Method Article

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

DOI:

10.3791/57784

⸱

August 25th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keratinocytes umani primari isolato dai tessuti di pelle fresca e loro espansione in vitro sono stati ampiamente utilizzati per ricerche di laboratorio e per applicazioni cliniche. Il metodo di isolamento convenzionale di cheratinociti umani comporta una procedura di digestione enzimatica sequenziale in due fasi, che ha dimostrata di essere inefficiente nel generare cellule primarie da tessuti adulti a causa del tasso di recupero cellulare basso e riduttrice delle cellule vitalità. Recentemente abbiamo segnalato un metodo avanzato per isolare le cellule progenitrici epidermica primaria umana dai tessuti della pelle che utilizza l'inibitore della chinasi Rho Y-27632 nel mezzo. Confrontato con il protocollo tradizionale, questo nuovo metodo è più semplice, più facile e meno dispendio di tempo e aumenta il rendimento delle cellule staminali epiteliali e migliora le caratteristiche di cellule staminali. Inoltre, la nuova metodologia non richiede la separazione dell'epidermide dal derma e, di conseguenza, è adatta per isolare le cellule da diversi tipi di tessuti dell'adulto. Questo nuovo metodo di isolamento supera le carenze principali dei metodi convenzionali ed è più adatto a produrre un numero elevato di cellule epidermiche con elevata potenza per laboratorio e per applicazioni cliniche. Qui, descriviamo il nuovo metodo in dettaglio.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo era quello di sviluppare un protocollo semplice ed efficace per isolare i keratinocytes umani primari (HKCs) da tessuti adulti, soprattutto per applicazioni cliniche. Cellule staminali epidermiche cutanee, localizzate nello strato basale della pelle, possiedono un alto potenziale di proliferare e differenziare e fornire cheratinociti per mantenere le funzioni della pelle1,2,3, 4. HKCs isolato dalla pelle tessuti sono ampiamente utilizzati per pelle tessuto ingegneria e rigenerazione scopi, soprattutto nella riparazione della pelle danneggiata e nella terapia genica per applicazioni cliniche5,6. La questione chiave per le applicazioni basate su HKC è efficacemente isolare ed espandere i grandi numeri di HKCs con alto potenziale in vitro7,8. Anche se vari gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per produrre colture di staminali-simili HKCs, questi metodi sono a volte lungo e complicato per eseguire ed avere altre limitazioni, come cella bassa resa ed essere limitato dal tipo di esemplare della pelle usato9. Per esempio, il metodo tradizionale per isolare HKCs dai tessuti della pelle comporta una digestione enzimatica in due fasi con una separazione dell'epidermide dal derma6. Tale metodo di solito funziona bene per tessuti neonatale, ma diventa molto difficile quando utilizzato per isolare le cellule da tessuti adulti.

Y-27632, un inibitore della chinasi di proteina Rho-collegata (ROCK), è stato segnalato per migliorare significativamente l'efficienza della cellula staminale epidermica isolamento e Colonia crescita10,11,12. In uno studio precedente, abbiamo scoperto che Y-27632 facilita la crescita clonale delle cellule epidermiche, ma riduce il rendimento delle cellule dermiche differenzialmente controllando l'espressione di molecole di adesione13. Inoltre abbiamo stabilito un nuovo medium condizionato di inoculazione, chiamato G-medio, che sostiene la crescita e la resa delle cellule epidermiche primarie. Dalla combinazione di G-medio con Y-27632, questo metodo novello può separare spontaneamente le cellule epidermiche e cutanee dopo digestione degli enzimi, eliminando in tal modo il passaggio di epidermide-derma separazione13,14. Basato su rapporti precedenti, ora descriviamo la procedura dettagliata di questo nuovo metodo per isolare HKCs dal tessuto pelle adulta.

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Protocol

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Tessuti umani utilizzati in questo protocollo sono state gestite secondo le direttive del Comitato di etica di ricerca umana dell'istituzione (NO.2015120401, Data: 12 maggio 2015).

