Articolo metodologico

Optogenetica identificazione di un tipo di un neurone con un Optrode di vetro in topi svegli

DOI:

10.3791/57781

⸱

28 giugno 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

In questo articolo

Sommario

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Questo lavoro introduce un metodo per eseguire un unitario optogenetica registrazione in modo affidabile da un mouse sveglio usando un optrode di vetro su misura.

Abstract

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È delle principali preoccupazioni in neuroscienze come i diversi tipi di neuroni funzionano in circuiti neurali. Gli avanzamenti recenti nella optogenetica hanno permesso l'identificazione del tipo di un neurone in vivo esperimenti elettrofisiologici nelle regioni del cervello ampio. In esperimenti di optogenetica, è fondamentale per fornire la luce per il sito di registrazione. Tuttavia, è spesso difficile fornire la luce di stimolazione per le regioni del cervello profondo dalla superficie del cervello. Soprattutto, è difficile per la luce di stimolazione raggiungere le regioni del cervello profondo quando la trasparenza ottica della superficie del cervello è bassa, come è spesso il caso con registrazioni da animali svegli. Qui, descriviamo un metodo per registrare le risposte di spike alla luce da un mouse sveglio utilizzando un optrode di vetro su misura. In questo metodo, la luce è consegnato attraverso l'elettrodo di vetro di registrazione in modo che è possibile stimolare in modo affidabile il neurone registrato con la luce nelle regioni del cervello profondo. Questo sistema su misura optrode costituito da materiali accessibile e poco costosi ed è facile da montare.

Introduzione

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Il sistema nervoso centrale è costituito da vari tipi di neuroni, che hanno funzioni diverse. Funzionano di questi diversi tipi di neuroni all'interno del circuito neurale è una delle preoccupazioni principali nell'ambito delle neuroscienze. Tuttavia, in molte regioni del cervello, è stato impossibile distinguere i tipi di un neurone in registrazioni in vivo di attività elettrica perché non c'è nessuna differenza evidente in segnale elettrico spike stesso, con alcune eccezioni. Gli avanzamenti recenti nella optogenetica hanno fatto un passo avanti1,2. Utilizzando animali transgenici in cui opsina sensibili alla luce (ad es., channelrhodopsin-2) è espresso in tipi neuronali specifici, è diventato possibile distinguere i tipi di un neurone in modo efficiente in vivo registrazioni3, 4,5,6. In questi animali, i neuroni con crepuscolare opsina sono eccitati dando stimoli leggeri durante le registrazioni elettriche, ma altri neuroni non sono. I neuroni di opsin-positivi, di conseguenza, sono facilmente distinguibili da altri tipi di neurone dalle loro risposte alla luce.

In esperimenti di optogenetica, è fondamentale per fornire la luce per il sito di registrazione. Come una metodica non invasiva, la luce è spesso diretto dalla superficie del cervello. Tuttavia, poiché la forza della luce riduce come esso passa attraverso il tessuto cerebrale, è difficile stimolare le regioni del cervello profondo dalla superficie del cervello. Soprattutto, è difficile per la luce di stimolazione raggiungere le regioni del cervello profondo quando la trasparenza ottica della superficie del cervello è bassa, come è spesso il caso con registrazioni da animali svegli. Esperimenti elettrofisiologici spesso sono stati effettuati su animali anestetizzati, perché il movimento del corpo provoca rumore nelle registrazioni. Come è ben documentato, tuttavia, l'anestesia è conosciuto per cambiare le risposte neurali7,8,9,10. Pertanto, è necessario utilizzare animali svegli al fine di studiare le risposte neurali senza gli effetti artificiali dell'anestesia. A differenza di esperimenti con animali anestetizzati, registrazioni elettrofisiologiche sono effettuate dopo il recupero da un intervento chirurgico negli esperimenti con gli animali svegli. Durante l'intervallo tra la chirurgia e le registrazioni, l'essudato di tessuto spesso si accumula sulla superficie del cervello e rende la trasparenza ottica della superficie del cervello basso.

Qui, descriviamo un metodo per registrare le registrazioni unitario da un mouse sveglio utilizzando un optrode di vetro su misura. In questo metodo, la luce è consegnato attraverso l'elettrodo di vetro di registrazione in modo che è possibile stimolare in modo affidabile il neurone registrato con la luce nelle regioni del cervello profondo. Questo sistema su misura optrode costituito da materiali accessibile e poco costosi ed è facile da montare.

