È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

13.5K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/57801

⸱

6 giugno 2018

 ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

In questo articolo

Sommario

Elaborazione batch delle schermate di lievito 2-ibrido consente di confronto diretto tra i profili di interazione delle proteine multiple esca con un insieme molto complesso di proteine di fusione di preda. Qui, descriviamo raffinati metodi, nuovi reagenti e come implementare il loro utilizzo per tali schermi.

Abstract

Lo screening per le interazioni proteina-proteina usando il dosaggio di 2-ibrido del lievito è stato a lungo uno strumento efficace, ma il suo utilizzo in gran parte è stato limitato alla scoperta di interattori di alto-affinità che sono altamente arricchito nella biblioteca di candidati interagenti. In un formato tradizionale, il dosaggio di 2-ibrido del lievito può produrre troppo molte colonie per analizzare quando condotto presso stringenza dove potrebbero essere trovati Interactiani bassa affinità. Inoltre, senza un interrogatorio esaustivo e completo della stessa libreria contro esca diversi plasmidi, un'analisi comparativa non possono essere realizzata. Anche se alcuni di questi problemi possono essere risolto utilizzando librerie allinearono preda, il costo e l'infrastruttura necessaria per far funzionare questi schermi possono essere proibitivi. In alternativa, abbiamo adattato il dosaggio di 2-ibrido del lievito per scoprire contemporaneamente decine di transitori e interazioni proteina statico all'interno di un unico schermo che utilizzano una strategia definita profondo (arricchimento dinamico per la valutazione della proteina reti), che incorpora il sequenziamento del DNA di alto-rendimento e calcolo per seguire l'evoluzione di una popolazione di plasmidi che codificano interattori. Qui, descriviamo su misura reagenti e protocolli che consentono un profondo schermo per essere eseguito facilmente e a costi contenuti.

Introduzione

Una comprensione completa dei processi biologici delle cellule si basa sull'individuazione delle reti di interazione della proteina che sono alla base della loro meccanismi molecolari. Un approccio per identificare interazioni della proteina è il dosaggio di lievito 2-ibrido (Y2H), che funziona con l'assemblaggio di un fattore di trascrizione chimerica funzionante una volta due dominii della proteina di interesse associare ad uno altro1. Una tipica schermata di Y2H viene eseguita mediante la creazione di una popolazione di lievito che ospita sia una libreria di plasmidi che codificano le proteine interagenti fuse ad un attivatore trascrizionale (ad es., 'preda' proteina di fusione) e un plasmide dato 'esca' composta la proteina di interesse fusa a un dominio di legame del DNA (per esempio, il dominio legante il DNA di Gal4 che lega la sequenza d'attivazione Gal4-upstream). Uno dei principali vantaggi dell'approccio Y2H è che è relativamente facile e poco costoso per condurre in un tipico laboratorio attrezzato per lavoro biologico molecolare routine2. Tuttavia, quando tradizionalmente eseguita, un utente campioni diverse colonie che sorgono al momento della selezione per una positiva interazione Y2H. Questo limita fortemente il numero di cloni 'preda' libreria che può essere oggetto di indagine. Questo problema è aggravato quando l'abbondanza di una particolare preda interagente è molto alta rispetto alle altre, diminuendo la possibilità di rilevare l'interazione da plasmidi preda abbondanza bassa.

Una soluzione per l'utilizzo del principio di Y2H in una copertura completa del proteoma è l'uso di un approccio di matrice-formattato in cui una matrice contenente noto preda singoli plasmidi possa essere interrogata digitalmente. Tuttavia, tale approccio richiede un'infrastruttura che non è facilmente accessibile e conveniente per diversi ricercatori che sono interessati nella definizione Interactoma di un piccolo numero di proteine o domini3. Inoltre, librerie di prede molto complessa che possono codificare più frammenti di proteine interagenti sarebbero espandere le dimensioni di tali matrici matrice ai formati impraticabile. Un'alternativa consiste nell'eseguire saggi con librerie complesse in lotti e valutare la presenza di cloni interagenti mediante sequenziamento massivo di high throughput parallelo4. Questo può essere applicato per analizzare la presenza di prede plasmidi che sorgono nelle colonie multiple utilizzando un tipico Y2H formattato approccio nel quale lievito cellule alloggiamento un interagenti delle proteine di fusione sono autorizzate a crescere su una piastra5,6. Questa idea generale può essere accentuata per aumentare query di entrambi più esche e prede componenti al stesso tempo7,8.

Ancora, molte indagini richiedono che un più facile ancora più concentrati sforzo sulla proteina a pochi 'esche' e possono beneficiare più di una query esaustiva e semi-quantitativa di una libreria singola preda complessi. Abbiamo sviluppato e convalidato un metodo per eseguire gli studi di interazione della proteina su vasta scala utilizzando un principio di Y2H in batch formato4. Questo utilizza il tasso di espansione di un plasmide particolare preda come un proxy per la forza relativa di Y2H interazione9. Sequenziamento profondo di tutti i plasmidi all'interno di una popolazione sottoposta alla normale crescita o condizioni di crescita selettiva produce una mappa completa dei cloni che producono interazioni Y2H forti e deboli. Il repertorio di interattori possa essere ottenuto e confrontato direttamente attraverso più esca plasmidi. Il flusso di lavoro risultante definito profondo (arricchimento dinamico per la valutazione della proteina reti) quindi utilizzabile per identificare differenziale Interattomi dalle stesse librerie di preda per identificare le proteine, permettendo un confronto tra una proteina contro un altro.

Qui, noi dimostrare profondo e introdurre miglioramenti nei metodi di laboratorio che facilitano l'uso, che sono illustrati nella Figura 1. Miglioramenti significativi includono:

Generazione di popolazioni lievito preda. Uno dei requisiti chiavi di profondo sta generando popolazioni di lievito con i plasmidi di esche diverse che hanno la stessa distribuzione delle librerie preda del plasmide. Popolazioni di equivalente della linea di base della libreria plasmide preda sono essenziali per effettuare confronti accurati tra l'interattomi di diverse esche. Ciò si ottiene quando un plasmide di biblioteca occupa già una popolazione di lievito aploidi e lo spostamento di un plasmide dato esca in quella popolazione è ottenuto dall'accoppiamento per produrre un diploide. Qui, forniamo una guida chiara su come rendere tali popolazioni utilizzando librerie commerciali ospitate in lievito aploide. Anche se abbiamo trovato metodi che generano un elevato numero di diploidi, l'efficienza complessiva degli amori di questi ceppi di lievito commerciale libreria-contenente era basso. Di conseguenza, abbiamo costruito un nuovo ceppo che può ospitare la preda librerie che produce molto più diploidi per reazione di accoppiamento.

