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Articolo metodologico

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

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DOI:

10.3791/57796

⸱

3 luglio 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive metodi specifici per ottenere biochimico quantità di detersivo-solubilizzato TRPV1 per analisi spettroscopica. I protocolli combinati forniscono strumenti biochimici e biofisici che possono essere adattati per facilitare studi strutturali e funzionali per canali ionici dei mammiferi in un ambiente controllato di membrana.

Abstract

Canali ionici polimodali trasducono stimoli multipli di diversa natura allosterico dei cambiamenti; Queste conformazioni dinamiche sono difficili da determinare e rimangono in gran parte sconosciuti. Con gli avanzamenti recenti nella luce spargimento di singola particella cryo-elettrone microscopia (cryo-EM) le caratteristiche strutturali dei siti di legame dell'agonista e il meccanismo di attivazione dei diversi canali ionici, la scena è pronta per un'approfondita analisi dinamica di loro gating meccanismi di utilizzando approcci spettroscopici. Tecniche spettroscopiche quali risonanza paramagnetica elettronica (EPR) e risonanza doppia elettrone-elettrone (cervi) sono state principalmente limitate allo studio dei canali ionici procariote che può essere purificato in grande quantità. Il requisito per grandi quantità di proteine di membrana funzionale e stabile ha ostacolato lo studio dei canali ionici dei mammiferi utilizzando questi approcci. EPR e cervi offrono molti vantaggi, tra cui la determinazione della struttura e cambiamenti dinamici delle regioni della proteina mobile, anche se a bassa risoluzione, che potrebbe essere difficile da ottenere mediante cristallografia a raggi x o cryo-EM, e monitoraggio gating reversibile transizione (cioè, chiuso, aperto, sensibilizzato e desensibilizzati). Qui, forniamo i protocolli per l'ottenimento di milligrammi di funzionale detergente-solubilizzato transitoria del ricevitore potenziale catione canale sottofamiglia V membro 1 (TRPV1) che possono essere etichettati per spettroscopia EPR e cervi.

Introduzione

Con gli avanzamenti recenti nella singola particella cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM), strutture di canale ionico dei mammiferi sono stati ottenuti ad un ritmo straordinario. In particolare, gli studi strutturali dei canali ionici polimodali, ad esempio il vanilloide potenziale transitorio del ricevitore 1 (TRPV1), hanno fornito ulteriore comprensione della sua attivazione meccanismi1,2,3, 4 , 5. Tuttavia, sono necessari comprendere i loro meccanismi di gating e droga-associazione polimodali informazioni dinamiche su canali ionici incorporati in un ambiente di membrana.

Risonanza paramagnetica elettronica (EPR) e spettroscopie di risonanza (cervi) doppia elettrone-elettrone hanno fornito alcuni dei modelli meccanicistici più definitivi per ioni canali6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. questi approcci sono state principalmente limitati all'esame dei procarioti e dello ione archeal canali che producono una grande quantità di proteine detersivo-purificato quando sovraespresso nei batteri. Con lo sviluppo della produzione di proteine di membrana eucariotiche in insetto e cellule di mammifero per caratterizzazione strutturale e funzionale14,15,16, è ora possibile ottenere biochimici quantità di proteine detersivo-purificato per studi spettroscopici.

I segnali EPR e cervi derivano da un'etichetta di paramagneticspin (SL) (cioè, methanethiosulfonate) legata a un residuo di singolo-cisteina della proteina. Le etichette di spin segnalano tre tipi di informazioni strutturali: movimento, accessibilità e distanze. Queste informazioni consentono di determinare se i residui sono sepolti all'interno della proteina o sono esposti a membrana o ambiente acquoso nella apo e -ligando stati13,17,18,19. Nel contesto di una struttura ad alta risoluzione (quando disponibile), i dati EPR e cervi forniscono un insieme di vincoli per la derivazione di modelli dinamici nel loro ambiente nativo durante il monitoraggio reversibile gating transizione (cioè, chiuso, aperto, sensibilizzato e desensibilizzati). Inoltre, regioni flessibile che potrebbero essere difficile da determinare mediante cristallografia a raggi x o cryo-EM si otteneva utilizzando questi insiemi di dati ambientali per assegnare strutture secondarie così come la posizione all'interno della proteina20. Cryo-EM strutture ottenute in lipidi nanodiscs fornite preziose informazioni circa il gating dello ione canali3,21,22,23,24, 25; Tuttavia, approcci spettroscopici potrebbero fornire informazioni dinamiche da stati conformazionali (ad es., sbalzi termici) che potrebbe essere difficile da determinare utilizzando cryo-EM.

