostrato di influenzare diversi agenti patogeni vettore4,5. Il microbioma dell'artropodo è composto di eubatteri, archaea, virus e microbi eucarioti come protozoi, nematodi e funghi6. Tuttavia, il focus della ricerca predominante è stato il eubatteri dovuta, in parte, alla disponibilità di geni marcatori e banche dati di riferimento per identificare i membri batterici specifici.

Con un focus su Ixodes scapularis, tick vettoriale di agenti patogeni umani multipli compreso Borrelia burgdorferi7, l'agente eziologico della malattia di Lyme, l'ottimizzazione di una tecnica di visualizzazione microbica mirava a miglioramento della nostra comprensione del microbiota dell'intestino tick nel contesto delle interazioni di vettore-patogeno. Parecchie domande rimangono da risolvere nel campo microbiome tick. L'intestino è il sito del primo incontro esteso tra il segno di spunta e l'agente patogeno in arrivo nel contesto degli agenti patogeni orizzontalmente trasferiti; Pertanto, la comprensione del ruolo del microbiota dell'intestino vettoriale nel modulare le interazioni di vettore-patogeno rivelerà significativi approfondimenti. Le zecche hanno una modalità unica di digestione del pasto di sangue, dove l'elaborazione del pasto di sangue componenti prende posto intracellulare8. Lume dell'intestino apparentemente serve come recipiente per contenere il pasto di sangue come i feed di tick, e assimilazione e digestione nutriente derivarne durante i diversi giorni di alimentazione e continuare post replezione. Gli agenti patogeni acquisiti dal segno di spunta durante l'alimentazione Inserisci lume dell'intestino con le farine di sangue e il lume diventa così un sito primario delle interazioni tra il tick, agente patogeno e microbiota residente. Come digestione procede attraverso la replezione e zecche Ixodidae molting, intestino subisce modificazioni strutturali e funzionali9. È anche probabile che variano in concerto con il milieu di intestino cambiando la composizione e l'organizzazione spaziale dei batteri dell'intestino. Pertanto, è importante capire l'architettura di batteri residenti nell'intestino tick per comprendere appieno l'interazione di tick, agente patogeno e microbiota dell'intestino.

Tecniche molecolari per descrivere il microbiota host associato abitualmente utilizzano high throughput sequenziamento parallelo strategie10 per amplificare e sequenza DNA ribosomal 16S batterica (rDNA). Queste strategie di sequenziamento eludere la necessità di ottenere colture axeniche di batteri specifici e forniscono una descrizione approfondita di tutti i membri batterici rappresentata nel campione. Tuttavia, tali strategie sono confusi dall'incapacità di distinguere contaminazioni ambientali da residenti di bona fide . Ulteriormente, quando valutare i campioni, come le zecche, che sono di piccole dimensioni e quindi contengono DNA microbiota-specific basso cede, la probabilità di amplificazione di contaminanti ambientali è aumentato11 e risultati nell'interpretazione ambigua della microbioma composizione. Caratterizzazione funzionale in combinazione con la visualizzazione di specifici batteri vitali, pertanto, sarà fondamentale per definire e discernere il microbioma del battito temporalmente e spazialmente. Verso questo obiettivo, abbiamo approfittato dell'intero-monta RNA in situ ibridazione. Questa tecnica è usata ordinariamente per valutare il pattern di espressione genica in organi ed embrioni12,13,14 e permette l'analisi semiquantitativa dell'espressione sopra l'intero campione di interesse. Questo comportamento differisce da tecniche tradizionali in situ di ibridazione che utilizzano sezioni di tessuto e spesso richiedono un'approfondita analisi di materiale sezionato con un assembly computazionale per predire l'espressione in organi interi15. Mentre intero-monta si riferisce generalmente a interi organismi12, qui intero-monta si riferisce all'intero fegato o organi. I vantaggi di utilizzare l'intero-monta RNA in situ ibridazione approccio per valutare l'architettura del microbiota dell'intestino tick sono molteplici. L'intestino di graduazione è composto da 7 paia di diverticoli, ogni coppia variano in dimensione16. Le differenze funzionali, se qualcuno, tra questi diverticoli, non sono compresi nell'ambito della biologia di tick, tick interazioni microbiota o tick-patogeno. Manipolazioni dell'intestino che rompersi i diverticoli intestino sarebbero spostare il microbiota presente nel lume dell'intestino o quelle associate senza bloccare l'intestino e il risultato in un'interpretazione errata della localizzazione spaziale del microbiota. Fluorescenza-identificato RNA in situ ibridazione è stata utilizzata in precedenza per esaminare tick gut trascrizioni17 fissando e diverticoli intestino individuali per garantire l'ibridazione della sonda e per localizzare b. burgdorferi di apertura trascrizioni sezionando paraffina tutta zecche18. Entrambi questi approcci richiedono manipolazioni dei tessuti tick prima dell'ibridazione che interesserebbero l'architettura del microbiota intestinale.

