Analisi di co-immunoprecipitazione utilizzando proteine endogene nucleari da cellule coltivate in condizioni di ipossia

Xiaofeng Zheng; Calvin Qing Wei Ho; Xiaowei Zheng; Kian Leong Lee; Katarina Gradin; Teresa S. Pereira; Per-Olof Berggren; Yusuf Ali

doi:10.3791/57836

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Articolo metodologico

Analisi di co-immunoprecipitazione utilizzando proteine endogene nucleari da cellule coltivate in condizioni di ipossia

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DOI:

10.3791/57836

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2 agosto 2018

Xiaofeng Zheng¹^,² , Calvin Qing Wei Ho¹ , Xiaowei Zheng³ , Kian Leong Lee⁴ , Katarina Gradin⁵ , Teresa S. Pereira³ , Per-Olof Berggren¹^,²^,³ , Yusuf Ali¹^,²

¹Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, ²Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, ³The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, ⁴Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, ⁵Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un protocollo di co-immunoprecipitazione per studiare le interazioni proteina-proteina tra proteine endogene nucleari in condizioni di ipossia. Questo metodo è adatto per la dimostrazione delle interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali all'ipossia.

Abstract

Bassi livelli di ossigeno (ipossia) innescano una serie di risposte adattative con il Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) che agisce come un regolatore matrice complessa. HIF-1 è costituito da una subunità α ossigeno-regolato di heterodimeric (HIF-1 α) e costitutivamente espresso subunità β (HIF-1 β) noto anche come arilico dell'idrocarburo del recettore nucleare translocator (ARNT), regolazione di geni coinvolti in diversi processi tra cui l'angiogenesi , eritropoiesi e glicolisi. L'identificazione di proteine interagenti HIF-1 è la chiave per la comprensione dell'ipossia via di segnalazione. Oltre alla regolazione della stabilità di HIF-1 α, ipossia attiva inoltre la traslocazione nucleare di molti fattori di trascrizione tra cui HIF-1 α e ARNT. In particolare, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati per lo studio di tali interazioni proteina-proteina (PPIs) sono basata su sistemi dove i livelli della proteina sono aumentati artificialmente attraverso la sovraespressione della proteina. Sovraespressione di proteine spesso porta a risultati non-fisiologica derivanti dagli elementi spaziali e temporali. Qui descriviamo una co-immunoprecipitazione modificata a seguito del trattamento di ipossia utilizzando proteine nucleari endogene e come un proof of concept, per mostrare l'interazione tra HIF-1 α e ARNT di protocollo. In questo protocollo, le cellule ipossiche sono state raccolte in condizioni ipossiche e tampone di lavaggio di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) era anche pre-equilibrato a condizioni di ipossia prima dell'uso per mitigare la degradazione della proteina o proteina complessa dissociazione durante la riossigenazione. Inoltre, le frazioni nucleari sono stati successivamente estratti per concentrare e stabilizzare le proteine nucleari endogene ed evitare possibili risultati spuri spesso visto durante la sovraespressione della proteina. Questo protocollo consente di dimostrare endogeni e nativi di interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali in condizioni di ipossia.

Introduzione

L'ipossia si verifica quando viene fornito ossigeno insufficiente di cellule e tessuti del corpo. Esso svolge un ruolo critico in vari processi fisiologici e patologici, quali il differenziamento di cellule staminali, infiammazione e cancro¹^,². Fattori inducibili dall'ipossia (HIFs) fungono da eterodimeri composto di una subunità α ossigeno-regolato e una subunità β costitutivamente espressa anche conosciuto come ARNT³. Tre isoforme della subunità HIF-α (HIF-1 α, HIF-2α e HIF-3 α) e tre subunità HIF-β (ARNT/HIF-1 β, ARNT2 e ARNT3) sono state identificate fino ad oggi. HIF-1 α e ARNT son....