1. preparati

  1. Tessuti di pelle addominale adulto fresca raccogliere scartati dalla chirurgia plastica presso l'ospedale in un tubo da 50 mL con 10 mL di Dulbecco ghiacciata s modified medium di Eagle (DMEM). I campioni possono essere conservati a 4 ° C fino a 72 ore senza alterare significativamente l'attuabilità delle cellule.
  2. Preparare i reagenti e il terreno di coltura come descritto di seguito.
    1. Aggiungere 1 mL di penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 mg/L) a 50 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) per preparare la soluzione di lavaggio.
    2. Preparare due serie di soluzioni di digestione degli enzimi: (1) preparare 50 mL di dispase (2,5 mg/mL in DMEM) e 50 mL di tipo I collagenasi (2,5 mg/mL in DMEM) separatamente per il metodo convenzionale; e (2) preparare 50 mL di una miscela di dispase e collagenasi di tipo I (sciogliere 125 mg di polvere di dispase e 125 mg di tipo polvere di collagenasi in 50 mL di DMEM) per il nuovo metodo.
      Nota: Tutte le soluzioni di enzima dovrebbero essere filtrate con un filtro da 0,22 µm e mantenute at4 ° C.
    3. Preparare le soluzioni di digestione per entrambi i metodi: 0.05% tripsina e 0,25% tripsina commercialmente sono stati acquistati. Preparare un 10mg/mL dnasi ho soluzione sciogliendo 50 mg di dnasi io polvere in 5 mL di PBS, filtrare con un colino da 0,22 µm e conservare a-20 ° C.
    4. Preparare 500 mL di medium per neutralizzare la digestione enzimatica: medium DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina.
    5. Preparare 500 mL di terreno di inoculazione (fattore di crescita-contenenti medio, chiamato G-medio): DMEM/F12 (3:1) mezzo contenente 1% di penicillina/streptomicina, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL fattore di crescita fibroblastico 2 (FGF2), 20 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF), e Supplemento del 2% B27.
    6. Pretrattare coltura cellulare di 100 mm a piatti con 2 mL di una matrice di rivestimento contenente tipo I collagene per 30 min a temperatura ambiente.

2. convenzionale metodo

  1. Pretrattamento del tessuto della pelle
    1. Prendere 1,5 cm2 del tessuto della pelle e lavarlo 1 x 10 ml di PBS; quindi, risciacquare con 10 mL di etanolo al 70% per 30 s e incubare 2 x 10 ml di soluzione di lavaggio (PBS contenente il 2%, penicillina e streptomicina), 5 minuti ciascuno.
      Nota: Tutti i lavaggi vengono eseguiti in piastre di coltura cellulare di 100 mm all'interno di una cappa a flusso laminare.
    2. Tagliare il tessuto con forbici sterili per rimuovere lo strato di grasso sottocutaneo in una piastra di coltura cellulare di 100 mm e, quindi, pesare il tessuto della pelle (il peso è di 1 g in questo protocollo).
      Nota: Taglio sufficiente è molto cruciale per la separazione efficiente dell'epidermide dal derma. Lo strato di grasso giallastro può essere facilmente distinto visivamente.
    3. Trasferire il tessuto ad un altro piatto sterile 100 mm con il lato di derma verso il basso e, quindi, tagliate il tessuto della pelle a strisce di 3-4-mm-wide usando un bisturi.
      Nota: Il lato di derma con lo strato di grasso è facilmente riconoscibile visivamente.
    4. Aggiungere 10 mL di soluzione di dispase 2,5 mg/mL per i tessuti cutanei in una piastra di coltura di 100 mm e, quindi, incubare il piatto durante la notte a 4 ° C (non più di 20 h).
      Nota: La quantità di soluzione dispase può essere calcolata utilizzando 10 mL di soluzione di dispase per la digestione di ogni grammo di tessuto.
  2. Separazione dell'epidermide dal tessuto della pelle
    1. Il secondo giorno, staccare l'epidermide dal derma con pinzette bene.
      Nota: Se è difficile da staccare l'epidermide, la digestione dispase non era sufficiente, che di solito è a causa di insufficiente rifilatura del tessuto. In questo caso, il tessuto ha bisogno di un tempo di incubazione più lungo.
    2. Tritare l'epidermide pelato con 500 µ l di terreno di coltura cellulare in un impasto di tessuto usando lame di bisturi; Risospendere le con 10 mL di tripsina 0,25% in una provetta da 50 mL, quindi Incubare 20 min in un bagno di acqua a 37 ° C, con agitazione.
  3. Raccolta e messa in coltura di cellule primarie
    1. Neutralizzare l'attività della tripsina aggiungendo un uguale volume di soluzione di neutralizzazione (10 mL in questo protocollo).
    2. Dissociare le cellule epidermiche pipettando la soluzione su e giù per 20 volte con una pipetta sierologica di 10 mL e filtrare la soluzione delle cellule attraverso un colino di cella da 100 µm per rimuovere eventuali residui di tessuto residuo.
    3. Centrifugare la soluzione di cella a 200 x g per 5 min dopo filtrazione; Risospendere il pellet cellulare in mezzo di neutralizzazione per il lavaggio e, quindi, centrifugare nuovamente, a 200 x g per ottenere il pellet cellulare.
    4. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno del keratinocyte basso calcio, privo di siero (SFM). Prendere 10 µ l di questa soluzione per contare il numero totale delle cellule e, quindi, piastra circa 2 x 106 cellule con 10 mL di SFM in piastre di coltura delle cellule 100mm pretrattati con matrice di rivestimento (contenenti collagene di tipo I).
      Nota: Il rivestimento è un passo necessario per il metodo convenzionale.
    5. Cambiare il terreno di coltura ogni d 2.
      Nota: Controllare l'adesione delle cellule al microscopio prima e dopo la modifica il terreno di coltura.
    6. Le cellule del passaggio quando raggiungono circa l'80% confluenza.
      Nota: Tutti i piatti di cultura sono pretrattati con la matrice di rivestimento.