Molte difficoltà devono essere superate per implementare EPR e cervi, compresa la mancanza di funzione della proteina durante la rimozione di tutti i residui di cisteina (particolarmente abbondante nei canali dei mammiferi), proteine di basso rendimento, instabilità proteica durante purificazione e dopo spin labeling e l'aggregazione proteica in detergente o liposomi. Qui, abbiamo progettato protocolli per superare queste barriere critiche e hanno ottenuto informazioni di spettri di cervi ed EPR per un recettore sensoriale dei mammiferi. Lo scopo qui è di descrivere metodologie per l'espressione, purificazione, etichettatura e la ricostituzione di un ratto di cisteina-meno minimo funzionale TRPV1 (eTRPV1) costruire per analisi spettroscopiche. Questa metodologia è adatta per quelle proteine di membrana che mantengono la loro funzione nonostante la rimozione di residui di cisteina o contenenti cisteina che formano legami bisolfurico. Questa raccolta dei protocolli può essere adattata per l'analisi spettroscopica di altri canali ionici dei mammiferi.

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Protocollo

1. TRPV1 mutagenesi

Nota: Un costrutto di TRPV1 minimal per analisi spettroscopiche26 è stato costruito dal full-length cisteina-meno canale TRPV127 usando il metodo di reazione a catena (PCR) polimerasi (Figura 1). Questo costrutto di TRPV1 minimal cisteina-meno (denominato eTRPV1 in seguito) è costituito da residui 110-603 e 627-764. eTRPV1 è stato clonato in pMO (un vettore basato su pcDNA3.1) per l'analisi funzionale e in un donatore ricombinante vector28 contenente istidina-maltosio-binding protein (MBP): 8x-tabacco etch virus (TEV) per espressione e purificazione (Figura 2A). cisteina di singolo–eTRPV1 mutanti sono stati generati mediante mutagenesi sito-diretta. Sequenze di vettore e canale sono specificate nel supplementare File 1: metodi supplementari.

  1. Disegnare primers di mutagenesi con strumenti online29.
  2. Mescolare in un tubo di 0,2 mL: 5 μL di tampone di reazione, 1 μL di miscela del dNTP (100 mM), 1 µ l di 10 oligonucleotidi di forward e reverse μM, 1 μL di modello di 100 ng/μL eTRPV1 DNA26, 1.5 μL di DMSO, 1 μL di enzima di mutagenesi: 10x e 38,5 μL di acqua deionizzata. Girare l'impasto prima di mettere i tubi nel termociclatore.
  3. Eseguire la mutagenesi PCR.
    1. Eseguire (a) denaturazione a 95 ° C per 2 min, (b) denaturazione a 95 ° C per 20 s, (c) ricottura a 60 ° C per 10 s e (d) allungamento a 68 ° C per 4 min (30 s a 1 kb). Ripetere i passaggi da b a d per 18 cicli, poi eseguire allungamento a 68 ° C per 5 min e mantenere la reazione a 4 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
  4. Aggiungere 2 μL di Dpnho enzima alla reazione; mescolare e poi incubare a 37 ° C per 30 min.
  5. Eseguire la trasformazione
    1. Scongelare le cellule competenti di Escherichia coli sul ghiaccio.
    2. In una provetta sterile da 14mL pre-raffreddata, aggiungere 75 μL di cellule competenti e 10 μL di miscela PCR sono-trattato Dpn. Mescolare delicatamente.
    3. Incubare la reazione in ghiaccio per 30 min. mantenere il tubo a 42 ° C per 45 s e quindi immediatamente mettere in ghiaccio per 2 min piastra il composto su brodo di Luria (LB)-piastra di agar contenente carbenicillina (0,2 mg/mL). Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C.
    4. Raccogliere almeno tre singole colonie dalla piastra e inoculare ciascuna in 4 mL di LB contenente carbenicillina (0,2 mg/mL) utilizzando una provetta sterile 14 mL. Incubare le colture durante la notte a 37 ° C e agitare a 250 giri/min.
    5. Rotazione verso il basso durante la notte culture a 8.000 x g per 10 min ed estrarre il DNA seguendo le istruzioni del kit di mini-preparazione disponibili in commercio.
    6. Verificare la presenza di mutanti di singolo-cisteina mediante sequenziamento automatizzato standard (Vedi Tabella materiali).

