Questo studio utilizza una tecnica di microscopia (LSFM) foglio di luce di fluorescenza-retro illuminazione combinata con compensazione ottica per studiare il cuore murino.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microscopia di fluorescenza di luce-foglio è stato ampiamente utilizzata per l'acquisizione rapida immagine con un'alta risoluzione assiale da micrometro scala del millimetro. Tecniche tradizionali di luce-foglio implicano l'uso di un fascio di illuminazione singola direzionato ortogonalmente al tessuto dell'esempio. Immagini di grandi campioni che sono prodotte utilizzando un fascio di illuminazione singola contengono strisce o artefatti e soffrono di una risoluzione ridotta dovuto la dispersione e l'assorbimento della luce da parte del tessuto. Questo studio utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione e una semplificata chiarezza ottica, tecniche di taglio per il cuore murino. Queste tecniche permettono di imaging più profondo rimuovendo i lipidi dal cuore e producono un grande campo di formazione immagine, maggiore di 10 x 10 x 10 mm3. Di conseguenza, questa strategia permette di quantificare le dimensioni ventricolari, traccia la linea cardiaca e localizzare la distribuzione spaziale delle proteine cardiache specifiche e canali ionici da post-natali ai cuori di topo adulto con sufficiente contrasto e ad alta risoluzione.
Introduzione
Microscopia di fluorescenza di luce-foglio era una tecnica sviluppata nel 1903 ed è usata oggi come un metodo per studiare l'espressione genica ed anche a produrre modelli 3D o 4D di tessuto campioni1,2,3. Questo metodo di imaging utilizza un sottile foglio di luce per illuminare un unico piano di un campione in modo che solo quell'aereo è catturato dal rivelatore. Il campione può quindi essere spostato in direzione assiale per catturare ogni strato, una sezione alla volta e il rendering di un modello 3D dopo il post-processing delle immagini acquisite4
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state approvate da comitati di revisione istituzionale (IACUC) presso la University of California, Los Angeles, California.
1. imaging System Setup
Nota: Vedere Figura 1 e Figura 2.
- Recuperare un laser ad onda continua (CW) con 3 lunghezze d'onda: 405 nm, 473 nm e 532 nm. Posto 2 specchi (M1 e M2) distanza di 150 mm e allinearli con i loro aerei di specchio a 45° alla trave.
Nota: Questo passaggio viene eseguito per reindirizzare il laser lontano il setup di fronte-retro illuminazione. I....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La tecnica descritta qui usato un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica dei campioni di tessuto del cuore del mouse per ottenere una maggiore profondità di imaging e un più grande volume di imaging con sufficiente formazione immagine ad alta risoluzione (Figura 1). Per calibrare il sistema, perline fluorescenti sono stati collocati all'interno dei tubi di vetro e all'interno del sistema di imaging. Le perle sono stati poi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il sistema LSFM e la tecnica qui descritta utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica a immagine del cuore del topo nelle fasi post-natali e adulti del suo sviluppo. Un fascio di illuminazione singola tradizionale soffre di photon scattering e assorbimento attraverso tessuti più spessi e più grandi campioni1,3. Le travi-retro forniscono un'illuminazione più uniforme del campione, riducendo al minimo l'effetto di stripi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero esprimere gratitudine a Thao Nguyen e Atsushi Nakano da UCLA per fornire il campione di topi all'immagine. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH HL118650 (per Tzung K. Hsiai), HL083015 (per Tzung K. Hsiai), HD069305 (per N. C. Chi e Tzung K. Hsiai.), HL111437 (per Tzung K. Hsiai e N. C. Chi), HL129727 (per Tzung K. Hsiai) e University of Texas System Star finanziamenti (per match Lee).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Eccitazione dei fluorofori |
| Filtro a densità neutra | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controlla la quantità di luce che entra nel sistema Espansore |
| fascio acromatico | Thorlabs | GBE05-A | Espande il fascio di luce |
| Fessura meccanica | Thorlabs | VA100C | Controlla la larghezza del fascio |
| Divisore di fascio | Thorlabs | BS013 | Forma un fascio di illuminazione |
| Stereomicroscopio con obiettivo 1X | Olympus | MVX10 | Utilizzato per l'osservazione del campione |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Utilizzato per acquisire immagini |
| Acrilonitrile butadiene stirene (ABS) | Stratasys | uPrint | Materiale utilizzato per stampare in 3D un portacampioni |
| Perle di polistirene fluorescente | Spherotech Inc | PP-05-10 | Utilizzato per la calibrazione del sistema di imaging |
| Tubo in vetro borosilicato | Corning | Pyrex 7740 | Tubo per l'inclusione del campione |
| Glicerolo | Fisher Scientific | BP229-4 | Riempimento per camera del campione |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Fisher Scientific | BP39920 | Soluzione di risciacquo per cuori di topo |
| Scienze della microscopia elettronica | paraformaldeide | RT-15700 | Prima soluzione di incubazione |
| Acrilammide | Wako Chemicals | AAL-107 | Miscelato con 2,2'-Azobis dicloridrato per la seconda soluzione di incubazione per cuori di topo |
| 2,2'-Azobis dicloridrato | Wako Chemicals | VA-044 | Miscelato con acrilammide per la seconda soluzione di incubazione per cuori |
| di topoSodio dodecil solfato | Sigma Aldrich | 71725 | Miscelato con acido borico per la terza soluzione di incubazione per cuori di topo |
| Acido borico | Fischer Scientific | A74-1 | Miscelato con sodio dodecil solfato per la terza soluzione di incubazione per cuori di topo |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Miscelato con PB, Tween-20 e sodio azide come soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Miscelato con Sigma D2158, PB e sodio azide come soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione |
| Sodio azide | Sigma Aldrich | S2002 | Miscelato con Sigma D2158, PB e Tween-20 come soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione |
| Vettore virale adeno-associato 9 con un promotore di troponina T specifico per il cuore etichettato con GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Esprime GFP quando legato all'attuatore del |
| servomotore CC | Thorlabs | Z825B | Utilizzato per il movimento del campione in direzione assiale all'interno del foglio leggero |
| K-Cube Servomotore CC spazzolato Controller | Thorlabs | KDC101 | Si collega all'attuatore del motore e controlla il movimento dell'attuatore |
| Software Amira | FEI | N/A | Software di visualizzazione per la produzione di immagini 2D e 3D |
Riferimenti
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swo....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Tag
Illuminazione a doppio latoImaging del cuore murinoClearing ottico CLARITYQuantificazione delle dimensioni ventricolariTracciamento della linea cellulare cardiacaLocalizzazione dei canali ionici proteiciImaging con camera sCMOSTavolo traslatore motorizzato 3DSoluzione per l adattamento dell indice di rifrazione