3. il nuovo metodo

  1. Pretrattamento del tessuto della pelle
    1. Raccogliere il tessuto come descritto sopra (punto 2.1) per il metodo convenzionale.
    2. Lavare il tessuto della pelle 1 x 10 ml di PBS e, quindi, pesano in un contenitore di plastica sterile di una bilancia elettronica (il peso è circa 1 g in questo protocollo).
      Nota: Il peso minimo del tessuto necessario per questo protocollo è 0,1 g, dal momento che è difficile ottenere un numero sufficiente di cellule se il campione di tessuto utilizzato è troppo piccolo. Non c'è nessun peso massimo del tessuto per questo protocollo, che in definitiva dipende la capacità di gestione dell'operatore.
    3. Utilizzare pinze per sciacquare il tessuto cutaneo con 10 mL di etanolo al 70% per 30 s.
    4. Incubare il tessuto 2 x 10 ml di soluzione di lavaggio (preparata al punto 2.1.1), per 5 minuti ogni volta.
      Nota: Tutti i passaggi di lavaggio indicati in precedenza vengono eseguiti in piastre di coltura cellulare di 100 mm all'interno di una cappa a flusso laminare (un cappuccio di coltura del tessuto).
    5. Trasferire il tessuto piatto sterile cultura di un'altra cella di 100 mm.
    6. Utilizzando lame di bisturi, tritare il tessuto accuratamente in un impasto di tessuto.
    7. Aggiungere 200 µ l di PBS ogni 5 min per mantenere i tessuti bagnati.
      Nota: Prendere circa 15 min per la procedura 3.1.5 - 3.1.7. Tutti i passaggi precedenti vengono eseguiti a temperatura ambiente.
  2. Digestione del tessuto cutaneo
    1. Trasferire la soluzione di tessuto omogeneizzato in una provetta da 50 mL. Aggiungere 10 mL di miscela di enzimi per ogni 1 g di tessuto cutaneo. Mescolare accuratamente gli enzimi con i tessuti omogeneizzati.
    2. Incubare la miscela con l'agitazione in un bagno di acqua a 37 ° C per 1 h.
    3. Aggiungere un volume di 1/5 di 0,25% tripsina (2,5 mL in questo protocollo) per la miscela di digestione per altri 30 min in un bagno di acqua a 37 ° C.
    4. Aggiungere dnasi I soluzione per la miscela di enzimi ad un rapporto di 1: 100 (v/v) (250 µ l in questo protocollo) e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  3. Raccolta e messa in coltura di cellule primarie
    1. Interrompere il processo di digestione con l'aggiunta di 12,5 mL di terreno di neutralizzazione in un rapporto 1:1. Dispensare la soluzione su e giù per circa 20 x, utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL per dissociare le cellule.
    2. Filtrare le cellule dissociate attraverso un colino di cella da 100 µm per rimuovere i residui di tessuto. Centrifugare il supernatante a 200 x g per 5 min, osservare la pallina nella parte inferiore del tubo.
    3. Scartare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 10 mL di mezzo di neutralizzazione e centrifugare nuovamente a 200 x g per 5 min raccogliere le cellule.
    4. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di inoculazione (G-medio dal punto 1.2.5) con 10 µM di Y-27632.
    5. Prendere 10 µ l della soluzione per contare il numero totale delle cellule e, quindi, piastra circa 2 x 106 cellule con 10 mL di G-medio in una piastra di coltura cellulare di 100 mm.
      Nota: Il passaggio gasose non è necessario per il nuovo metodo, e rimozione dello strato dermico non è richiesto.
    6. Dopo 3 d, sostituire il mezzo di inoculazione con il mezzo di SFM basso-calcio. Cambiare il terreno di coltura ogni d 2.
      Nota: Controllare l'adesione delle cellule prima e dopo aver cambiato il mezzo.
    7. Le cellule del passaggio quando raggiungono circa l'80% confluenza.
      Nota: Se necessario, pretrattare le cellule con tripsina 0.05% per 2 min e lavare le cellule con PBS per rimuovere contaminanti cellule dermiche prima trypsinizing delle cellule epidermiche.