In questo rapporto, descriviamo in dettaglio il protocollo per esaminare il battito vitale microbiota dell'intestino intero-monta in situ ibridazione (WMISH). L'uso dell'intero-monta RNA in situ ibridazione consente una comprensione globale della presenza e abbondanza di batteri dell'intestino specifici nelle diverse regioni dell'intestino e può stimolare nuove intuizioni biologia di intestino tick nel contesto della colonizzazione del patogeno e trasmissione. Ulteriormente, l'uso di sonde di RNA nei confronti di specifico RNA batterico permette la rilevazione di batteri vitali nell'intestino tick.

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Protocollo

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1. preparazione di modelli del DNA

  1. Scarica la sequenza del rRNA 16S specifica ad ogni generi batterica dal NCBI database e progettazione catena della polimerasi (PCR) compatibile avanti e reverse primer che amplificheranno generi specifiche regioni (~ 200-250 base-accoppiamenti lungo) come descritto in precedenza 19. riferirsi alle risorse open source database SILVA20,21 e probeBase22 online per sonde del oligonucleotide rRNA-mirati e primer, come le sonde del RNA per alcuni generi batterici possono essere commercialmente disponibili.
    Nota: È importante selezionare regioni del gene che sono specifici per specifici generi e garantire che gli iniettori progettati non amplificare generi correlati batterici. Questo è fondamentale per ottenere l'ibridazione sonda gene/generi-specific.
  2. Mangime, zecche per 24, 48 o 72 h sui topi, sezionare budella tick e preparare il RNA e cDNA da budella di graduazione come descritto precedente23. CDNA di uso come modello per PCR amplificano ampliconi di generi specifici utilizzando un termociclatore. Eseguire un'aliquota del PCR-prodotto/amplicon su gel di agarosio 1.5% e confermare che l'amplicone corrisponde al formato previsto da visualizzazione sotto la luce ultravioletta (UV) usando un gel del sistema di imaging.
  3. Clonare l'amplicone di RNA ribosomiale batterica 16S di interesse in un vettore di TA commercialmente disponibile (Tabella materiali) contenenti promotori RNA polimerasi adatti a polimerasi del batteriofago (SP6, T7 o T3). Sequenza i cloni per confermare l'identità del amplicon e la direzionalità del clone con riferimento a ciascuno dei promotori. Su questa base, determinare il promotore di scelta per generare senso o RNA antisenso sonde (Figura 1).
  4. Linearizzare 1 mg del plasmide con un enzima di restrizione appropriato in un volume di reazione di fino a 30 µLfor 2 ore a temperature consigliate dal produttore. Scegliere gli enzimi di restrizione basati sul promotore che sarà utilizzato per generare il senso o la sonda antisenso (Figura 1). Verificare linearizzazione di visualizzazione di 2 µ l di reazione digest su gel di agarosio 1%.
  5. Purificare i restanti 28 µ l di DNA digerito utilizzando un kit di purificazione di PCR prodotto colonna disponibile in commercio e quantificare la concentrazione di DNA mediante lo spettrofotometro.
    Nota: Alcune sonde di senso possono causare una colorazione di fondo molto superiore la sonda antisenso corrispondente e potrebbero essere necessario essere esplorato altre opzioni. Controlli negativi alternativi includono plasmidi codifica di sequenze non rappresentati nel campione ovvero un'altra sonda che produce un modello distintivo di ibridazione.