2. analisi funzionale di eTRPV1 e singolo-cisteina mutanti

  1. Transfezione di linea delle cellule HEK293 30
    1. Coltura di cellule HEK293 in ben 6 - piastre in 2 mL di terreno alto glucosio (DMEM) per pozzetto (37 ° C, 5% CO2, 95% umidità). Preparare cellule HEK293 che sono 70 \u2012 80% confluenti.
    2. Preparare la miscela di transfezione in due provette separate di micro-centrifuga da 1,5 mL.
      1. Per quella A, aggiungere 0,5 µ g eTRPV1 o cisteina contenenti mutante pMO a 250 µ l di terreno minimo essenziale (ad es. Opti-MEM). Per reazione B, aggiungere 3 µ l di reagente di transfezione a 250 µ l di terreno minimo essenziale. Incubi ogni reazione per 5 min a temperatura ambiente (TA).
      2. Mescolare le reazioni A e B con una pipetta 1 mL. Incubare la miscela per 45 minuti a TA.
    3. Rimuovere ben 500 µ l di terreno di coltura dal 70-80% confluenti e aggiungere 500 µ l di miscela di reazione. Conservare le piastre durante la notte per Ca2 + imaging (37 ° C, 5% CO2e 95% di umidità).
  2. CA2 + imaging in cellule HEK293 30
    1. Pulire le lamelle di vetro del diametro di 12 mm con etanolo e acqua e inserirli in una piastra a 24 pozzetti.
    2. Aggiungere 75 µ l di poli-l-lisina al centro di ogni vetrino coprioggetto e memorizzare la piastra per 45 min (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità).
    3. Rimuovere i coprioggetti in eccesso di poli-l-lisina e lavare tre volte con tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere qualsiasi residuo.
    4. Una volta pronti i vetrini coprioggetti, procedere a staccare le cellule dalla piastra 6 pozzetti.
    5. Rimuovere il supporto e aggiungere 500 µ l di PBS caldo (37 ° C) per il lavaggio.
    6. Rimuovere il PBS, aggiungere 500 µ l di tripsina e incubare per 1 min.
    7. Aggiungere 500 µ l di media cultura calda (37 ° C) per interrompere la reazione di digestione e mescolare con la pipetta; evitare la formazione di bollicine. Se necessario, regolare la concentrazione di cellule diluendo la risospensione con più mezzi di coltura.
    8. Seme di 250 µ l di cellule HEK293 transfettate (70% confluenti) plus 250 µ l di terreno di coltura (ultimo volume di 500 µ l per pozzetto) su lamelle pre-trattate e lasciarli stabilirsi (per allegato) per 1-2 h nell'incubatrice (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità).
    9. Nel frattempo, preparare una soluzione di caricamento aggiungendo acido pluronic 0,02% e 1 µM Fluo-4-AM al buffer di una suoneria. Mescolare bene la soluzione.
    10. Rimuovere il supporto di cultura HEK293 dal pozzo e aggiungere 500 µ l della soluzione di caricamento. Incubare le cellule per 1 h (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità). Lavare le cellule Fluo-4-caricato due volte con il tampone caldo Ringer.
    11. Porre un coprivetrino con celle di caricare in una capsula Petri 10 mm in una fase di microscopio (usando un 10x obiettivo; 494 nm eccitazione e 506 nm emissione) per eseguire intracellulare Ca2 + misure.
    12. Misurare i cambiamenti nell'intensità di fluorescenza dopo che irrora i rispettivi ligandi (ad es., capsaicina di 10 μM) utilizzando il software disponibile in commercio (Vedi Tabella materiali).
  3. mRNA e preparazione di ovociti di Xenopus laevis 30