Nuovo set di plasmidi di esca. Molti plasmidi corrente che esprimono proteine di fusione 'esca' comprende della proteina di interesse e un dominio di legame al DNA sono basati su 2 µ, permettendo loro di amplificare il loro numero di copia. Questo numero di copia può essere abbastanza variabile nella popolazione e portare alla variabilità della risposta trascrizionale di Y2H. Questo a sua volta potrebbe inclinare la capacità di misurare la forza di un'interazione proteina data sulla base della risposta di crescita delle cellule in selezione. Questo può essere parzialmente indirizzo utilizzando un plasmide copia basso, alcuni dei quali precedentemente sono stati descritti come il pDEST32 commercialmente disponibili10. Abbiamo costruito un nuovo plasmide esca (pTEF-GBD) che produce proteine di fusione di dominio Gal4-DNA-binding all'interno di un plasmide copia basso basato su centromero TRP1 che trasporta il gene di resistenza Kanr che permette anche la clonazione di frammenti di esca sia a Monte e a valle del dominio legante il DNA di Gal4.

Libreria di frammento di nuovo ad alta densità Y2H. Abbiamo costruito un nuovo plasmide per librerie di casa Y2H preda e usato per costruire una libreria di Y2H altamente complessa composta casualmente tranciati frammenti di DNA genomico da Saccharomyces cerevisiae. Analisi di sequenza ha indicato che questa libreria ha avuto oltre 1 milione di elementi diversi, molto più complessi di lievito precedentemente descritti genomica Y2H plasmide biblioteche11. Con questa nuova libreria, siamo stati in grado di dimostrare che il flusso di lavoro profondo è abbastanza robusto per ospitare librerie complesse con molti plasmidi differenti in modo che sia affidabile e riproducibile.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. preparazione di supporti e piastre

Nota: Tutte le piastre devono essere effettuata come minimo 2 giorni prima dell'inizio del protocollo. I mezzi di comunicazione può essere fatto in qualsiasi punto. Tuttavia, il buffer lievito estratto peptone destrosio dell'adenina (bYPDA) deve essere effettuato il giorno in cui verrà utilizzato. Alcuni media è realizzata con un mix di supplemento che contiene un livello di adenina è maggiore di quello che viene in genere utilizzato. Maggior parte dei supplementi media minimi specificare adenina 10 mg/L. I supplementi identificati '+ 40Ade' specificare un totale di adenina 40 mg/L.

  1. Preparare la soluzione di glucosio (50% p/v). Per 1 L, sciogliere 500 g di D-(+)-glucosio in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Regolare il volume a 1.000 mL di utilizzando un cilindro graduato e filtro attraverso un filtro sterile di 0,2 µm in una bottiglia di archiviazione media sterile da 1.000 mL.
  2. Preparare a Estratto di lievito peptone destrosio (YPD) piastre. Per 1 L, sciogliere 20 g di Peptone e 10 g di Estratto di lievito in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempire fino a 960 mL con acqua distillata. Versare in una beuta da 2.000 mL e aggiungere 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 40 mL di glucosio di 50%. Miscelare bene agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  3. Preparazione completi sintetici media minimi (CSM)-Trp piastre. Per 1 L, sciogliere 6,7 g di lievito azoto Base senza aminoacidi in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempiono fino a 960 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 0,7 g di - Trp-incontrato mix di dropout, 20 mg di metionina e 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 40 mL di glucosio di 50%. Miscelare bene agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  4. Preparare piatti CSM-Leu-Met. Per 1 L, sciogliere 10,05 g di lievito azoto Base senza aminoacidi in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato e riempia fino a 940 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 1,005 g di - Leu-Met dropout mix e 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 60 mL di glucosio di 50%. Miscelare bene agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  5. Preparare piatti CSM-Leu-Trp. Per 1 L, sciogliere 10,05 g di lievito azoto Base senza aminoacidi in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempiono fino a 940 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 1,005 g di - Trp-Leu + 40Ade dropout mix, 240 mg di adenina e 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 60 mL di glucosio di 50%. Miscelare bene agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  6. Preparare piatti CSM-Leu-Trp-His. Per 1 L, sciogliere 10,05 g di lievito azoto Base senza aminoacidi in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempiono fino a 940 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 0,975 g di - Trp-Leu-la sua + 40Ade dropout mix, 240 mg di adenina e 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 60 mL di glucosio di 50%. Miscelare bene agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  7. Preparare piatti CSM-Leu-Trp-His-3AT. Per 1 L, sciogliere 10,05 g di lievito azoto Base senza aminoacidi in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempiono fino a 940 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 0,975 g di - Trp-Leu-la sua + 40Ade dropout mix, 240 mg di adenina e 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Utilizzare una pipetta per aggiungere 60 mL di glucosio di 50%. Miscelare in 100 µ l di uno stock di sterile 1 M di 3-amino-1, 2,4 triazolo (3AT) agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  8. Preparare piastre LB-Kanr. Per 1 L, Estratto di sciogliere 10 g di triptone, 5 g di lievito e 10 g di NaCl in 800 mL di acqua distillata acqua in un becher da 1.000 mL. Versare in un cilindro graduato, riempiono fino a 1.000 mL di acqua distillata. Versare in un 2.000 mL di beuta e aggiungere 15 g di agar. Autoclave e raffreddare a bagnomaria a 37 ° C fino a quando la temperatura del bagnomaria è raffreddato a circa 42-50 ° C. Aggiungere 50 mg kanamicina e mescolare agitando.
    1. Versare una serie di piastre di 100 mm con 20 mL di media di pipetta.
  9. Preparare YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp e CSM-Leu-Trp-i suoi supporti. Utilizzare la procedura sopra per piastre tranne che invece di riversare in un matraccio di Erlenmeyer, versare in una bottiglia di archiviazione multimediale e omettere l'agar.
  10. Preparare bYPDA (memorizzato nel buffer YPDA). Prendere terreno YPD sterile e aggiungere adenina 200 mg/L in acqua distillata sterile. Regolare il pH a 3,7 con HCl. filtro attraverso un filtro sterile di 0,2 µm in una bottiglia sterile.
  11. Preparare il tampone di trasformazione: sorbitolo 2 M, 1 M litio acetato diidrato, 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM di cloruro di calcio in acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterile 0,2 µm in una bottiglia sterile.
  12. Preparare la soluzione di PEG: 70% w/v polietilene glicole 3350 in acqua distillata. Sterilizzare in autoclave.
  13. Preparare Twirl: glicerolo a 8m urea, SDS 4% w/v, 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% v/v, 0,02% w/v bromofenolo in sterile di acqua distillata.
  14. Preparare sTE (forte TE): 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 in acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterile 0,2 µm in una bottiglia sterile.
  15. Preparare la soluzione di riserva di Zymolase: 10 mg/mL Zymolase 100T a 50mm potassio fosfato bibasico pH 7.5, buffer di glicerolo 50% v/v in sterile distillata acqua (conservato a-20 ° C).