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Protocollo

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Tutte le procedure vengono eseguite in conformità con i principi guida della società fisiologica del Giappone e con l'approvazione di Animal Care Comitato di Kanazawa Università medica.

1. costruzione del vetro Optrode titolare

Nota: Per creare un supporto di vetro optrode, viene utilizzato un portaelettrodo commerciale (Figura 1A).

  1. Estrarre delicatamente il tubo d'acciaio per controllo di pressione dalla canna del titolare.
  2. Di foratura, allargare il foro del lato perno sedile in canna del titolare. Praticare il foro di 3 mm di diametro e 12 mm in profondità.
  3. Mettere un tubo di acciaio inox (diametro 3 mm, dello spessore di 0,5 mm e 8 mm di lunghezza; Figura 1A 2) nel foro.
  4. Inserire una ceramica dividere manicotto di accoppiamento per puntali di ⌀2.5 mm (Figura 1A1) nel foro.
  5. Fissare la canna della pinza porta elettrodo per una scanalatura a forma di L con adesivo epossidico.
  6. Praticare i fori (3 mm di diametro) nella scanalatura e allegarlo a un manipolatore con viti.

2. testa Post installazione

  1. Preparare un post di testa su misura fatto di un distanziatore di circuito stampato. Rendere il distanziale colonnare del circuito in una forma cuboidale con una fresa e tagliarlo in 2 post testa con una sega (Figura 1B). Appiattire la parte inferiore del post testa con una fresa.
  2. Preparare l'animale transgenico in cui un'opsina sensibile alla luce è espressa in un tipo di neurone specifico per lo studio. In questo lavoro, si utilizza il mouse transgenico (topi VGAT-ChR2) in cui i neuroni inibitori express channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .
  3. Anestetizzare l'animale con una miscela di 0,3 mg/kg di medetomidina, 4,0 mg/kg di midazolam e 5,0 mg/kg di butorfanolo tramite la somministrazione intraperitoneale. Per confermare che l'animale è completamente anestetizzato, prova sue reazioni per pizzicare di coda.
  4. Posizionare il mouse in una cornice stereotassica su un rilievo di riscaldamento. Pulire la cornice stereotassica e il riscaldamento pad con alcool al 70% in anticipo. Posizionare i denti nel foro della barra del morso e serrare leggermente il morsetto di naso. Difficoltà entrambi i lati della testa utilizzando barre di orecchio. Quando la testa è fissata correttamente dalle barre di orecchio, stringere il morsetto del naso. Applicare una pomata oftalmica agli occhi.
  5. Radere la pelle di testa con piccole forbici e pulire il cuoio capelluto con un batuffolo di cotone di clorexidina gluconato. Prima della chirurgia, sterilizzare tutti che gli strumenti chirurgici e una testa post con un'autoclave (121 ° C, 15 min).
  6. Tagliare il cuoio capelluto lungo la linea mediana con le forbici e spingerla da parte. Effettuare l'incisione dalla parte posteriore della testa per gli occhi (circa 20 mm). Rimuovere il periostio con un batuffolo di cotone imbevuto in alcool al 70% e asciugare il cranio.
  7. Allegare il post di testa per il manipolatore. Posizionare il post testa piatta sul cranio intorno il bregma utilizzando il manipolatore.
  8. Mescolare il monomero (4 gocce), il catalizzatore (1 goccia) e polimeri (1 cucchiaino) di cemento dentale su un piccolo piatto che viene raffreddato in frigorifero in anticipo. Mettere il cemento dentale (inferiore a 1 g) sul frontale e dell'osso parietale del cranio per fissare la testa posta al cranio.
  9. Dopo il cemento dentale diventa difficile, è possibile rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica. Mettere una pomata antibiotica sulla pelle esposta. Iniettare l'antagonista di medetomidina (0,3 mg/kg) e gli antibiotici (ossitetraciclina; 20 mg/kg). Posizionare e controllare il mouse sul tappetino calore in una gabbia fino a quando risveglia e restituirlo a una gabbia di alloggiamento.
  10. Casa l'animale in una gabbia di alloggi individuali con qualche dispositivo di arricchimento. Cambia la carta animale biancheria da letto ogni giorno per mantenere la gabbia pulita e prevenire l'infezione. Monitorare con attenzione se l'animale mostra segni di disagio. Applicare lidocaina la ferita se qualsiasi dolore è ritenuto sospetto. Amministra meloxicam o carprofen una volta ogni 24 h per 48 h dopo entrambi la testa post installazione ed il craniotomy ambulatori. La lidocaina locale può essere dato inoltre se i fans non è adeguato.