    1. Linearizzare eTRPV1 e singolo-cisteina contenenti mutanti pMO con PmeI per 1h a 37 ° C. Pulire il DNA seguendo le istruzioni del kit di purificazione disponibili in commercio.
    2. Uso linearizzato e pulita DNAs per sintetizzare RNA innevate con un kit disponibile in commercio compatibile con T7 RNA polimerasi.
    3. Pulire con un massimo di RNAs secondo kit di purificazione disponibili in commercio. Quantificare la quantità di RNA misurando l'assorbanza a 260 Nm.
    4. Trasferimento 5 \u2012 10 mL di X. laevis ovociti (disponibili in commercio) in una provetta conica da 50 mL contenente 20 mL di soluzione di ND96 (96 mM NaCl, KCl, 5 mM HEPES, di 2 mM 1 mM MgCl2; pH 7.4) con collagenasi di 1 mg/mL e nutate per 50 minuti a TA.
    5. Risciacquare gli ovociti in ND96 fino a quando la soluzione è limpida; aggiungere fresca collagenosi e agitare per 30 min a RT. esaminare gli ovociti sotto un microscopio stereo e interrompere la digestione quando lo strato esterno follicolare (strato lucido con i vasi sanguigni rossi) è assente nella maggior parte dei ovociti (90%). Risciacquare gli ovociti in ND96 fino a quando la soluzione è limpida.
    6. Trasferimento ovociti ad un tubo di polistirene da 50 mL con ND96 plus 1 mM CaCl2 e agitare per ovociti sotto-digerito di 1 h. si attaccano al tubo in polistirolo.
    7. Lavare gli ovociti con ND96 plus 1 mM CaCl2 e integratore soluzione con 50 µ g/mL di gentamicina e 50 µ g/mL di tetraciclina.
      Nota: Proteggere soluzioni contenenti tetraciclina da esposizione alla luce.
    8. Selezionare grandi ovociti senza membrane danneggiate e la visualizzazione di una netta separazione tra l'animale e il vegetale poli. Lasciate che gli ovociti recuperare per 4 h prima microiniezione a 16 ° C.
    9. Utilizzare pipette in vetro (O.D.: 1,11 millimetri, identificazione: 0,5 e lunghezza 8,8 cm) per iniettare ng 1-5 di mRNA da mutanti eTRPV1 e singolo-cisteina nei oocytes utilizzando un sistema di nanolitro-iniettore (46 nL/s) e un microscopio stereo (2 X ingrandimento). Conservare gli ovociti a 16 ° C in ND96 completati con CaCl2 e antibiotici (gentamicina/tetraciclina 1 x).
    10. Dopo 72 h, misura macroscopica corrente utilizzando un sistema di acquisizione tensione morsetto a due elettrodi (TEVC)31.
    11. Tirare pipette in vetro borosilicato (0,3 MΩ) e riempirli con 3M KCl.
    12. Posizionare l'ovocita in camera di registrazione usando una pipetta di trasferimento e irrorare la soluzione del bagno (120 mM NaCl, KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA e 10 mM HEPES soluzione di 2 mM; pH 7.4) a bassa velocità.
    13. Immergere entrambi gli elettrodi nella soluzione vasca per regolare loro pipetta offset. Spingere delicatamente gli elettrodi di pipetta (pipette in vetro borosilicato; O.D.: 1,5 millimetri, identificazione: 1.10 e lunghezza 10 cm) nel citoplasma dell'ovocita fino a quando una piccola rientranza è osservata sotto un microscopio stereo (2x), così come un cambiamento nel potenziale di membrana.
    14. Modificare le impostazioni di amplificatore a modalità e misura correnti macroscopiche di registrazione durante l'applicazione di una rampa di tensione-morsetto da -80 a + 80 mV per 1 s. carico il sistema di perfusione con la soluzione utilizzata nel passo 2.3.12 a pH 7,4 (come controllo) e a pH 5 per controllare l'attività di eTRPV1.