2. clonazione e verifica dei plasmidi esca

Nota: Costruzione del dominio di legame del DNA, Gal4 plasmidi. Attualmente, ci sono una varietà di sistemi di Y2H commercialmente disponibile e accademicamente. PROFONDO può ospitare molti di questi, purché il plasmide esca esprimenti la proteina di interesse fusa a un dominio di legame al DNA è in un TRP1-contenenti il plasmide. Altri requisiti a valle che sono la sequenza immediatamente a Monte della biblioteca preda inserto è noto e che un'interazione positiva di Y2H può essere segnata dalla produzione di His3 consentendo selezione media privo di istidina. Qui descriveremo l'uso di un nuovo plasmide esca di Y2H (pTEF-GBD, Figura 2), tuttavia, altri plasmidi di esca Y2H tra cui pGBKT7 possono essere usati pure. Per la costruzione e valutazione di esca plasmidi, descriveremo uso di pTEF-GBD. Come nota generale, si consiglia di sintesi di geni per la produzione di un telaio aperto-lettura che aderisce per il bias di codone lievito per garantire buona espressione e la facilità con la clonazione. Garantire che il regime di clonazione consente dell'esca per essere in-frame con il dominio di legame al DNA di Gal4 e che quando la clonazione nel sito 3', un codone di arresto segue la regione di codificazione di esca.

  1. Preparare il vettore plasmidico. Plasmide pTEF-GBD permette per la clonazione di un frammento che codifica per la proteina di interesse 5' o 3' della regione che codifica per il dominio di legame al DNA di Gal4 utilizzando un metodo di assemblaggio rapido. Per inserimento al 5' luogo, digerire 3 µ g di pTEF-GBD con NarI ed EcoRI o per l'inserimento nel sito 3', digerire con BamHI e XhoI per 2-4 h. Electrophorese campione in agarosio all'1% del DNA del gel contenente 0,2 - 0,5 µ g/mL etidio bromuro (EtBr) a 100 V. asportare la bp taglio 5.630 TEF-GBD e purificare utilizzando un kit di estrazione del gel del DNA in conformità con le istruzioni del produttore e quantificare il DNA di assorbanza a 260 nm di spettrofotometro12.
    Nota: Generazione di inserti esca-codifica. Frammenti di DNA codifica proteine o frammenti della proteina di interesse possono essere realizzato utilizzando sintesi di geni e disponibile come frammenti non duplicate. È consigliabile che i codoni sono ottimizzati per l'espressione in Saccharomyces cerevisiae e strumenti online per l'ottimizzazione del codone sono inclusi nell'elenco dei materiali.
  2. Per 5' inserimento, fiancheggiano il frammento di DNA che codifica un codone di inizio ATG da 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'e 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3, rispettivamente. Per 3' inserimento nel telaio con dominio di legame al DNA di Gal4, fiancheggiano il frammento codifica di 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'e 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Per la costruzione del plasmide, utilizzare il metodo di assemblaggio rapido come specificato nelle istruzioni del produttore per clonazione frammenti in taglio pTEF-GBD.
    1. Piastra tutto trasformato e. coli sulle piastre di LB-Kanr e incubare per 16-20 h a 37 ° C. Colonie di alloggiamento pTEF-GBD con l'inserto desiderato possono essere identificati dall'amplificazione di PCR usando i oligonucleotides: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' e 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' inserto e 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' e 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' per 3' inserto. Questi oligonucleotidi possono anche servire come primer per la sequenziazione l'inserto.
    2. Piano sulla preparazione > 10 µ g di ogni derivato pTEF-GBD e pTEF-GBD da soli a fornire materiale per le trasformazioni di sequenziamento e lievito.
    3. Utilizzare le seguenti condizioni PCR: 3 min a 98 ° C, seguita da 25 cicli di 30 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e a 2 minuti a 72 ° C, seguita da 5 min a 72 ° C, utilizzando un buffer contenente 2,5 mM MgCl2 , U/100 0,5 µ l DNA polimerasi e buffer proprietarie.