4. cellule di passaggio

  1. Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS e, quindi, aggiungere 2 mL di tripsina 0,05% (per ogni piatto di 100 mm).
  2. Incubare le cellule in un incubatore (37 ° C con 5% CO2) per 5 min.
  3. Controllare le celle utilizzando un microscopio per assicurarsi che tutte le cellule hanno staccato dalla piastra di coltura.
  4. Aggiungere 8 mL di DMEM con 10% FBS per neutralizzare la reazione enzimatica e, quindi, raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL.
  5. Centrifugare a 200 x g per 5 min ottenere il pellet cellulare.
  6. Rimuovere il surnatante lentamente e, quindi, risospendere il pellet cellulare con 10 mL di terreno SFM e contare il numero di cellule.
  7. Piastra di 1 x 106 cellule con 10 mL di SFM in ogni piatto di cella di 100 mm.
  8. Modificare il mezzo ogni d 2.

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Results

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Diagrammi schematici del nuovo metodo (Figura 1A) e il metodo convenzionale (Figura 1B) sono presentati nella Figura 1. Il metodo convenzionale è una digestione in due fasi, che richiede una procedura di 2 giorni. Al contrario, il nuovo metodo è una digestione di One-Step, che dura circa 3 ore per eseguire. Cosa importante, il nuovo metodo di One-Step può ottenere due popolazioni (cellule epidermiche...

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Discussion

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Colta HKCs primario sono stati ampiamente utilizzati per curare le ferite in cliniche per più di tre decenni e, da quel momento, è stato sempre importante ottenere in modo efficiente un numero sufficiente di cellule per applicazioni cliniche in modo tempestivo. Quindi, in pratica, il metodo di isolamento convenzionale, che richiede la separazione dell'epidermide dal derma, rende difficile soddisfare queste esigenze, a causa della bassa resa delle cellule e la bassa capacità di passaggio di cellule adulte. Qui, descriviam...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dal National chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (2017YFA0104604), il programma generale della Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (NSFC, 81772093), la scienza e la tecnologia di sviluppo programma di Suzhou (ZXL2015128), la Fondazione con scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20161241) e un Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Contatore di celle automatizzato CountessInvitrogen Inc.C10227Conteggio automatico delle cellule 
Incubatore a CO2Thermo ScientificPer l'incubazione cellulare
Centrifuga Sorvall ST 16RThermo ScientificCentrifuga cellularea 75004380
Agitatore a temperatura costanteShanghai Boxun150036Per bagnomaria
Bilancia elettronicaHarbin Zhonghui1171193Per pesatura di tessuti
Piatto per coltura cellulareEppendorf30702115Per colture cellulari
Provetta da centrifuga da 50 mlKIRGEN171003Per centrifuga cellulare
Filtro cellulareCorning incorporato431792Filtrazione cellulare
Soluzione tamponata con fosfatoSolarbio Life ScienceP1020-500Soluzione di lavaggio
DMEMThermo ScientificC11995500Componente del mezzo di neutralizzazione
Definito K-SFMLife Technologies10785-012Terreno di coltura di cellule epidermiche
Penicillina StreptomicinaThermo Scientific15140-122Antibiotici
Siero fetale bovinoIndustrie biologiche04-001-1AC5Componente del mezzo di neutralizzazione
0,05% TrypsinLife Technologies25300-062Per dissociazione HKC
0,25% Tripsina Pechino Solarbio Scienza & TecnologiaT1350-100di dissociazione HKC
Life TechnologiesR-011-KPer la matrice di rivestimento
DispaseGibco17105-041Per l'isolamento HKC Collagenasi
di tipo ILife Technologies17100-017Per l'isolamento HKC
Desossiribonucleasi ISigma9003-98-9Per l'isolamento HKC
F12 Mix di nutrienti, HamsLife Technologiescomponente dell'integratore G-medium
B27Life Technologies17504044Fattore di crescita in G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Fattore di crescita in G-medium
Y-27632Sigma-AldrichY0503Inibitore ROCK
FungizoneGibco15290026Preparazione per
proteina umana ricombinante G-medium EGFGibcoPHG0311 Fattore di crescita nel
kit di conteggio delle cellule G-medium-8Thermo ScientificNC9864731Saggi di proliferazione cellulare e citotossicità
Citocheratina anti-umana del topo5Hewlett-Packard Development CompanyMA-20142Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il
marcatore di differenziazione degli HKCConiglio Anti-Umano LoricrinCovancePRB-145pPer la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HKC
Mouse anti-umano VimentinCell Signaling Technology3390Per la colorazione in immunofluorescenza dei fibroblasti dermici
Integrina e alfa; 6(GOH3)Santa Cruz SC-19622analisi in citometria a flusso di HKC
Rat IgG2a FITCSanta CruzSC-2831anticorpo di controllo negativo di &alfa; 6-integrina  nell'analisi della citometria a flusso 
51026333 Per il kit della matrice di rivestimento 31765035 la

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