3. acclimatazione

  1. (Minimo) due giorni dopo il recupero dall'anestesia, acclimatare gli animali allo stato testa-fisso nella camera di registrazione. Eseguire le sessioni di acclimatazione per almeno 5 giorni.
  2. Durante le sessioni di acclimatazione, metti l'animale nella camera di registrazione con il post testa fissato ad una pinza su misura. Durante la sessione, al fine di limitare il movimento, copre il corpo con un mezzo tubo di resina su misura (Figura 1), realizzati con una stampante 3D.
    Nota: Il giorno 1, la sessione di acclimatazione deve essere lunga 5 min. Esso è poi aumentato ogni giorno a 10, 20, 40 e 60 min per giorni 2, 3, 4 e 5, rispettivamente.
  3. Alla fine di ogni sessione, dare all'animale una ricompensa in cibo. Se l'animale si sforza continuamente durante l'acclimatazione, interrompere la sessione.

4. craniotomia

Nota: Dopo l'acclimatazione, un craniotomy è fatta sopra la regione del cervello per la registrazione. Il craniotomy è effettuato nella cornice stereotassica in anestesia, come con la testa post installazione. La procedura di post-funzionamento è lo stesso come la testa post installazione.

  1. Prima il craniotomy, pulire il cranio con un batuffolo di cotone con clorexidina gluconato e 70% di alcol.
  2. Raschiare accuratamente il cranio sopra il sito di registrazione con un trapano odontoiatrico. Quando l'osso diventa abbastanza sottile, tagliare con la punta del bisturi e rimuoverlo.
  3. Mettere cemento dentale intorno alla regione esposta al fine di rafforzare il cranio.
  4. Coprire l'area di cervello esposto con adesivo siliconico dopo il cemento dentale diventa difficile. Post-operatorio si procede come descritto al punto 2.8.

5. elettrofisiologici registrazione

  1. Permettere all'animale di recuperare per almeno 1 giorno dopo il craniotomy prima di eseguire la registrazione elettrofisiologica. Metti l'animale nella camera di registrazione allo stesso modo che è stato fatto durante le sessioni di acclimatazione quando verrà avviata la registrazione.
  2. Rendere le pipette in vetro dai capillari di vetro borosilicato (OD = 1.5 mm, ID = 0,9 mm, lunghezza 90,0 mm) tirato su un estrattore di elettrodo. Loro diametro della punta è 2-3 µm, e la loro resistenza è 4 – 6 MΩ quando sono pieni di 10mm PBS. La lunghezza dell'elettrodo è di 40 – 50 mm. In alcune registrazioni, neurobiotin 2% viene aggiunto alla PBS da 10 mM.
  3. Allegare la pipetta di vetro riempito al titolare della optrode su misura.
  4. Mettere il filo in argento rivestito Ag-Cl (0,2 mm di diametro) nella pipetta di vetro. Collegare il filo d'argento ad un pin tramite un sottile filo elettrico rivestito. Collegare il pin per l'headstage dell'amplificatore registrazione.
  5. Collegare il cavo di patch in fibra ottica (core = 960 µm, rivestimento = 1.000 µm, NA = 0,63) con una ghiera di zirconia (OD = 2,5 mm) per la scissione il manicotto sul titolare del optrode di accoppiamento. Spingere il cavo di patch nel manicotto finché la punta della ferrula contatto sul retro della pipetta di vetro. Il cavo di patch offre la luce (lunghezza d'onda = 465 nm) da LED. La luce del LED è controllata da un driver di LED singolo canale.
  6. Rimuovere l'adesivo del silicone sopra il craniotomy. Metta salina riscaldata (38 ° C) sulla superficie del cervello periodicamente per evitare che la superficie del cervello secchi durante la sessione di registrazione. Se necessario, rimuovere il dura con le pinzette taglienti.
  7. Inserire l'elettrodo di vetro nel tessuto del cervello con un manipolatore. Quando è inserito, monitorare la resistenza dell'elettrodo. Sostituire l'elettrodo quando la resistenza è inferiore al previsto perché la punta dell'elettrodo può essere danneggiata. Alla profondità di interesse, ricerca e isolare le punte di singola unità di regolazione della profondità di 2-5 µm.
  8. Dopo la singola unità è isolata, consegnare la luce del LED e osservare la risposta agli stimoli leggeri.
  9. Registrare le attività neurale dopo l'identificazione dei tipi cellulari. Eseguire le registrazioni per 2 – 3 h. Se la registrazione viene effettuata in giorni consecutivi (2 giorni al massimo), coprire il craniotomy con adesivo siliconico. Quando la registrazione è terminata e l'animale viene sacrificato, recuperare il post testa e metterlo in acetone a lavare e riutilizzare.