3. generare il Bacmid ricombinante e Baculovirus per l'espressione della proteina

  1. Bacmid
    1. Trasformare 100 μL di cellule competenti DH10Bac Escherichia coli con 7.5 ng del vettore ricombinante donatore contenente eTRPV1 e/o single-cisteina mutanti.
    2. Aggiungere 900 μL di media SOC (20mg/mL Tryptone, 5mg/mL lievito estratto, 2,5 mM KCl, 10mm MgCl2, 10mm MgSO4e 20 millimetri di glucosio) e incubare per 6-7 h a 37 ° C e a 225 giri/min.
    3. 100 µ l direttamente dalla miscela e da diluizioni seriali del seme (1/10 e 1/100), in piastre di LB-agar contenente 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 gentamicina μg/mL, 10 μg/mL tetraciclina e kanamicina 50 μg/mL. Incubare le piastre per almeno 48 h a 37 ° C.
    4. Selezionare colonie bianche che sono 2 mm di diametro, poiché mancano di colonie blu l'inserto di interesse. Utilizzare un microscopio stereo per verificare che colonie bianche non contengono alcun macchie blu.
    5. Raccogliere almeno tre singole colonie e trasferirle in una provetta sterile 14-mL contenente 4 mL di LB media completati con 7 μg/mL Gentamicina, tetraciclina di 10 μg/mL e 50 kanamicina μg/mL. Incubare le cellule durante la notte (~ 16 h) a 37 ° C e 250 giri/min.
    6. Prendere 1,5 mL delle culture durante la notte e isolare bacmid ricombinante del DNA (fare riferimento al File supplementari 1 per protocollo dettagliato). Memorizzare la bacmid a 4 ° C fino a due mesi.
      Nota: Preparare le scorte di glicerolo di DH10Bac e. coli contenente la bacmid del DNA. Prendere 300 μL di cultura e aggiungere 200 μL di glicerolo al 50% (concentrazione di glicerolo finale del 20%). Conservare l'aliquota a-80 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
    7. Verificare la presenza di eTRPV1 nel bacmid ricombinante mediante PCR (vedere complementare 1 File per protocollo dettagliato).
  2. Baculovirus
    Nota: Per questa procedura, transfect cellule di insetto Sf9 in un formato di 6 pozzetti. Tutti gli importi e i volumi sono fornite su base per-bene. Evitare l'uso di antibiotici.
    1. Piastra di 1 x 106 Sf9 cellule in 2 mL di media delle cellule dell'insetto. Consentire alle cellule di fissare per almeno 45 min.
    2. Diluire 1 μg di bacmid ricombinante del DNA in 100 μL di media delle cellule dell'insetto. Mescolare delicatamente.
    3. Diluire 6 μL di reagente di transfezione (TR) in 100 μL di media delle cellule dell'insetto. Mescolare delicatamente.
    4. Combinare le soluzioni di DNA e TR (da passaggi 3.2.2 e 3.2.3, rispettivamente). Mescolare delicatamente ed incubare per 30 minuti a TA.
    5. Aggiungere 0,8 mL di media delle cellule dell'insetto per la miscela di DNA/TR; mescolare delicatamente.
    6. Rimuovere il supporto di insetto delle cellule dalle cellule Sf9 e lavare una volta con 1 mL di terreno nuovo.
    7. Togliere la soluzione di lavaggio e aggiungere la miscela di DNA/TR (3.2.2 \u2012 3.2.5) per le cellule. Incubare le cellule a 27 ° C per 5 h (senza agitazione).
    8. La miscela di transfezione di rimuovere e sostituire con 2 mL di insetto cell supporti contenenti 0,5% siero bovino fetale (FBS). Incubare le cellule a 27 ° C per cinque giorni.
      Attenzione: Evitare l'evaporazione dei media cella riempiendo i pozzetti vuoti con i media e che copre il piatto 6-pozzetti con due strati di pellicola di paraffina.
    9. Trasferire i terreni di coltura delle cellule in una provetta da centrifuga 15 mL. Isolare il primo passaggio (P1) di stock virali facendo girare il tubo a 8.000 x g per 15 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una provetta pulita 15 mL centrifuga e immediatamente conservarlo a 4 ° C.
      Nota: Proteggere il virus da esposizione alla luce che copre il tubo con carta stagnola.
    10. Per la seconda generazione di stock virali (P2), mettere una cultura di 25 mL di sospensione di media delle cellule di insetto a 1 x 106 Sf9 cellule/mL contenente il 2% FBS in una beuta da 125 mL (pianura inferiore e ventilato). Aggiungere 25 μL del virus P1 alla cultura 25 mL.
    11. Incubare la coltura a 27 ° C per 72 h.
    12. Per raccogliere il brodo virale P2, trasferire la cultura ad un nuovo tubo da 50 mL e centrifugare esso a 8.000 x g per 15 min a 4 ° C.
    13. Trasferire il surnatante in una provetta da 50 mL nuova e immediatamente conservarlo a 4 ° C.
      Nota: Proteggere il virus da esposizione alla luce che copre il tubo con carta stagnola. Eseguire un esperimento su piccola scala per titolare il rapporto virus/Sf9 P2 per espressione di TRPV1 ottimale (vedere complementare 1 File per un protocollo dettagliato, sezione 4 intitolato "Esperimento su piccola scala per P2 virus.")
    14. Per l'espressione della proteina su larga scala, impostare una coltura di sospensione cellulare Sf9 1-L a 2 x 106 cellule/mL in insetto cell supporti completati con 0,5% FBS in un matraccio di vetro borosilicato 2,8-L.
    15. Aggiungere 1 mL di brodo virus P2 alla cultura 1-L e incubare a 27 ° C per 72 h.
      Nota: Il terzo giorno, la densità delle cellule dovrebbe essere a circa 1.5 a 2.5 x 106 cellule/mL.

