Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin

Summary

Delle vescicole sinaptiche (SV) la bicicletta è il meccanismo di base della comunicazione intercellulare alle sinapsi neuronali. Rilascio e l'assorbimento della tintura di FM sono il mezzo primario di quantitativamente analizzante SV endo - ed esocitosi. Qui, mettiamo a confronto tutti i metodi di stimolazione per guidare FM1-43 ciclismo alla sinapsi Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) modello.

Abstract

FM coloranti vengono utilizzati per studiare il ciclo delle vescicole sinaptiche (SV). Queste sonde di amphipathic hanno una testa idrofila e coda idrofobica, rendendoli solubili in acqua con la possibilità di reversibilmente entrare ed uscire lipidici di membrana. Questi coloranti styryl sono relativamente non fluorescente in ambiente acquoso, ma inserire il foglietto esterno della membrana plasmatica provoca un > 40 X aumentare in fluorescenza. Nelle sinapsi neuronali, FM coloranti sono interiorizzati durante endocitosi SV, smerciata sia all'interno che tra piscine SV e rilasciato con esocitosi SV, fornendo un potente strumento per visualizzare le fasi presinaptici della neurotrasmissione. Un modello genetico primario di sviluppo di sinapsi glutammatergiche e funzione è la Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ), dove FM tingere imaging è stato ampiamente utilizzata per quantificare la dinamica di SV in una vasta gamma di condizioni mutante. Il terminale sinaptico NMJ è facilmente accessibile, con una bella serie di grandi boutons sinaptici ideale per applicazioni di imaging. Qui, mettiamo a confronto e contrasto i tre modi per stimolare la drosofila NMJ guidare tintura l'assorbimento/rilascio di attività-dipendente FM1-43: applicazione 1) vasca di alta [K⁺] a depolarizzarsi tessuti neuromuscolari, 2) del nervo motore elettrodo di aspirazione stimolazione a depolarizzarsi nervi presinaptici terminali e 3) mirati transgenici espressione delle varianti channelrhodopsin per luce-stimolato un controllo spaziale di depolarizzazione. Ciascuno di questi metodi presenta vantaggi e svantaggi per lo studio degli effetti di mutazione genetica sul ciclo SV presso la drosofila NMJ. Discuteremo di questi vantaggi e svantaggi per facilitare la scelta dell'approccio stimolazione, insieme con le metodologie specifiche per ogni strategia. Oltre a formazione immagine fluorescente, FM coloranti possono essere photoconverted a elettrone-densi segnali visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per lo studio dei meccanismi di ciclo SV a livello ultrastrutturale. Forniamo i confronti di confocale e la microscopia elettronica imaging da diversi metodi di stimolazione di Drosophila NMJ, per aiutare a guidare la selezione dei futuri paradigmi sperimentali.

Introduction

Il modello splendidamente caratterizzato Drosophila larvale della giunzione neuromuscolare (NMJ) glutamatergic sinapsi è stato utilizzato per studiare la formazione della sinapsi e funzione con un vasto spettro di perturbazioni genetica¹. Il terminale del neurone di motore è costituito da più rami dell'assone, ognuno con molti boutons sinaptici allargata. Queste varicosità capiente (fino a 5 µm di diametro) contengono tutte la macchine di neurotrasmissione, comprese le vescicole sinaptiche glutamatergic uniforme (SVs; ~ 40 nm di diametro) nella riserva citosolico e facilmente rilasciabile piscine². Queste vescic....

Protocol

1. larvale colla dissezione

1. Mescolare bene 10 parti di elastomero di silicone base con 1 parte di elastomero di silicone induritore dal kit di elastomero (Tabella materiali).
2. Cappotto 22x22 mm lamelle di vetro con l'elastomero e cura su un piatto caldo a 75 ˚ c per diverse ore (fino a quando non è più appiccicoso al tatto).
3. Posizionare un coprioggetto in vetro rivestite con elastomero singolo nella camera di dissezione di vetro plexi su misura (Figura 1, in basso) in preparazione per la dissezione larvale.
4. Preparare le pipette di colla dal capillare di vetro borosilicato con l'estra....

