Substrati con rigidità nella gamma kilopascal sono utili per studiare la risposta delle cellule a rigidità di micro-ambiente fisiologicamente rilevanti. Utilizzando solo un microscopio a fluorescenza widefield, il modulo di Young di gel di silicone morbido può essere determinato utilizzando un rientro con una sfera adatta.
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Articolo metodologico
Misura di rigidità dei substrati in morbido Silicone per gli studi di Mechanobiology usando un microscopio a fluorescenza Widefield
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tessuti molli del corpo umano in genere hanno rigidità nell'intervallo kilopascal (kPa). Di conseguenza, substrati flessibili in silicone e idrogel hanno dimostrati di essere utile substrati per la coltura delle cellule in un microambiente fisico che imita parzialmente condizioni in vivo . Qui, presentiamo un semplice protocollo per la caratterizzazione di moduli di Young dei substrati elastici lineare isotropici in genere utilizzati per gli studi mechanobiology. Il protocollo è costituito da un substrato morbido silicone su una piastra di Petri o in silicone rigido la preparazione, ricoprire la superficie superiore del substrato in silicone con perline fluorescenti, usando una sfera di scala millimetrata per far rientrare la superficie superiore (per gravità), il fluorescente di imaging perline sulla superficie frastagliata in silicone utilizzando un microscopio a fluorescenza e analizzando le immagini risultanti per calcolare il modulo di Young del substrato del silicone. Superficie superiore del substrato del giunto con una proteina della matrice extracellulare di moduli (oltre le perline fluorescenti) consente il substrato del silicone per poter essere facilmente utilizzate per placcatura delle cellule e gli studi successivi utilizzando gli esperimenti di microscopia di forza di trazione. L'uso di silicone rigido, invece di una capsula di Petri, come base di morbido silicone, consente di utilizzare mechanobiology studi che coinvolgono il tratto esterno. Un vantaggio specifico di questo protocollo è che un microscopio a fluorescenza widefield, che è comunemente disponibile in molti laboratori, sia le principali attrezzature necessarie per questa procedura. Dimostriamo questo protocollo misurando il modulo di Young di substrati di morbido silicone di diversi moduli elastici.
Introduzione
Cellule in tessuti molli risiedono in un micro-ambiente in cui la rigidità è in kilopascal gamma1, contrariamente ai piatti di coltura del tessuto cui rigidità è diversi ordini di grandezza superiore. I primi esperimenti con cellule su substrati molli rivestite con proteine di matrice extracellulare ha mostrato che la rigidità del substrato influenza come cellule spostare e come aderiscano alla matrice extracellulare sotto2,3. Infatti, la rigidità del substrato influenza fondamentalmente il cellulare funzione4 in un modo simile a segnali biochimici pervasivi. Gel....
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Protocollo
1. fabbricazione di substrato morbido Silicone
- Pesare 1,75 g di un componente e 1,75 g di componente B (A:B = 1:1) dal kit di elastomero di silicone morbido utilizzando (polistirolo) pesatura vassoi.
- Aggiungere un componente a componente B nel vassoio di pesatura e mescolarli insieme per 5 min usando un bastoncino di appropriato.
- Aggiungere la miscela di cui sopra una piastra di Petri da 35 mm. Lasciare il composto diffondere in modo uniforme attraverso la piastra di Petri per un paio di minuti.
Nota: La scelta del diametro di Petri e la quantità di silicone morbido determinerà lo spessore di silicone morbido. Qui, lo spessore sarà cir....
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Risultati
Utilizzando il protocollo di cui sopraelencato, abbiamo preparato in silicone morbido in una capsula di Petri da 35 mm, guarito a 70 ° C per 30 min e accoppiato microsfere fluorescenti (collagene e io) sulla superficie superiore, come schematicamente rappresentato in Figura 1. UV profondo è stato utilizzato in precedenza per la proteina eventuale accoppiamento a substrati13. Nota che (I) le condizioni di reticolazione utilizzate q.......
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Discussione
Mentre il metodo di rientro di sfera è facile da implementare, attenzione attenta deve essere pagata per la scelta del penetratore e lo spessore del campione in morbido silicone. L'equazione utilizzata per calcolare il modulo di Young è valida sotto una serie di condizioni11e questi sono in genere soddisfatti quando lo spessore del campione del silicone è > 10% del raggio penetratore e < ~ 13 x il raggio del penetratore. Abbiamo trovato che uno spessore del silicone di 5-10 volte il raggio del pen.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Vi ringraziamo di generosamente permettendo l'uso di reometro Margaret Gardel. Riconosciamo il supporto dal NIH (1R15GM116082) che ha attivato questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit elastomero siliconico CY 52-276 A/B | Dow Corning | CY 52-276 | Conservare a temperatura ambiente |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Conservare a -20° C |
| Thermo Scientific Reticolante Pierce Sulfo-NHS | Fisher Scientific | PI-24510 | Negozio a 4° C |
| Particelle rosa fluorescente carbossiliche, 0,4-0,6 µ m, 2 ml | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Negozio a 4 gradi C, non congelare |
| Perle di zirconio lavate con acido da 1,0 mm | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Camera UV profonda con aspiratore di ozono | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Microscopio a fluorescenza ad ampio campo | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagene I, da coda di ratto | Corning | 354236 | Concentrazione di magazzino = 4 mg/ml; conservare a 4 gradi; C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | software di pubblico dominio |
Riferimenti
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesion....
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Ristampe e permessi