2. costruzione di sonde del RNA Digoxygenin-UTP

  1. Preparare la miscela del nucleotide combinando 7,5 µ l di 100 mM UTP, 25 µ l di 10 mM digoxygenin-UTP e 10 μl di 100mm ATP e GTP CTP in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
  2. Eseguire la trascrizione in vitro utilizzando kit di polimerasi T7 o Sp6 RNA commercialmente disponibili, con 1 µ l della miscela del nucleotide (punto 2.1) e 0,25 - 1 µ g di DNA del modello. Portare il volume fino a 20 µ l con acqua. Scorri il tubo per combinare e impulsi spin. Incubare a 37 ° C per 2,5-3 ore.
    Nota: La sonda costruzione ha avuto successo con plasmide digerito concentrazioni basse quanto 7 ng / µ l, ma le concentrazioni tipiche in questa fascia di passaggio da 15-25 ng / µ l. La reazione di trascrizione può essere incubata anche durante la notte a 37 ° C, ma questo non aumenta significativamente il rendimento di RNA.
  3. Aggiungere 1 µ l di dnasi (2.000 unità / µ l) e incubare a 37 ° C per 10 min. Non superare i 10 minuti, o l'enzima può iniziare a degradare il RNA.
  4. Aggiungere 30 µ l di cloruro di litio ghiacciata 7,5-8 M e 30 µ l di acqua refrigerata senza nucleasi a precipitare il RNA. Scorri il tubo per mescolare. Consentire la precipitazione di RNA di procedere durante la notte a-20 ° C.
  5. Raccogliere RNA mediante centrifugazione a 17.000 x g per 20 min a 4 ° C. Lavare la pallina una volta con 1 mL di etanolo di 75% preparata in dietil pirocarbonato (DEPC) acqua, quindi ripetere la centrifugazione.
  6. Rimuovere e scartare il surnatante, capovolgere la provetta su una salvietta di carta pulita e lasciare per asciugare per 10 min. Risospendere il pellet in acqua priva di nucleasi. Se la pallina è facilmente visibile, risospendere in 25 µ l. Se il pellet è molto piccolo o non visibile, risospendere in 15-20 µ l. ottenere una stima della concentrazione di RNA mediante lo spettrofotometro.
    Note: Intervallo di concentrazioni di RNA tipiche da 200-500 ng / µ l.

3. visualizzazione di RNA sonde tramite l'elettroforesi del Gel di formaldeide di RNA per valutare la purezza di RNA

Attenzione: Formaldeide pone un pericolo di inalazione; di conseguenza, generare le soluzioni necessarie per l'analisi di gel di RNA in una cappa aspirante. Il bromuro di etidio è un sospetto cancerogeno; maneggiare con cura.

  1. Preparare un gel di agarosio 1% formaldeide come precedentemente descritto24 e ghisa il gel in una scatola di gel libera delle RNasi. Una volta fredda, riempire la vaschetta del gel con 1x tampone (1 x MOPS a pH 7,0, 5% formaldeide) di corsa.
  2. Preparare il tampone del campione (bromuro di etidio 400 mg/mL 5 µ l, 20 µ l 10 x MOPS, 35 formaldeide µ l e 100 µ l formammide). Combinare 2 µ l di sonda RNA (passo 2.6) con 8 µ l di Sample Buffer. Incubare a 70 ° C per 10 min.
  3. Preparare Buffer di caricamento del RNA dalla combinazione di glicerolo al 50% 5ml, formaldeide al 10% 1 mL, blu di bromofenolo 40 mg, 40 mg xilene cianolo e 20 µ l di EDTA 0.5 M (pH 7.5). Dopo l'uso, conservare questo buffer a-20 ° C.
  4. Aggiungere 3 µ l di tampone di caricamento per il campione di RNA da passo 3.2 e mescolare. Mantenere le provette dei campioni su ghiaccio.
  5. Caricare il volume del campione intero dal passo 3.4 nel gel. Caricare un'aliquota della scaletta di RNA singolo-incagliato a fianco per verificare la dimensione del RNA. Esegua il gel a 100 V o inferiore fino a quando il colorante blu migra circa il 75% di strada lungo il gel. Visualizzare il RNA sotto luce UV utilizza un sistema di imaging del gel.
    Nota: Una sonda del RNA di buona qualità dovrebbe apparire come una fascia discreta con una mobilità corrispondente alla dimensione prevista della sonda (Figura 2, corsia 1). Se la sonda viene visualizzato come una banda diffusa e untuosa (Figura 2lane 2) questo non dovrebbe essere usato.

