Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Francisco J. Sierra-Valdez; Richard A. Stein; Phanindra Velissety; Valeria Vasquez; Julio F. Cordero-Morales

doi:10.3791/57796

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Articolo metodologico

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

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DOI:

10.3791/57796

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3 luglio 2018

Francisco J. Sierra-Valdez¹ , Richard A. Stein² , Phanindra Velissety¹^,³ , Valeria Vasquez¹ , Julio F. Cordero-Morales¹

¹Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, ²Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, ³CuriRX, Inc.

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive metodi specifici per ottenere biochimico quantità di detersivo-solubilizzato TRPV1 per analisi spettroscopica. I protocolli combinati forniscono strumenti biochimici e biofisici che possono essere adattati per facilitare studi strutturali e funzionali per canali ionici dei mammiferi in un ambiente controllato di membrana.

Abstract

Canali ionici polimodali trasducono stimoli multipli di diversa natura allosterico dei cambiamenti; Queste conformazioni dinamiche sono difficili da determinare e rimangono in gran parte sconosciuti. Con gli avanzamenti recenti nella luce spargimento di singola particella cryo-elettrone microscopia (cryo-EM) le caratteristiche strutturali dei siti di legame dell'agonista e il meccanismo di attivazione dei diversi canali ionici, la scena è pronta per un'approfondita analisi dinamica di loro gating meccanismi di utilizzando approcci spettroscopici. Tecniche spettroscopiche quali risonanza paramagnetica elettronica (EPR) e risonanza doppia elettrone-elettrone (cervi) sono state principalmente limitate allo studio dei canali ionici procariote che può essere purificato in grande quantità. Il requisito per grandi quantità di proteine di membrana funzionale e stabile ha ostacolato lo studio dei canali ionici dei mammiferi utilizzando questi approcci. EPR e cervi offrono molti vantaggi, tra cui la determinazione della struttura e cambiamenti dinamici delle regioni della proteina mobile, anche se a bassa risoluzione, che potrebbe essere difficile da ottenere mediante cristallografia a raggi x o cryo-EM, e monitoraggio gating reversibile transizione (cioè, chiuso, aperto, sensibilizzato e desensibilizzati). Qui, forniamo i protocolli per l'ottenimento di milligrammi di funzionale detergente-solubilizzato transitoria del ricevitore potenziale catione canale sottofamiglia V membro 1 (TRPV1) che possono essere etichettati per spettroscopia EPR e cervi.

Introduzione

Con gli avanzamenti recenti nella singola particella cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM), strutture di canale ionico dei mammiferi sono stati ottenuti ad un ritmo straordinario. In particolare, gli studi strutturali dei canali ionici polimodali, ad esempio il vanilloide potenziale transitorio del ricevitore 1 (TRPV1), hanno fornito ulteriore comprensione della sua attivazione meccanismi¹^,²^,³^, ⁴ ^, ⁵. Tuttavia, sono necessari comprendere i loro meccanismi di gating e droga-associazione polimodali informazi....