Results

La figura 1 Mostra il flusso di lavoro per la tintura di FM di attività-dipendente imaging protocol. L'esperimento inizia sempre con la dissezione larvale colla stessa, indipendentemente dal metodo di stimolazione utilizzato successivamente. Figura 1a è un disegno schematico di una larva dissecata, mostrando il cavo ventrale del nervo (VNC), irradiando i nervi e pattern muscolari ripetute hemisegmental. Il VNC è rimosso e la prep.......

Discussion

Alta [K⁺] Salina depolarizzazione stimolazione è di gran lunga la più semplice delle tre opzioni per tintura di FM di attività-dipendente in bicicletta, ma probabilmente il meno fisiologico²⁹. Questo semplice metodo depolarizza ogni cellula accessibile nell'animale intero e così non permette studi diretti. Potrebbe essere possibile applicare localmente alta [K⁺] soluzione fisiologica con una micropipetta, ma questo sarà ancora depolarizzarsi cellule pre/post-sinaptica e proba.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di elastomeri siliconici SylGard 184	Scientific	NC9644388	Per applicare il vetro di copertura per le dissezioni
Vetro di copertura per microscopio 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	Per applicare SylGard per le dissezioni
Piastra riscaldante superiore in alluminio Tipo 2200	Thermolyne	HPA2235M	Per polimerizzare la
camera di dissezione in vetro	N/A	N/A	Fatto a mano
Capillari in vetro borosilicato	WPI	1B100F-4	Per fare l'aspirazione e incollare le micropipette
Estrattore per micropipette basato sul laser	Strumento Sutter	P-2000	Per fare l'aspirazione e la colla delle micropipette
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	Per pipetta per bocca e aspirazione
P2 punta per pipetta	USA Scientific	1111-3700	Per pipetta per bocca
0,6 ml Tappo per provette Eppendorf	Fisher Scientific	05-408-120	Utilizzato per mettere la colla per la dissezione
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Colla utilizzata per le dissezioni
Cloruro di potassio	Fisher Scientific	P-217	Forsalina
Cloruro di sodio	Millipore Sigma	S5886	Per soluzione salina
Cloruro di magnesio	Fisher Scientific	M35-500	Per soluzione salina
Cloruro di calcio diidrato	Millipore Sigma	C7902	Per soluzione salina
Saccarosio	Fisher Scientific	S5-3	Per soluzione salina
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Per soluzione salina
HRP: Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	Per etichettare le membrane neuronali
Pennello	Winsor & Newton	94376864793	Per manipolare le larve
Dumont Dumostar Pinzetta #5	WPI	500233	Utilizzato durante la dissezione
7 cm McPherson-Vannas Microforbici (lame 3 mm)	WPI	14177	Utilizzato durante la dissezione
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	colorante di stirile
	VWR	62344-641	Per la temporizzazione del carico/scarico del colorante FM
LSM 510 META microscopio confocale a scansione laser	Zeiss		Per l'imaging dei marcatori fluorescenti
Zen 2009 SP2 versione 6.0	Zeiss	Software per l'imaging su laser confocale
HeNe 633nm	Lasos		Per eccitare HRP:647 durante
Laser Argon 488nm	Lasos		Per eccitare il colorante FM durante l'imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	Per lucidare a fuoco micropipette di vetro
20mL Siringa Slip Tip	BD	301625	Per aspirare l'assone per la stimolazione elettrica.
Micro manipolatore (base magnetica)	Narishige	MMN-9	Per controllare l'elettrodo di aspirazione per la stimolazione elettrica
	Stimolatore Grass	S48	Per controllare il LED e la stimolazione elettrica
Zeiss Axioskop Microscopio	Zeiss		Utilizzato durante la stimolazione elettrica.
Obiettivo a immersione in acqua Achroplan 40X	Zeiss		stimolazione elettrica e l'imaging confocale
Millipore retinico all-trans	Sigma	R2500	Co-fattore essenziale per ChR2
Zeiss Stemi Microscopio con porta per fotocamera	Zeiss	2000-C	Utilizzato durante la stimolazione con canalrodopsina
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Utilizzato per l'attivazione di ChR
Driver LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B	Per controllare l'alimentatore LED
LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Per alimentare il
potenza ed energia	a LED ThorLabs	PM100D	Per misurare l'intensità dei LED