4. eTRPV1 e singolo-cisteina mutante purificazione

  1. Membrane isolamento28
    1. Raccolta la coltura di sospensione 1-L insetto cellulare di filatura a 4.500 x g, 4 ° C, per 20 min. pesare il pellet cellulare (è previsto per essere intorno ai 6-9 g).
    2. Risospendere il pellet cellulare in 25 mL di tampone ghiacciata A (saccarosio 36,5 mM, 2 mM tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) e 50 mM Tris; pH 7.4) in presenza di inibitori della proteasi (1mm phenylmethyl sulfonil fluoruro (PMSF), 3 μg/mL leupeptina, 3 μg/mL aprotinina e 1 μg/mL pepstatin). Disaggregare ciuffi di cella per ottenere una sospensione omogenea e ruotare a 4 ° C per 20 min.
    3. Rompere le cellule utilizzando un manuale (lisata smerigliatrice di tessuto) o un omogeneizzatore ad alta pressione. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 8.000 x g per 20 min a 4 ° C.
      Nota: Tenere le cellule lisate e tubi sul ghiaccio durante l'intero processo.
    4. Raccogliere il surnatante e centrifugare a 100.000 x g per 30 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet di membrana in un volume totale di 20 mL di tampone B ghiacciata (150 mM NaCl, 10% glicerolo, 2mm TCEP, 50 mM HEPES; pH 7.4), completato con inibitori della proteasi (come al punto 4.1.2).
    5. Aliquota 20 mL di sospensione di membrana in provette da 50 mL e flash-congelamento in azoto liquido. Conservare i campioni a-80 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
  2. Purificazione della proteina26,28
    1. Scongelare le aliquote di membrana sul ghiaccio e aggiungere 3 mL di n-dodecilsolfato-β-D-Maltopyranoside (DDM) per tubo (stock di 200 mM). Ruotare il tubo per 2 ore a 4 ° C.
    2. Centrifugare il campione a 100.000 x g per 30 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e aggiungere 1 mL di resina di amilosio bagnato pulito. Ruotare la miscela per 2 ore a 4 ° C. Caricare la miscela di proteine/amilosio in colonne cromatografiche di gravità flusso.
      Attenzione: Non lasciare che la resina ad asciugare durante i lavaggi.
    3. Lavare la resina di amilosio legato alle proteine con 10 volte il volume del letto ghiacciata Buffer c (150 mM NaCl, 10% glicerolo, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectin, 0,5 mM TCEP; pH 7.4). Lavare con 10 letto volumi di gelida D Buffer (150 mM NaCl, 10% glicerolo, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectin, pH 7.4).
      Nota: Prima del lavaggio, degas Buffer D senza detersivo o lipidi, spurgo con azoto. Dopo degasaggio, aggiungere DDM e asolectin.
    4. Eluire la proteina di eTRPV1 con le frazioni di 0,5 mL, fino a 5 mL, di gelida degassato Buffer D, completati con maltosio 20 mM. Se possibile, eseguire il lavaggio e l'eluizione a 4 ° C.
    5. Quantificare la quantità di proteina misurando l'assorbanza a 280 Nm.
      Nota: Questo protocollo produce 0,5-1,0 mg di proteine per litro della cultura. La resa della proteina potrebbe variare per ogni mutante di singolo-cisteina eTRPV1. Per gli esperimenti EPR e cervi, crescere 4 \u2012 6L della cultura.

5. eTRPV1 singolo-cisteina Mutant Site-Directed Spin Labeling

  1. Concentrare le frazioni contenenti eTRPV1 utilizzando un'unità filtro centrifugo (cut-off = 100 kDa) fino a 2 \u2012 2,5 mg/mL per l'etichettatura (cicli di 7.000 x g per 2 min a 4 ° C).
  2. Aggiungere un eccesso molare 10 volte (3 volte, ogni 30 min) di etichetta di spin di metile (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) methanethiosulfonate (MTSSL) da una soluzione stock di 100 mM in DMSO a proteine concentrate (monomero di eTRPV1: MTSSL a 01:10 rapporto molare) 17. mantenere la reazione al buio a RT per 1 h 30 min, seguita da incubazione overnight a 4 ° C.
    Nota: In questo passaggio, MBP potrebbe essere rimosso aggiungendo proteasi TEV durante l'incubazione overnight spin-etichettatura.
  3. ETRPV1 spin-etichettato di carico su una colonna di cromatografia di esclusione di dimensione equilibrato in Buffer E (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM DDM; pH 7.4), controllata da un sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) proteine veloci. Raccogliere le frazioni contenenti eTRPV1 tetramero.
    Nota: Non includere 10% glicerolo in questo passaggio, poiché riduce l'efficienza di ricostituzione.
  4. Quantificare la quantità di proteina misurando l'assorbanza a 280 Nm.
  5. Valutare la purezza del campione eseguendo un gel di SDS-PAGE (gel senza macchia, 4 \u2012 20%). Il campione è pronto per misure spettroscopiche in soluzione e/o proteoliposomi.

6. eTRPV1 Spin-etichetta singola cisteina mutante ricostituzione

  1. Secco 10 mg di asolectin utilizzando un evaporatore rotante sotto vuoto (≤ 100 mbar) per 1 h a 40 ° C. Per rendere asolectin liposomi, aggiungere 1 mL di Buffer F (200 mM NaCl, 5 mM MOPS; pH 7.4) e Sonicare la miscela per 15 minuti o fino a quando il campione è omogeneo.
  2. Destabilizzare i liposomi aggiungendo DDM a una concentrazione finale di 2 mM ed incubare per 30 minuti a TA.
  3. Concentrare la proteina marcata a 2 mg/mL e aggiungerlo ai liposomi usando un rapporto di proteine/lipidi 1:5 (massa: massa).
    Attenzione: È importante mantenere le concentrazioni di proteina di cui sopra, poiché spin-etichettatura di efficienza diminuisce a concentrazioni basse e alle alte che la proteina potrebbe precipitare.
  4. Aggiungere Buffer F per regolare la miscela di proteine/liposoma alla concentrazione micellare critica DDM (CMC) e incubare per una notte a 4 ° C con agitazione delicata.
  5. Doppio del volume della miscela proteica/liposoma con Buffer F e Rimuovi detersivo aggiungendo in sequenza tre aliquote di adsorbente polistirene non polari (30 mg, 50 mg e 80 mg) a intervalli di 1-h con movimentazione delicata a TA.
  6. Caricare il composto su un filtro di colonna (colonna di cromatografia di gravità flusso) per rimuovere le perline e trasferire il composto proteoliposomi in un tubo di ultracentrifuga. Centrifugare i campioni a 100.000 x g per 1 h a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 30 μL di tampone F.
    Nota: I campioni sono pronti per l'analisi spettroscopica e iniezione in ovociti di Xenopus . Se i campioni non possono essere utilizzati nello stesso giorno, flash-freeze li in azoto liquido e conservare a-80 ° C.
  7. Proteoliposomi -Xenopus oocyte elettrofisiologia26,32
    1. Iniettare 50 nL di varie diluizioni dei proteoliposomi spin-labeled in ovociti di Xenopus come descritto nella sezione 2.2.
    2. Eseguire misurazioni TEVC dopo 12 h di iniezione come descritto nella sezione 2.3.10.
  8. Procedere per eseguire misure spettroscopiche e analisi (sezione 7).