3. espressione di proteine di fusione Gal4-DNA-binding Domain

  1. Rendere il lievito competente.
    1. Stock e strofinarlo delicatamente su tutta la piastra YPD congelati striscia fuori PJ69-4A lievito su una piastra di YPD prendendo un applicatore di legno sterile, raschiando 1 mm3 di a-80 ° C. Spostare l'applicatore di legno giù la piastra in modo che ogni passaggio attraversa una parte incontaminata della superficie del supporto. Incubare la piastra YPD a 30 ° C per 2 giorni o fino a quando le singole colonie sono visibili. Rendere il brodo congelato di lievito PJ69-4A di sospensione di lievito in acqua o crescita media, completando con DMSO al 7% e alla conservazione a-80 ° C.
    2. Inoculare una singola Colonia in 5 mL di coltura di YPD in un tubo di cultura 20 x 150 mm utilizzando un applicatore di legno sterile e crescere durante la notte a 30 ° C in un incubatore d'agitazione a 200 giri/min.
    3. Inoculare 50ml di YPD in un 250 mL di beuta sterile con 4 mL di cultura durante la notte del ceppo di lievito PJ69-4A. Crescere in un incubatore d'agitazione a 30 ° C, 200 giri/min per una densità ottica (OD600) di circa 1.2, come determinato mediante spettrofotometria con un percorso di luce standard da 1 cm. Crescita di solito prende 5-7 h.
    4. Isolare lievito di sedimentazione in un 50 mL di tubo conico a 4.696 x g per 5 min a temperatura ambiente in una centrifuga da banco. Gettare il surnatante di dumping in rifiuti liquidi. Utilizzando una pipetta, risospendere il pellet in 5 mL di tampone di trasformazione e trasferimento a 15 mL di tubo conico. Resediment per eliminare il surnatante e risospendere il lievito in 1 mL di volume finale del buffer di trasformazione con una pipetta di 1000 µ l.
    5. Incubare le cellule di lievito per 60 min a 30 ° C mentre si stringono a 200 giri/min e poi metterli su ghiaccio per 30-90 min.
  2. Trasformazione del plasmide di lievito.
    1. In 1,5 mL di tubo del microcentrifuge sterili, aggiungere 1 µ g di plasmide pTEF-GBD-basato e 5 µ l di vettore di sperma di salmone 10 mg/mL soluzione di DNA. Includono anche una provetta contenente solo del DNA di vettore di sperma di salmone come controllo negativo trasformazione. Aggiungere 100 µ l della sospensione delle cellule di lievito ghiacciata in ogni provetta mediante pipetta. Aggiungere 100 µ l del 70% soluzione PEG con una pipetta 1000 µ l e mescolare delicatamente, spostando il tubo di 5 - 10 volte (Centrifugare).
    2. Incubare a 30 ° C, in un incubatore d'agitazione a 200 giri/min per 45 min.
    3. Shock termico a 42 ° C per 15 min.
    4. Sedimenti in una microcentrifuga a 845 x g per 3 min a temperatura ambiente, pipettare fuori ed eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 150 µ l di acqua sterile pipettando su e giù e si sviluppa su una superficie di una piastra di CSM-Trp.
    5. Posto sul lato destro di piastre fino in incubatore a 30 ° C ed incubare per 2-3 giorni fino a quando le colonie sono visibili. Piastre possono essere capovolto per evitare formazione di condensa sulla superficie della piastra dopo incubazione a 30 ° C per 6-12 h.
    6. Prendere 2-3 colonie per trasformazione e striscia come un cerotto su una piastra di CSM-Trp utilizzando uno stuzzicadenti sterile. Permettono di crescere per 24 h a 30 ° C.
  3. Fare lisati per l'espressione della proteina.
    1. Inoculare 3 mL di liquido media CSM-Trp con un match-testa-dimensioni di lievito dalla patch e crescere durante la notte a 30 ° C in un tubo di cultura 20 x 150 mm, mentre si stringono a 200 giri/min. Fare due culture durante la notte per esche e vettore vuoto pTEF-GBD.
    2. Aggiungere 1 mL di YPD per ogni 3 mL di CSM-Trp cultura durante la notte. Crescere per 1 h a 30 ° C, mentre si stringono a 200 giri/min. Controllare il diametro esterno delle cellule mediante lo spettrofotometro.
    3. Sedimento un numero equivalente di cellule, normalizzazione secondo il diametro esterno. Utilizzare sterili da 1,5 mL di microcentrifuga con un giro di 5 min a 2.348 x g a temperatura ambiente in una microcentrifuga. Utilizzare una pipetta per eliminare il surnatante. Lo stock finale corrisponde a un minimo di 2,1 OD.
      Nota: Quando si calcola il numero equivalente di cellule, può accadere che diversi volumi possono essere richiesti da ogni cultura durante la notte per raggiungere il minimo OD 2,1.
    4. Risospendere il pellet in 450 µ l di 0.2 M NaOH pipettando su e giù. Incubare per 5 min a temperatura ambiente. Recentrifugare cellule per 2 min a 2.348 x g a temperatura ambiente e scartare il surnatante mediante pipetta.
    5. Risospendere il pellet con 50 µ l di tampone TWIRL pipettando su e giù con attenzione tale da non rendere le bolle. Campione di calore per 5 min a 70 ° C.
  4. Verifica per l'espressione della proteina da SDS-PAGE.
    1. Uso di un gel di pendenza di 4-20% per garantire una vasta gamma di pesi molecolari possono essere risolti. Carico equivalente importo (stesso OD) dei campioni in una SDS-PAGE gel e assicurarsi di includere almeno un campione contenente le non modificato pTEF-GBD vettoriale13,14,15.
    2. Dopo la separazione elettroforetica, trasferimento gel a nitrocellulosa e immunoblot utilizzando anticorpi monoclonali o policlonali anti--myc e soluzione di rilevamento ECL (Figura 3).