4. spuntare Gut accumulazione e fissazione

  1. Raccogliere Ixodes scapularis ninfe che sono alimentati sui topi per i punti di tempo di interesse.
    Nota: Ai fini di questa tecnica, le zecche alimentati per 48 o 72 h lavoro meglio.
  2. Sezionare l'intestino dal segno di spunta in MEMFA (tabella 1) su un vetrino con un microscopio di dissezione, evitando di danneggiare l'organo per quanto possibile. Inserire un segno di spunta su un vetrino pulito in 20-30 µ l di MEMFA. Usando un paio di sterile alto tenore di carbonio acciaio rasoio lama #11 fetta regione capa a scuto della zecca lasciando il corpo della zecca. Premere delicatamente il corpo per spingere i diverticoli dell'intestino e delle ghiandole salivari fuori la cuticola del corpo. Separare le ghiandole salivari e nell'intestino e scoop il coraggio della lama di rasoio.
  3. Raccogliere le budella in una provetta da 1,5 mL contenente 500 µ l MEMFA. Incubare la provetta a temperatura ambiente con dolce dondolo per 1 h o durante la notte a 4 ° C.
    Nota: Ghiandole salivari Tick anche sezionate e similmente determinazione e possono essere macchiate.
  4. Disidratare il tessuto lavando delicatamente 3 volte con 1 mL di etanolo al 100% ghiacciata. Lasciate che le budella affondare naturalmente verso il basso del tubo tra ogni lavaggio, centrifugazione potrebbe danneggiare il tessuto. Per l'archiviazione a lungo termine, mantenere i campioni in etanolo al 100% a-20 ° C.

5. costruzione di maglia campione cesti e Portacesto 24 pozzetti

  1. Tagliare i fondi al largo di 2 mL o 5 mL provette da centrifuga snap-top utilizzando una lama di rasoio taglio singolo riscaldata su un bisturi.
    Attenzione: La lama potrebbe essere necessario essere riscaldato più volte prima che venga completato il taglio.
  2. Tagliare quadrati di una maglia di nylon 110 µm leggermente più grande apertura del nuovo. Bond la maglia alla parte inferiore del tubo premendo loro insieme leggermente su un piatto caldo su fuoco medio-basso finché non viene effettuata una buona tenuta. Lasciate raffreddare, assicurarsi che non ci siano lacune tra la maglia e il tubo e tagliare l'eccesso rete intorno ai bordi.
  3. Tagliare fori presenti sul coperchio di una piastra a 24 pozzetti, tale che il labbro del cestello campione fatto nel passo 5.2 siederà al foro e non cadere attraverso, producendo un set-up dove le parti inferiori dei cestelli campione siederà tutto nei pozzetti quando essi sono posti nella fori nella copertura.
  4. Utilizzare questo supporto cesto montato per trasferire cestini da un piatto a altro con relativa facilità per l'intero il protocollo di ibridazione in situ . Utilizzare due piastre da 24 pozzetti in modo che mentre si sta verificando una incubazione, l'altra piastra è pronta per il lavaggio successivo.

6. ibridazione in Situ : giorno 1 (Timing: 4-5 h)