7. cervi e spettroscopie EPR

  1. Spettroscopia di risonanza (cervi) doppia elettrone-elettrone.
    1. Effettuare misurazioni di cervi in uno spettrometro EPR pulsato operanti a Q-banda di frequenza (34 GHz) e dotato di un amplificatore 10 W con la sequenza di quattro-impulso libero tempo morto a 83° utilizzando il software fornito dal produttore33.
    2. Supplemento 50 µM di mutanti di cisteina con etichetta spin eTRPV1 detergente-purificato nel Buffer E (punto 5.5) con 30% (v/v) glicerolo per cryo-protezione.
    3. Caricare il campione in un tubo capillare di quarzo sigillato e spin alla parte inferiore del tubo mediante centrifugazione breve di bassa velocità (100 x g).
    4. Inserire il tubo capillare in azoto liquido per congelare il campione. I campioni possono essere conservati a questo punto a-80 ° C per la misurazione successiva.
    5. Il campione viene posto direttamente nel risonatore microonde e lasciarlo riequilibrare a-83 ° per 10 \u2012 20 min.
    6. Misurare il campione utilizzando un protocollo standard di cervo quattro-impulso, mw1 (π/2) – τ1 – mw1 (π) – τ1 – mw2 (π) – τ2 – (π) mw1 – τ2 – echo34. Le lunghezze di impulso per mw1 (π/2) e (π) mw1 sono rispettivamente 10 e 20 ns e 40 ns per mw2 (π). Impostare la frequenza di separazione a 63 MHz.
      Nota: Dati di decadimento primaria cervi possono essere analizzati con un casa costruita software (ad es. in Matlab) che presuppone una somma delle distribuzioni gaussiane per descrivere le distanze tra spin etichette19,35.
  2. Continuo-fluttuano spettroscopia EPR (CW)
    1. Esperimenti di CW EPR a RT su uno spettrometro X-band (9,6 GHz) utilizzando il software del produttore.
    2. Avviare lo strumento accendendo il refrigeratore d'acqua, la console e l'alimentatore del magnete. Collegare il software dello strumento, posizionare lo strumento in sintonia e aspettare almeno 30 min per lo strumento per riscaldarsi.
    3. Carico 20 µ l del campione dal passaggio 5.5 in un tubo capillare di vetro 25-µ l mediante azione capillare e sigillare l'estremità del tubo con sigillante.
    4. Caricare il tubo capillare nella cavità del forno a microonde e coppia criticamente il risonatore manualmente o automaticamente utilizzando la funzione di auto-tune del software.
    5. Raccogliere i primi spettri derivati sotto condizioni standard dello strumento: 100 kHz modulazione di forno a microonde, modulazione del campo magnetico di 1,6 G e 10 mW di potenza a microonde.
    6. Per l'analisi dei dati e la presentazione, correggere gli spettri sullo sfondo e normalizzarli dividendo gli spettri per il valore di picco-picco dell'integrale doppio.
    7. Determinare la mobilità spin-etichetta misurando l'inverso dello spessore della linea centrale del primo derivato spettri di assorbimento (ΔHo-1)36.

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Risultati

Caratterizzazione funzionale del minimo cisteina-meno TRPV1 costruire (eTRPV1) e Single-cisteina mutanti

Il primo passo verso gli studi spettroscopici è ingegnere e caratterizzare costrutti di cisteina-meno proteina (Figura 2A) che sono funzionali e biochimiche quantità di proteine di produrre. eTRPV1 è funzionale come determinato da Ca2 + imaging e TEVC (Figura 2B

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Discussione

Tecnologie attuali per espressione e purificazione di proteine di membrana dei mammiferi hanno reso possibile ottenere una quantità sufficiente di proteina per gli studi spettroscopici14,15,16,42. Qui, abbiamo adattato queste tecnologie per esprimere, purificare, ricostituire ed eseguire analisi spettroscopiche in TRPV1.