4. auto-attivazione Test

  1. Striscia fuori il lievito MATalpha dello stock di-80 ° C corrispondente al ceppo ospita la biblioteca di preda di interesse su un piatto YPD prendendo un applicatore di legno sterile, raschiando una piccola quantità di lievito dal flaconcino e colpi di luce su tutta la piastra YPD. Incubare la piastra YPD a 30 ° C per 2 giorni o fino a quando le singole colonie sono visibili. Patch un paio singole colonie su una piastra di YPD e incubare per una notte a 30 ° C.
    Nota: Il nuovo ceppo sviluppato qui alla libreria di casa preda è PLY5725 considerando che alcune librerie compatibili di Y2H disponibili in commercio sono alloggiati in Y187.
  2. Seguire le procedure in 3.3.1 - 3.3.4 per trasformare PLY5725 con LEU2-basato del plasmide utilizzato per ospitare la biblioteca desiderata preda. Per le librerie sviluppate qui, il plasmide corrispondente è pGal4AD (pPL6343). Per recuperare il lievito trasformanti, piastra al CSM-Leu-Met piastre. Dopo colonie derivano, streak come patch su una piastra di CSM-Leu-Met e incubare per 24 h a 30 ° C.
  3. Seguire il protocollo in 3.4 per confermare l'espressione di pPL6343 vettore vuoto utilizzando-HA anticorpi monoclonali o policlonali e soluzione di rilevamento ECL.
  4. Striatura che ciascuno del lievito PJ69-4A trasformato in uno schema a croce con PLY5725 costruisce su una piastra YPD che è stata confermata di esprimere la proteina nel protocollo sezione 3.4 e 4.3 e incubare a 30 ° C durante la notte. Prendere 1 mm3 delle cellule dove i due ceppi sono cresciuti insieme e patch sul separati CSM-Leu-Met, CSM-Trp e CSM-Trp-Leu piastre e crescere 24h.
    Nota: Desiderate diploidi crescerà sulle piastre CSM-Trp-Leu. Crescita sul CSM-Leu-Met e CSM-Trp piastre servono come controllo positivo per la crescita del lievito.
  5. Crescere diploidi in 1 mL di media di CSM-Trp-Leu durante la notte a 30 ° C. Celle di 500 µ l di sedimento in un 1,5 mL di microcentrifuga tubo a 2.348 x g, 3 min a temperatura ambiente in una microcentrifuga. Gettare il surnatante mediante pipetta. Risospendere le cellule in 1 mL di acqua sterile e ripetere la sedimentazione e la risospensione. Verifica il OD600 delle cellule.
  6. Effettuare una serie di 01:10 diluizioni seriali di ogni sospensione cellulare utilizzando acqua sterile con la maggior parte a partire concentrato soluzione di ciascuno a un OD di 0,5. Spot 5 µ l di ciascuna diluizione in un piatto di CSM-Leu-Trp, un piatto CSM-Leu-Trp-His e un CSM-Leu-Trp-suo + 3AT piastra. Incubare a 30 ° C e per ispezionare i crescita ogni giorno oltre 3 giorni (Figura 4).
    Nota: per le 01:10 diluizione seriale, Pipettare 10 µ l di provetta contenente un OD 0,5 in 90 µ l di acqua e Miscelare pipettando su e giù. Continuare a fare 01:10 diluizioni seriali fino a quando c'è un totale di sei diverse concentrazioni da individuare.

5. creare lievito popolazioni con esche e prede biblioteca

Nota: Il ceppo di Y187 che ospita plasmidi biblioteca commerciale preda non accoppiarsi bene. Così, le seguenti condizioni ottimizzate sono tenute a mantenere la complessità della biblioteca. Il PLY5725 ceppo contenenti Y2H preda librerie compagni meglio e la stessa procedura di accoppiamento può essere utilizzata con questo ceppo (Figura 5).

  1. Inoculare un 3 mL di culture di ciascuno dei transformants di PJ69-4A che trasportano i vari TRP1-contenente del plasmide esca pTEF-GBD CSM-Trp media in un tubo di cultura. Sono due culture separate contenenti il plasmide vettore pTEF-GBD da solo per fungere da controlli procedurali. Incubare le colture a 30 ° C, 200 giri/min per 6 h e poi diluire in un 25 mL di coltura in una beuta sterile per la crescita durante la notte.
  2. Scongelare una fiala di congelati (-80 ° C) delle cellule MATalpha contenente il LEU2-che trasportano "preda" biblioteca a temperatura ambiente. Inoculare un 125 mL di CSM-Leu-Met media in una beuta sterile con la fiala intera scongelata. Crescono tutte le culture una notte a 30 ° C con agitazione a 200 giri/min.
    Nota: Il OD600 delle culture durante la notte deve essere compresa tra 1,0-1,5 prima di procedere ai passaggi successivi.
  3. Centrifugare 21 equivalenti OD di ognuna delle culture PJ69-4A transformant con un giro di 5 min a 4.696 x g a temperatura ambiente. Per ogni 10 reazioni di accoppiamento desiderato, pellet 39 OD600 equivalenti del ceppo MATalpha che trasportano i plasmidi di biblioteca in separato 50 mL di provette coniche.
    1. Risospendere le cellule in 10 mL di acqua sterile e ri-pellet in 50 mL di nuovo tubo conico 4.696 x g 5 min a temperatura ambiente in una centrifuga da banco. Utilizzando una pipetta, rimuovere delicatamente il supernatante senza interrompere le cellule pellettate.
    2. Risospendere il pellet di cellule PJ69-4A in 4 mL di e cellule PLY5725 in 10 mL di bYPDA (pH 3,7).
  4. Reazioni di accoppiamento, aggiungere 1 mL di PJ69-4A trasformato cellule, 1 mL di MATalpha biblioteca contenente cellule e 1 mL di bYPDA pH 3,7 a nuovo 50 mL di tubo conico a set-up. Incubare a 30 ° C con agitazione orbitale delicato (100-130 giri/min) per 90 min.
    1. Centrifugare le cellule per 5 min a 4.696 x g, a temperatura ambiente in una centrifuga da banco. Rimuovere il surnatante mediante pipetta e risospendere il pellet in 2 mL di 1:1 bYPDA:YPD. Piastra ogni 2 mL di su un piatto YPD 100 mm mediante pipetta e incubare a 30 ° C per circa 20 h.
  5. Raccogliere le cellule dalle piastre YPD utilizzando un raschietto di cella per sloggiare le cellule in 2-3 mL di CSM-Leu-Trp media. Pipettare sloggiato le cellule in un 50 mL di tubo conico. Sciacquare le piastre 4 - 5 volte con 2-3 mL di CSM-Leu-Trp media pipettaggio fino il supporto utilizzando un 1000 µ l pipette ed espellendo delicatamente i media attraverso la superficie della piastra YPD.
    1. Centrifugare le cellule per 5 min a 4.696 x g e a temperatura ambiente in una centrifuga da banco. Gettare il surnatante mediante pipetta e risospendere le cellule in 40 mL di CSM-Leu-Trp media pipettando su e giù (non centrifugare).
  6. Per stimare il numero di cellule diploidi formata, diluire 4 µ l della miscela diploide in 200 µ l e 2000 µ l CSM-Trp-Leu media. Piastra di 200 µ l di ciascuna diluizione in un piatto di CSM-Leu-Trp.
    Nota: Le due piastre rappresentano una diluizione 1: 10.000 e 1: 100.000 di piega dello stock di diploidi raccolte e ottenendo un previsto ~ 9.000-27.000 colonie sulla piastra di diluizione di 1: 10.000 dopo incubazione a 30 ° C per 36-40 h. Check piastre dopo passo 5.7. È richiesto un numero minimo di 200 colonie sulla piastra di diluizione di 1: 10.000 per procedere al passaggio 5.8
  7. Immediatamente prendere il resto di ogni 40 mL di risospensione delle cellule e inoculare un 1.000 mL di beuta contenente 500 mL di CSM-Leu-Trp media. Prendere un iniziale OD600. Incubare queste boccette a 30 ° C con agitazione a 180 giri/min fino a quando non raggiungono la saturazione (~2.0 OD/mL). Questo richiede in genere circa 36-40 h. crescita di Monitor a 24 h poi di nuovo a 36 h OD600.
  8. Utilizzando una pipetta, rimuovere 20 mL di aliquote da ciascuno dei saturi 500ml di culture e innoculate 2.000 mL di matracci di Erlenmeyer, uno da 750 mL di CSM-Leu-Trp media e la seconda contenente 750 mL di CSM-Leu-Trp-His con livello più basso della 3AT che Elimina sfondo (stabilito in precedenza nella sezione 4.5). Mescolare le nuove culture (770 mL) accuratamente agitando e prendere un iniziale OD600.
  9. Incubare le colture a 30 ° C mentre si stringono a 180 giri/min fino a raggiungere la saturazione, che in genere si verifica entro 24 h per la cultura di CSM-Leu-Trp non selezionata e può prendere oltre 70 h per culture sotto selezione per Y2H interazioni.
  10. Una volta culture hanno raggiunto la saturazione (OD ~ 2.0), rimuovere 11 mL di pipetta, sedimenti le cellule con un giro di 5 min a 4.696 x g a temperatura ambiente, scartare il surnatante mediante pipetta e congelare a-20 ° C o continuare sulla estrazione del DNA. I campioni selezionati e non selezionati saranno entrambi utilizzati per sequenziamento profondo.

