Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

Summary

Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.

Abstract

Keratinocytes umani primari isolato dai tessuti di pelle fresca e loro espansione in vitro sono stati ampiamente utilizzati per ricerche di laboratorio e per applicazioni cliniche. Il metodo di isolamento convenzionale di cheratinociti umani comporta una procedura di digestione enzimatica sequenziale in due fasi, che ha dimostrata di essere inefficiente nel generare cellule primarie da tessuti adulti a causa del tasso di recupero cellulare basso e riduttrice delle cellule vitalità. Recentemente abbiamo segnalato un metodo avanzato per isolare le cellule progenitrici epidermica primaria umana dai tessuti della pelle che utilizza l'inibitore della chinasi Rho Y-27632 nel mezzo. Confrontato con il protocollo tradizionale, questo nuovo metodo è più semplice, più facile e meno dispendio di tempo e aumenta il rendimento delle cellule staminali epiteliali e migliora le caratteristiche di cellule staminali. Inoltre, la nuova metodologia non richiede la separazione dell'epidermide dal derma e, di conseguenza, è adatta per isolare le cellule da diversi tipi di tessuti dell'adulto. Questo nuovo metodo di isolamento supera le carenze principali dei metodi convenzionali ed è più adatto a produrre un numero elevato di cellule epidermiche con elevata potenza per laboratorio e per applicazioni cliniche. Qui, descriviamo il nuovo metodo in dettaglio.

Introduction

L'obiettivo era quello di sviluppare un protocollo semplice ed efficace per isolare i keratinocytes umani primari (HKCs) da tessuti adulti, soprattutto per applicazioni cliniche. Cellule staminali epidermiche cutanee, localizzate nello strato basale della pelle, possiedono un alto potenziale di proliferare e differenziare e fornire cheratinociti per mantenere le funzioni della pelle^{1,2,3, 4}. HKCs isolato dalla pelle tessuti sono ampiamente utilizzati per pelle tessuto ingegneria e rigenerazione scopi, soprattutto nella riparazione della pel....

Protocol

Tessuti umani utilizzati in questo protocollo sono state gestite secondo le direttive del Comitato di etica di ricerca umana dell'istituzione (NO.2015120401, Data: 12 maggio 2015).

1. preparati

1. Tessuti di pelle addominale adulto fresca raccogliere scartati dalla chirurgia plastica presso l'ospedale in un tubo da 50 mL con 10 mL di Dulbecco ghiacciata s modified medium di Eagle (DMEM). I campioni possono essere conservati a 4 ° C fino a 72 ore senza alterare significativamente l'attuabilità delle cellule.
2. Preparare i reagenti e il terreno di coltura come descritto di seguito.
   1. Aggiungere 1 mL di penicillina (100 U/....

Results

Diagrammi schematici del nuovo metodo (Figura 1A) e il metodo convenzionale (Figura 1B) sono presentati nella Figura 1. Il metodo convenzionale è una digestione in due fasi, che richiede una procedura di 2 giorni. Al contrario, il nuovo metodo è una digestione di One-Step, che dura circa 3 ore per eseguire. Cosa importante, il nuovo metodo di One-Step può ottenere due popolazioni (cellule epidermiche.......

Discussion

Colta HKCs primario sono stati ampiamente utilizzati per curare le ferite in cliniche per più di tre decenni e, da quel momento, è stato sempre importante ottenere in modo efficiente un numero sufficiente di cellule per applicazioni cliniche in modo tempestivo. Quindi, in pratica, il metodo di isolamento convenzionale, che richiede la separazione dell'epidermide dal derma, rende difficile soddisfare queste esigenze, a causa della bassa resa delle cellule e la bassa capacità di passaggio di cellule adulte. Qui, descriviam.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Contatore di celle automatizzato Countess	Invitrogen Inc.	C10227	Conteggio automatico delle cellule
Incubatore a CO2	Thermo Scientific	Per l'incubazione cellulare
Centrifuga Sorvall ST 16R	Thermo Scientific	Centrifuga cellulare	a 75004380
Agitatore a temperatura costante	Shanghai Boxun	150036	Per bagnomaria
Bilancia elettronica	Harbin Zhonghui	1171193	Per pesatura di tessuti
Piatto per coltura cellulare	Eppendorf	30702115	Per colture cellulari
Provetta da centrifuga da 50 ml	KIRGEN	171003	Per centrifuga cellulare
Filtro cellulare	Corning incorporato	431792	Filtrazione cellulare
Soluzione tamponata con fosfato	Solarbio Life Science	P1020-500	Soluzione di lavaggio
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Componente del mezzo di neutralizzazione
Definito K-SFM	Life Technologies	10785-012	Terreno di coltura di cellule epidermiche
Penicillina Streptomicina	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotici
Siero fetale bovino	Industrie biologiche	04-001-1AC5	Componente del mezzo di neutralizzazione
0,05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	Per dissociazione HKC
0,25% Tripsina	Pechino Solarbio Scienza & Tecnologia	T1350-100	di dissociazione HKC
	Life Technologies	R-011-K	Per la matrice di rivestimento
Dispase	Gibco	17105-041	Per l'isolamento HKC Collagenasi
di tipo I	Life Technologies	17100-017	Per l'isolamento HKC
Desossiribonucleasi I	Sigma	9003-98-9	Per l'isolamento HKC
F12 Mix di nutrienti, Hams	Life Technologies	componente dell'integratore G-medium
B27	Life Technologies	17504044	Fattore di crescita in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Fattore di crescita in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	Inibitore ROCK
Fungizone	Gibco	15290026	Preparazione per
proteina umana ricombinante G-medium EGF	Gibco		PHG0311 Fattore di crescita nel
kit di conteggio delle cellule G-medium-8	Thermo Scientific	NC9864731	Saggi di proliferazione cellulare e citotossicità
Citocheratina anti-umana del topo5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il
marcatore di differenziazione degli HKCConiglio Anti-Umano Loricrin	Covance	PRB-145p	Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HKC
Mouse anti-umano Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	Per la colorazione in immunofluorescenza dei fibroblasti dermici
Integrina e alfa; 6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	analisi in citometria a flusso di HKC
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	anticorpo di controllo negativo di &alfa; 6-integrina  nell'analisi della citometria a flusso