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Risultati

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In Figura 2, abbiamo esaminato gli effetti della dimensione del suggerimento e la lunghezza delle pipette di vetro sul potere della luce sulla punta delle pipette (Figura 2A-B). Il potere della luce è stato misurato da un misuratore di potenza ottica posizionato a 1 mm dalla punta. Tutta la sua lunghezza era impostata a 50 ± 2 mm quando varia la dimensione di punta, mentre la dimensione di punta era impostata su ...

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Discussione

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Optogenetica è diventato un potente strumento in neuroscienze. È stato utilizzato per identificare tipi specifici neuroni in vivo così come manipolare l'attività di specifici circuiti neuronali. Il chiarimento delle attività neurale di diversi tipi di un neurone promuove la comprensione del meccanismo dei circuiti neurali. Qui, abbiamo dimostrato un metodo per fornire la luce per il sito di registrazione attraverso un elettrodo di vetro nell'IC di sveglio VGAT-ChR2 topi.

Ci sono diver...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori sono stati supportati da Japan Society per la promozione della scienza KAKENHI Grant JP16K11200 e 17H 02223 e la concessione per la ricerca di Kanazawa Medical University S2016-8 e C2017-3. Ringraziamo Yuhichi Kuda per il suo sostegno a scattare la foto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PortaelettrodoMolecular Device1-HL-Uportapipette per amplificatore di microelettrodi
Manicotto di accoppiamento diviso in ceramicaThorlabsADAF1f2,5 mm ghiera
Distanziatore per circuito stampatoTeishin DenkiSPA-320f8,0 mm, lunghezza 20,0 mm
Telaio stereotassico per topiNarishigeSR-6M-HTStrumenti stereotassici per topi
ManipolatoreNarishigeNAManipolatore manuale
SuperbondSun MedicalM: 204610557Adesivo dentale resina cementizia
Form2 FormlabsNAStampante 3D
Kwik-SilWPIKWIK-SILAdesivo siliconico a bassa tossicità
Capillari in vetro borosilicatoNarishigeGD-1.5OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, lunghezza 90.0 mm
Cavo patch in fibra otticaLenti doricheMFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5Cavo patch monofibra ottica, OD, 2,5 mm, nucleo = 960 mm, rivestimento = 1000 mm, NA = 0,63
Lenti doricheLED collegateLEDC-1B_FCLunghezza d'onda centrale = 465 nm, potenza di uscita = 45 mW (Core 960 mm 0,63 NA )
Driver LEDLenti doricheLEDRV_1CH_1000driver LED 1 ch, uscita massima = 1000 mA
Estrattore di elettrodiNarishigePB-7Estrattore per micropipette in vetro a doppio stadio
Capillare in vetro borosilicatoNarishigeGD-1.5Capillare in vetro bolosilicato, OD, 1,5 mm, ID, 0,9 mm, 90,0 mm
di lunghezza GENTACINMSD CO., Ltd185711173Unguento antibiotico
Terramycin®-LAZoetisG 333Ossitetraciclina
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/JJackson Labs#14548VGAT-ChR2 mouse
Multiclamp 700BMolecular Devices2500-0157Amplificatore per microelettrodi

Riferimenti

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