6. preparazione del campione per profondo Deep Sequencing

  1. Estrazione del DNA.
    1. Utilizzare una pipetta per risospendere il pellet cellulare da protocollo sezione 5.7 in 500 µ l di tampone di sTE e trasferimento a un 1,5 mL di tubo del microcentrifuge. Aggiungere 3 µ l di betamercaptoethanol e 10 µ l di brodo di Zymolase. Mescolare bene e incubare nell'incubatore 37 ° C per 24-36 h.
    2. Estrarre il campione due volte con 500 µ l fenolo/cloroformio/alcool isoamilico durante l'utilizzo di un cappuccio di fumi16.
    3. Aggiungere 7 µ l di 4 M di NaCl, 900 µ l di ghiaccio freddo 100% di etanolo (ETOH), mix di inversione e o congelare a-20 ° C o continuare a sedimenti del DNA di filatura a 21.130 x g per 10 min a temperatura ambiente in una microcentrifuga.
    4. Gettare il surnatante mediante pipetta. Lavare la pallina tre volte con 900 µ l di 70% ETOH.
    5. Sedimento a pellet 21.130 x g per 2 minuti e rimuovere il residuo lavaggio ETOH mediante pipetta. Pellet asciutto per 7 min a 42 ° C.
    6. Risospendere il pellet in 120 µ l di 0.1 x sTE in bagnomaria a 37 ° C per 90 min, scorri le provette per mescolare ogni 30 min.
    7. Pipettare 60 µ l di DNA estratto in una sterile 1,5 mL di tubo del microcentrifuge. Aggiungere 120 µ l di sTE, 3,5 µ l di brodo di RNasi A, flick di miscelare e incubare a 37 ° C per 1 h.
    8. Precipitato di etanolo come precedentemente fatto nella sezione 6.1.3 - 6.1.5, ma utilizzare 7 µ l di acetato di ammonio 5m invece di 4 M di NaCl.
    9. Risospendere RNasi DNA un trattato in 55 µ l di 0.1 x sTE in bagnomaria a 37 ° C per 90 min, scorri le provette per mescolare ogni 30 min. quantificare DNA di assorbanza a 260 nm in uno spettrofotometro.
  2. Inserti di cDNA PCR.
    1. Eseguire due, reazioni di PCR di 50 µ l per campione di DNA. Ogni reazione contiene 25 pmoli di ciascun primer forward e reverse, il plasmide preda-biblioteca di corrispondenza (Vedi materiali). Reazioni anche contenere 25 µ l di x PCR ad alta fedeltà 2 Master Mix, 5 µ g di campione di DNA e acqua fino a 50 µ l. Amplify reazioni per 25 cicli con tempi di estensione di 3 min a 72 ° C, una temperatura di ricottura di 55 ° C per 30 s e denaturare a 98 ° C per 10 s. Precede ciclismo da una denaturazione s 30 a 98 ° C e seguire con un'incubazione di 5 min a 72 ° C.
    2. Analizzare 4 µ l di ogni reazione di PCR mediante elettroforesi in gel dell'agarosi del DNA 1% con il DNA dell'agarosi gel contenente 0,2 - 0,5 µ g/mL di EtBr17. Visualizzare campione di DNA con transilluminazione UV. Campioni mostrerà una sbavatura del DNA circa 1-3 kb, dove il disegno a strisce può essere trovata per campioni dove un'interazione di Y2H è stata selezionata (Figura 6).
    3. Combinare i campioni duplicati di PCR e purificare utilizzando il kit di purificazione di PCR in accordo con le istruzioni del produttore e quantificare il DNA di assorbanza a 260 nm in uno spettrofotometro.