Tra i passaggi critici nel protocollo, qui sot...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Siamo molto grati al Dr. H. Mchaourab per fornire l'accesso per gli spettrometri EPR e cervi e Dr. T. Rosenbaum per fornire il plasmide di TRPV1 cisteina-meno full-length.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
QuikChange Kit per mutagenesi sito-diretta LightningAgilent Technologies210519-5
2-propanolo (isopropanolo)Fisher ScientificA416
Albumina Siero bovino (BSA)GoldBio.comA-420-10
Resina di amilosioNEBE8021L
AprotininaGoldBio.comA-655-25
Asolectina da soiaSigma11145
Bac-to-Bac Sistema di espressione del baculovirusInvitrogen Life Technologies10359016
Biobeads SM-2 Adsorbenti Bio-Rad152-3920
Pipette in vetro borosilicato (3,5'') (iniezione di ovociti)Drummond Scientific3-000-203 G/X
Pipette in vetro borosilicato (registrazioni di ovociti)Sutter InstrumentB150-110-10HP
CaCl2 2H2OFisher ScientificC79
Carbenicillina (Disodium)GoldBio.comC-103-5
Reagente cellfectinInvitrogen Life Technologies10362-010
cellSensOlympus
CloroformioFisher ScientificC606SK
Collagenasi Tipo 1Worthington-BiochemLS004196
CritisealVWR18000-299
D-(+)-GlucosioSigma G8270
D-(+)-Maltosio MonoidratoFisher ScientificBP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S
Mezzo ad alto glucosio (Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium)SigmaD0572 
Colonne di desalinizzazione monouso PD-10GE Healthcare45-000-148
EGTAFisher ScientificO2783
Siero fetale bovinoInvitrogen Life Technologies10082-147
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
GenCatch Plus Kit mini-preparazione del DNA plasmidicoEpoch Life Science, Inc2160250
Kit di pulizia GenCatch PCREpoch Life Science, Inc2360050
Gentamicina solfatoLonza17-518Z
Capillare in vetro (25 &; l)VWR53432-761
Pallone di vetro 2800 mLPyrex USA4423-2XL
GliceroloFisher BioReagentsBP229
HEK293S GnTl-ATCCCRL-3022
HEPESSigma H4034
IPTG (isopropil-tio-B-galattoside)GoldBio.com I2481C25
Kanamicina solfatoFisher ScientificBP906-5
KClFisher ChemicalP217
LB Brodo, MillerFisher bioReagentsBP1426
Leupeptin emisulfatoGoldBio.comL-010-5
Lipofectamina 2000Invitrogen Life Technologies11668-019
MgCl2 6H2OFisher ScientificBP214
MgSO4 7H2OFisher ScientificBP213
mMESSAGE mMACHINE T7 KitAmbionAM1344
MOPSFisher bioReagentsBP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl MetanotiosolfonatoToronto Research Chemicals, IncO873900
NaClFisher ChemicalS271
Opti-MEMLife Technologies31985-062
Pepstatina AGoldBio.comP-020-5
Acido pluronico F-127 (20%)PromoKine   CA707-59004
PMSFGoldBio.comP4170
Soluzione di poli-L-lisinaSigma-AldrichP4707
Rneasy Mini KitQiagen74104
Capillare sigillatoVitroComordine
SF-900 II SFM (terreno cellulare per insetti)Gibco, Life Technologies10902-088
Sf9 Cellule (adattate a SFM)Invitrogen Life Technologies11496-015
Estratto di lipidi polari di soiaAvanti Polar Lipids, Inc541602C
SaccarosioFisher ScientificS25590
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare29091596
TCEP HClGoldBio.comTCEP1
Tetraciclina cloridratoFisher ScientificBP912-100
Tris BaseFisher BioReagentsBP152
TriptoneDifco0123-01
X-galGoldBio.comX4281C
Xenopus ovocitiNascoLM00935M
XL1 - Blue Competent CellsAgilent Technologies, Inc200249
Lievito EstrattoDifco0127-01-7
Colonna per cromatografia Econo-PackBio-Rad7321010
Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricati senza macchieBio-Rad17000436
pFastBac1 Vettore di espressioneInvitrogen Life Technologies10360-014
DH10Bac Competent CellsInvitrogen Life Technologies10361-012
Sigillante per tubi capillari CritisealLeica Microsystems02-676-20
ABI Modello 3130XL Analizzatori geneticiApplied Biosystems4359571
Pipete di trasferimentoFishebrand13-711-9AM
Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
speciale

Riferimenti

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