  1. Coraggio di trasferimento di etichettato cesti di campione, separati da condizione sperimentale e inteso sonda del RNA.
    Nota: Macchia almeno 5 budella a condizione per influenzare la variazione naturale tra repliche.
  2. Reidratare i campioni delicatamente per evitare di introdurre bolle d'aria nel tessuto aumentando gradualmente il rapporto di tampone fosfato salino con 0,1% tensioattivi non ionici (PTw; Tabella 1) di etanolo nei lavaggi.
    Nota: Completare tutti i lavaggi nel supporto cesto 24 pozzetti a temperatura ambiente con agitazione delicata se non specificato diversamente. Aliquota di 500-600 µ l di soluzioni di lavaggio in ogni pozzetto del titolare tali che il coraggio in ogni cestino è completamente sommerse. Preparare tutte le soluzioni con acqua trattata con DEPC per evitare la degradazione del RNA.
    1. Lavare i campioni per 5 min in etanolo al 100% 500 µ l.
    2. Preparare almeno 500 µ l per cesto campione del 75%, 50% e 25% di etanolo in PTw. reidratare i campioni di lavaggio per 5 min in ogni soluzione di etanolo, lo spostamento dalla più alta concentrazione di etanolo al più basso.
    3. Lavare i campioni 4 volte per 5 minuti ciascuno in PTw.
  3. Permeabilize i campioni con proteinasi K (10 µ g/mL) in PTw per 5 min.
  4. Preparare il tessuto per l'ibridazione con le sonde del RNA.
    1. Lavare i campioni due volte come descritto al punto 6.2 nel supporto cesto 24 pozzetti a temperatura ambiente con agitazione delicata per 5 minuti ciascuno, in 500 µ l di tampone di trietanolammina (0,1 M, pH 7,0-8,0) (tabella 1) per mantenere i campioni in un ambiente privo di ammine.
    2. Trattare i campioni due volte con 500 µ l 0,25% l'anidride acetica nel buffer di trietanolammina (0,1 M, pH 7,0-8,0) per 5 minuti ciascuno, quindi lavare i campioni due volte in PTw per 5 minuti ciascuno.
      Nota: L'anidride acetica acetila gratis ammine per neutralizzare la carica positiva, che è fondamentale per evitare interazioni elettrostatiche non specifici e garantire l'associazione specifica della sonda e mRNA.
    3. Difficoltà le budella per 20 min con paraformaldeide al 4% a 500 µ l di PTw, quindi lavare 5 volte in PTw per 5 minuti ciascuno.
    4. Prehybridize incubando i campioni in 500 µ l ibridazione buffer /in titolare del cestino 24 pozzetti della piastra ben 24 (tabella 1) per 1,5-2,5 ore a 60 ° C con agitazione delicata in un bagnomaria con agitazione. Salvare il tampone di ibridazione utilizzato per il passaggio di prehybridization per riutilizzare nel giorno 2 protocollo (punto 7.1).
    5. Preparare soluzioni di ibridazione sonda diluendo le sonde del RNA in tampone di ibridazione ad una concentrazione finale di 1 µ g/mL.  Incubare i campioni con soluzioni di ibridazione sonda nel supporto cesto 24 pozzetti a 60 ° C con agitazione delicata durante la notte in un bagnomaria con agitazione (tabella 2). Coprire la piastra che trasportano il cestello porta comodamente con carta stagnola per evitare l'evaporazione della soluzione di ibridazione.

7. ibridazione in Situ : giorno 2 (Timing: 4.5-5.5 h)

  1. Rimuovere i campioni dalle soluzioni di ibridazione della sonda e inserirli nel tampone di ibridazione riservati dal giorno precedente. Incubare a 60 ° C con agitazione delicata per 3 min.
    Nota: Sonda di ibridazione soluzioni possono essere conservati a-20 ° C per il riutilizzo fino a 3 volte.
  2. Preparare 2 x tampone salino-sodio citrato (SSC) diluendo 20 x SSC in acqua trattata con DEPC (tabella 1). Lavare i campioni due volte per 3 min con 2 x SSC, poi 3 volte per 20 min con 2 x SSC a 60 ° C per rimuovere tutte le tracce della sonda e tampone di ibridizzazione.
  3. Trattamento con RNasi A (20 µ g/mL) e RNasi T1 (10 µ g/mL) in 2X SSC per 30 min a 37 ° C per rimuovere singolo incagliato sonda RNA che rappresenta gratis RNA non ibridate.
  4. Lavare una volta con 2 x SSC per 10 min a temperatura ambiente. Preparare 0.2 x SSC di diluizione 2 x SSC in acqua trattata con DEPC, poi lavare due volte con 0,2 x SSC per 30 min a 60 ° C per rimuovere l'eccesso RNasi.
  5. Lavare due volte con 500 µ l di tampone di acido maleico (MAB; Tabella 1) per 10 min.
  6. Incubare i campioni con soluzione (2% di Reagente Bloccante in MAB) per 1,5-2 h di blocco.
    Nota: Il reagente bloccante può essere difficile da sciogliere; riscaldamento delicato aiuta la dissoluzione.
  7. Sostituire la soluzione bloccante con anti-digossigenina alcalino fosfatasi-coniugata 500 µ l di anticorpo ad una diluizione di 1:3,000 nella soluzione di blocco e incubare a temperatura ambiente per circa 4 h o a 4 ° C durante la notte.