7. deep sequencing

Nota: La preparazione del campione e l'ordinamento su una piattaforma di sequenziamento profondo è in genere disponibile in commerciali e accademiche delle strutture di nucleo del sequenziamento del DNA.

  1. Taglio 600 ng del prodotto PCR utilizzando un rendimento elevato ultra-sonicatore per dare frammenti di una lunghezza media di ~ 300 bp.
  2. Indicizzata sequenziamento librerie utilizzando un kit di preparazione per sequenziamento profondo che aggiunge linker codifica codici a barre, adescamento siti, di generare e acquisire sequenze asimmetricamente sulle estremità dei frammenti del DNA.
  3. Eseguire la libreria preparazione secondo le istruzioni del produttore. Piscina indicizzati in librerie e sequenza come lungo accoppiato-fine letture su una piattaforma di sequenziamento profondo (ad es., 2 x 150 bp PE letture). Il numero desiderato di letture mirate per ogni campione è compreso tra 10 e 40 milioni, con letture più desiderate per le popolazioni non selezionate che sono in genere più complesse. Si consiglia di almeno 20 milioni o più letture per le popolazioni non selezionate.

8. Bioinformatic elaborazione e verifica

  1. Ordinamento dei dati in forma di fastq con un insieme di software stand-alone programmi costruite per (1) tracciare la sequenza di leggere i file in un formato universale di SAM (2) quantificare del DNA processo arricchimento gene tra DataSet (3) effettuare analisi statistiche dei dati in ordine di rango quale candidato geni sono positivi per l'interazione Y2H (4) fornire informazioni per quanto riguarda che cosa regione e cosa traslazionale frame del cDNA preda al gene frammenti che resa positiva Y2H interazioni sono composti da (5) strumenti per ricostruire non solo il 5' ma anche all'estremità 3' dei frammenti d'interazione permette loro ricostruzione e la verifica in un formato di Y2H tradizionale. Funzionamento di questi programmi è dettagliato nello studio d'accompagnamento.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Il dosaggio di Y2H è stato ampiamente utilizzato per la ricerca di interazioni proteina/proteina e diversi adattamenti e sistemi sono stati sviluppati. Per la maggior parte, le stesse considerazioni che aiutano a garantire il successo con questi approcci precedenti sono importanti per profondo. Sono alcuni dei punti di riferimento importanti: garantire espressione del dominio di legame al DNA proteine di fusione, garantendo un basso fondo di spurie suo + crescita in diploidi contenente l'...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Qui forniamo una guida per come eseguire le analisi di Y2H in batch utilizzando metodi ottimizzati. Ci sono pochi passaggi critici nella procedura per garantire che la popolazione di lievito che sarebbe stato posto sotto selezione è rappresentante della libreria di partenza e che basta con la popolazione di lievito partenza viene utilizzato per subire la selezione per limitare la variabilità . D'importanza, questi benchmark sono relativamente facili da realizzare a fianco di adattare i metodi e i materiali per un dosaggi...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Ringraziamenti

Ringraziamo il personale all'interno l'Istituto di genetica umana per il sequenziamento e preparazione di biblioteca NGS. Ringraziamo Einat Snir per la sua esperienza nella preparazione di frammenti di libreria genomica per la libreria di plasmide Y2H fatta qui. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health: R21 NIH EB021870-01A1 e da NSF Research Project Grant: 1517110.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Illumina HiSeq 4000di sequenziamento profondoIllumina
Anticorpi monoclonali anti-HABiolegend901514 Anticorpo primario per rilevare l'espressione di HA nei costrutti pGal4AD Anticorpi
policlonali anti-mycQED Biosciences Inc18826Anticorpo primario per rilevare l'espressione di MYC nei costrutti pTEF-GBD NarI
New England BioLabsR0191S
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
BamHI-HFNew England BioLabsR3236S
XhoINew England BioLabsR0146S
Polietilenglicole 3350, polvereJ.T. BakerU2211-08
Salmon Sperm DNATrevigen, Inc venduto da Fisher Scientific50-948-286DNA trasportatore per la trasformazione del lievito Sezione 3.2.1.
Kanamicina monosolfatoResearch Products InternationalK22000
LE AgaroseGeneMateE-3120-500utilizzato per la produzione di gel di DNA agarosio
Sodium ChlorideResearch Products InternationalS23025
TryptoneResearch Products InternationalT60060
D-SorbitoloResearch Products InternationalS23080
Acetato di litio diidratoMP Biomedicals155256
Cloruro di calcioThermoFisherC79
EDTA Sale di sodio Prodottidi ricerca internazionaliE57020
Estratto di lievito in polvereProdotti di ricerca internazionaliY20020
Lievito base di azoto (solfato di ammonio) senza aminoacidiInternationalY20040
CSM-TRP-LEU+40ADEFormediumDCS0789
CSM-TRP-LEU-HIS+40ADEFormediumDCS1169
CSM-LEU-METFormediumDCS0549
CSM-TRP-METBio 101, Inc4520-922
L-MetioninaFormediumDOC0168
AdenineResearch Products InternationalA11500
D-(+)-GlucoseResearch Products InternationalG32045
Bacto AgarBD214010utilizzato per la produzione di piastre per terreni nella sezione 1
PeptoneResearch Products InternationalP20240
3-ammino-1,2,4 TriazoleSigmaA8056
2- Mercaptoehanol (BME)Sigma-AldrichM6250
Zymolyase 100TUSBiologicoZ1004
Fosfato di potassio bibasicoSigmaP8281
Fenolo:Cloroformio:IAAAmbionAM9732
Acetato di ammonioSigma-Aldrich238074
EthanolDecon Laboratories, INC2716
RNAsi AThermoFisherEN0531
UreaResearch Products InternationalU20200
SDSResearch Products InternationalL22010
gliceroloSigma AldrichG5516
Tris-HClGibco15506-017
blu di bromofenoloAmresco449
Kit di clonazione per l'assemblaggio GibsonNew England BiolabsE5510SMetodo di assemblaggio rapido per la clonazione di plasmidi nella sezione 2
NEBNext 2x PCR Master Mix NewEngland BiolabsM0541SUtilizzato per l'amplificazione di prodotti per l'assemblaggio Gibson nella sezione 2.3 e per la preparazione del campione per il sequenziamento profondo DEEPN nella sezione 6.2.1
Bromuro di etidioAmresco0492-5G
Kit di purificazione QIAquick PCRQiagen28104Utilizzato per la purificazione dei prodotti pcr nella sezione 6.2.3
Qiaquick Kit di estrazione del gel di DNAQiagen28704Utilizzato per la purificazione del pTEF-GBD digerito nella sezione 2.1
Kit KAPA Hyper Prep KitKAPA BiosystemsKK8500per il sequenziamento profondo
http://www.jcat.deottimizzazione del codone
Ottimizzazione dei codonihttps://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocksIntegrated DNA TechnologiesFrammenti di DNA utilizzati per la clonazione nella Sezione 2.2
StringheThermofisherFrammenti di DNA utilizzati per la clonazione nella Sezione 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep KitEPOCH Life SciencesUtilizzato per preparare quantità di DNA nella Sezione 2.3
Covaris E220Ultra-suonatore ad alte prestazioniCovaris
oligo nucelotide 5'- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'		Tecnologie DNA integrate o Thermofisherutilizzate per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr 5' inserto pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide
oligo nucelotide 5'-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3'		Tecnologie DNA integrate o Thermofisherutilizzato per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr 5' inserto pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide
oligo nucelotide 5'-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3'		Tecnologie DNA integrate o Thermofisherutilizzate per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr Inserto da 3' pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide
oligonucelotide 5'-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3'		Integrated DNA Technologies o Thermofisherutilizzati per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr 3' insert pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide
oligonucleotide 5'-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3'		Integrated DNA Technologies o Thermofisher5' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto di pGAL4AD
oligonucelotide 5'-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3'		Integrated DNA Technologies o Thermofisher3' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto dell'oligonucelotide pGAL4AD
5'-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3'		Integrated DNA Technologies o Thermofisher5' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto di pGADT7
oligonucelotide 5'- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3'		Integrated DNA Technologies o Thermofisher3' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto del ceppo di lievito pGADT7
PJ69-4A MatAhttp://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: librerie genomiche e un ceppo ospite progettato per una selezione altamente efficiente di due ibridi nel lievito. GENETICA 1996 144:1425-1436MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBDDr. Robert Piper LabGal4-DNA binding doimain espressione plasmide
pGal4AD (pPL6343)Dr. Robert Piper LabGal4-activation domain expression plasmid
100 mm Petri platesKord-Vallmark venduto da VWR2900
125 mL pallone di ErlenmeyerPYREX Fisher ScientificS63270
pallone da 250 mL di PYREX FisherScientificS63271
1.000 mL di pallone di Erlenmeyer PYREXFisher ScientificS63274
pallone di Erlenmeyer da 2.000 mLFisher ScientificS63275
provetta di coltura monouso da 20 x 150 mmThermofisher14-961-33
pipetta-aidDrummond4-000-100
mL Pipetta sierologicaDenvilleP7127
10 mL Pipetta sierologicaDenvilleP7128
25 mL Pipetta sierologicaDenvilleP7129
1.000 mL PYREX Griffin BeakerFisher Scientific02-540P
1.000 mL PYREX Flacone per la conservazione dei terreni riutilizzabileFisher Scientific06-414-1D
Cilindro graduato da 1.000 mLFisher Scientific08-572-6G
SpectraMax 190Dispositiviutilizzati per misurare la densità ottica delle cellule
NanoDrop 2000Thermo Scientific SpettrofotometroND-2000utilizzato per quantificare la quantità di DNA
UV elettronico transilluminatoreUltra LumMEB 20utilizzato per visualizzare il DNA in un gel di agarosio di bromuro di etidio
P1000 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123602G
P200 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123601G
P20 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123600G
P10 Gilson PIPETMANFisher ScientificF144802G
1250 µ L Puntali per pipette a bassa ritenzioneGeneMateP-1236-1250
200 &; Puntali per pipette di ritenzione LLowVWR10017-044
10 & Puntali per pipette a bassa ritenzione L XL VWR10017-042
Provetta conica da 50 mLVWR490001-627
Provetta conica da 15 mLRaschietto cellulare VWR490001-621
Denville ScientificTC9310
Provette per microcentrifuga da 1,5 mLUSA Scientific1615-5500
HClFluka Analytical318949-1L
NaOHJ.T. Baker5674-02
Applicatori in legnoSolon Care55900
Microcentrifuga Eppendorf 5424Fisher Scientific05-400-005microcentrifuga
Sorvall ST16RThermo Fisher Scientific 75004381centrifuga da banco
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked Ab intero (da asino)GE HealthcareNA934-1MLAnticorpo secondario
Amersham ECL IgG di topo, Ab intero legato a HRP (da pecora)GE HealthcareNA931-1MLAnticorpo secondario
SuperSignal West Pico Substrato chemiluminescenteThermo Fisher Scientific34080Soluzione di rilevamento ECL
Incubatore IsotempIncubatore Thermo Fisher Scientific
Mutitron 2INFORS HTIncubatore a scuotimento
Isotemp Bagno d'acqua a controllo digitale Modello 205Fisher ScientificBagno d'acqua
Libreria di cDNA di topo Y2H in Y187 (tessuto piatto)LibreriaClontech 630482disponibile in commercio Libreria
di cDNA di topo Y2H in Y187 (cervello di topo)Clontech630488libreria di cDNA disponibile in commercio
pGADT7 AD VectorClontech630442vettore AD disponibile in commercio che ospita molte librerie di cDNA
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech630443disponibile in commercio DNA-BD Vector
Biolase DNA polimerasiBiolineBIO-21042DNA polimerasi utilizzata per la sezione 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal CyclerBioExpressP-6050-60pcr
TempAssure 0,5 mL provette per PCRStati Uniti Scientifico1405-8100
Piattaforma di in sezione 7 5 molecolari di cDNA

Riferimenti

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Interazioni proteina proteinametodo DEEPNsequenziamento profondocostruzione del plasmide escapreparazione della libreria predereazioni di accoppiamento del lievitoprotocollo di estrazione del DNAamplificazione PCRelaborazione bioinformatica
Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.