8. ibridazione in Situ : giorno 3 (Timing: 6 h a tutta la notte)

  1. Lavare i campioni almeno 5 volte per 30 minuti ciascuno, con 500 µ l MAB per rimuovere l'anticorpo in eccesso.
    Nota: Questi lavaggi sono flessibili e possono essere prorogate per 1-2 h, o 3-4 lavaggi possono essere sostituiti per un lavaggio overnight a 4 ° C con un impatto minimo sull'efficacia.
  2. Lavare due volte per 5 min con tampone di fosfatasi alcalina pH 9.5 (buffer di AP; Tabella 1).
  3. Iniziare la reazione di colore, sostituendo l'ultimo lavaggio con 500 µ l di substrato cromogenico per la fosfatasi alcalina (Tabella materiali). Coprire la piastra campione con carta stagnola e lasciare che la macchiatura procedere a temperatura ambiente per 3 - 5 h o overnight a 4 ° C. Monitorare la reazione di macchiatura periodicamente esaminando il tessuto al microscopio per dissezione per evitare overstaining.
    Nota: Quando la colorazione è completa, una tinta viola è rilevabile dall'occhio nei campioni antisenso-sondato al microscopio, ma il tessuto non dovrebbe essere consentito di diventare molto scuro. La macchiatura procede molto lentamente a 4 ° C e può richiedere fino a 20-24 h.
  4. Arrestare la reazione al colore di lavaggio per 5 min in 500 µ l MAB, quindi fissare il tessuto durante la notte nella soluzione di Bouin.
    Attenzione: Maneggiare soluzione di Bouin in una cappa; è un agente cancerogeno corrosivo.

9. ibridazione in Situ : giorno 4 (Timing: 3-3.5 h)

  1. Preparare almeno 7 mL per cesto di campione di 1 x SSC di diluire 20 x SSC in acqua trattata con DEPC. Rimuovere la soluzione di Bouin lavando i campioni 4 a 6 volte con etanolo al 70% in 1 x SSC fino a quando il tessuto non è più giallo.
  2. Preparare 500 µ l per cesto di campione di 75%, 50% e 25% soluzioni di etanolo in 1 x SSC. Lavare i campioni per 5 min in ogni soluzione, dalla più alta concentrazione di etanolo in movimento al più basso per reidratare il tessuto. Lavare due volte per 5 min ogni 1 in x SSC.
  3. Incubare i campioni della soluzione di candeggina (tabella 1) per 90 min su una lightbox in una cappa aspirante.
    Nota: Questo passaggio consente qualsiasi pigmentazione nei campioni o la colorazione da Bouins la soluzione per essere rimosso e migliora il segnale di sonda per visualizzazione libera.
  4. Lavare i campioni due volte con 500 µ l di 1 x SSC per 5 min.
  5. Riposizionare le budella con minimo danno capovolgendo il cestello di campione in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti nuovo e lavare con etanolo al 70% attraverso il fondo di rete usando una pipetta di trasferimento. Conservare a-20 ° C se necessario.
  6. Per ottenere una panoramica dei modelli di macchiatura di campioni multipli, come illustrato nella Figura 3, mantenere il fegato in etanolo al 70% in 24-piastra e Mostra con qualsiasi microscopio a campo chiaro. Per esaminare i singoli budella con un microscopio a campo chiaro come mostrato in Figura 4, Figura 5, e nella figura 6, montare le budella in 100% glicerolo sotto vetrini coprioggetti. Utilizzare una spatola di plastica per manipolare delicatamente il tessuto con il minimo danno.
    Nota: L'elevata viscosità del glicerolo aiuta a proteggere i tessuti da danni da compressione e permette il posizionamento accurato dei diverticoli tale che il tessuto può essere visionato in modo ottimale a ingrandimenti superiori.
  7. Catturare immagini il microscopio usando software di acquisizione di immagini specifiche di microscopio (Tabella materiali) ed esportare come immagini Tiff a una generica immagine software di editing. Per quantificare le differenze relative di colorazione tra trattamenti sperimentali, scaricare un software di analisi di immagine generica (Tabella materiali). Aprire l'immagine all'interno del software di analisi e utilizzare le istruzioni all'interno del software per misurare pixel intensità della colorazione e calcolare trame istogramma della colorazione.

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Risultati

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La misurazione e la valutazione della qualità delle sonde del RNA sono fondamentali prima di iniziare la colorazione. In vitro trascrizione efficienza dipende altamente la quantità e la qualità del modello del DNA. Abbiamo visualizzato ordinariamente le sonde del RNA su un gel di formaldeide per verificare la purezza e la quantità di sonda generata dalle reazioni di trascrizione. Le sonde dovrebbero essere visualizzato come bande luminose, discreti (Figura 2<...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo è il primo uso di una tecnica di ibridazione (WMISH) intero-monta in situ per studiare il microbiota di un artropodo vettore di agenti patogeni. Il nostro protocollo è stato adattato da quello utilizzato nello studio dello sviluppo in Drosophila che in rana embrioni25,26. Intero-monta RNA in situ ibridazione venga ordinariamente utilizzato per localizzare le trascrizioni del gene spazialmente e temporalmente27

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo sinceramente Dr. Mustafa Khokha, Università di Yale, per fornire l'uso delle sue risorse di laboratorio. Siamo grati a Mr. Wu Ming-Jie per l'eccellente assistenza tecnica. EF è un investigatore HHMI. Questo lavoro è stato supportato da un dono dal John Monsky e fondo per la ricerca di Jennifer Weis Monsky malattia di Lyme.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micronAmazon03-110/47
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360
Digoxygenin-11-UTPRoche1209256910
dNTPNew England Biolabs N0447S
DNAse I(senza RNAsi)New England BiolabsM0303S
Kit di sintesi dell'RNA HiScribe SP6New England BiolabsE2070S
Kit di sintesi dell'RNA ad alto rendimento HiScribe T7 NewEngland BiolabsE2040S
Acqua, senza RNasi, trattato con DEPCAmerican BioanalyticalAB02128-00500
EDTA, 0,5 M, pH 8,0American BioanalyticalAB00502-01000
Formaldeide, 37%JT Baker2106-01
FormamideAmerican BioanalyticalAB00600-00500
EGTASigma AldrichE-4378
DPBS, 10XGibco14300-075
Tween-20Sigma AldrichP1379-25ML
Proteinasi KSigma Aldrich3115879001
Trietanolammina HClSigma AldrichT1502-100G
Anidride aceticaSigma Aldrich320102-100ML
ParaformaldeideThermoScientific/Pierce28906
SSC, 20XAmerican BioanalyticalAB13156-01000
RNA da lievitotorulaSigma AldrichR3629-5G
Eparina, sale sodicoSigma AldrichH3393-10KU
Soluzione di Denhardt, 50XSigma AldrichD2532-5ML
CHAPS idratoSigma AldrichC3023-1G
RNasi ASigma Aldrich10109142001
RNasi T1ThermoScientific EN0541
Acido maleicoSigma AldrichM0375-100G
Reagente bloccanteSigma Aldrich11096176001
Anti-Digoxigenina-AP, Fab frammenti SigmaAldrich11093274910
Levamisol cloridratoSigma Aldrich31742-250MG
Substrato cromogenico per fosfatasi alcalinaSigma AldrichSoluzione di 11442074001
BouinSigma AldrichHT10132-1L
Perossido di idrogenoMallinkrodt Baker, Inc2186-01
Scala RNA a filamento singoloAmbion -MilleniumAM7151
 #11 Lame in acciaio ad alto tenore di carbonio C e A Scientific Premiere#11-9411
TermociclatoreBioRad, CA1851148
SpettrofotometroThermoScientific NanoDrop 2000C
VWRDS-500E Agitatore
Bagno d'acqua con agitazioneBELLCO Glass, IncHot Shaker-7746-12110
Sistema di documentazione in gelBioRadGel Doc XR+ Sistema
gel Microscopio a campo chiaroNikonNikonSM2745T
Microscopio a campo chiaro Microscopio da dissezione ZeissAXIO Scope.A1
ZeissSTEMI 2000-C
  Kit diVWR102097-658
 Qiagen28104
Software di acquisizione immaginiZeissZen lite
Software di elaborazione immagini Adobe Adobe Photoshop CS4 versione 11.0
Software di analisidelle immagini National Institutes of HealthImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Strumentazione compatibile con l'automazioneIntavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germania). Intavis, Biolane HT1.16v
Agitatore orbitale orbitale digitaledi documentazione in purificazione PCR light box

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573(2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87(2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184(2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38(2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057(2013).

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