Articolo metodologico

Analisi di co-immunoprecipitazione utilizzando proteine endogene nucleari da cellule coltivate in condizioni di ipossia

DOI:

10.3791/57836

⸱

2 agosto 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo un protocollo di co-immunoprecipitazione per studiare le interazioni proteina-proteina tra proteine endogene nucleari in condizioni di ipossia. Questo metodo è adatto per la dimostrazione delle interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali all'ipossia.

Abstract

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Bassi livelli di ossigeno (ipossia) innescano una serie di risposte adattative con il Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) che agisce come un regolatore matrice complessa. HIF-1 è costituito da una subunità α ossigeno-regolato di heterodimeric (HIF-1 α) e costitutivamente espresso subunità β (HIF-1 β) noto anche come arilico dell'idrocarburo del recettore nucleare translocator (ARNT), regolazione di geni coinvolti in diversi processi tra cui l'angiogenesi , eritropoiesi e glicolisi. L'identificazione di proteine interagenti HIF-1 è la chiave per la comprensione dell'ipossia via di segnalazione. Oltre alla regolazione della stabilità di HIF-1 α, ipossia attiva inoltre la traslocazione nucleare di molti fattori di trascrizione tra cui HIF-1 α e ARNT. In particolare, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati per lo studio di tali interazioni proteina-proteina (PPIs) sono basata su sistemi dove i livelli della proteina sono aumentati artificialmente attraverso la sovraespressione della proteina. Sovraespressione di proteine spesso porta a risultati non-fisiologica derivanti dagli elementi spaziali e temporali. Qui descriviamo una co-immunoprecipitazione modificata a seguito del trattamento di ipossia utilizzando proteine nucleari endogene e come un proof of concept, per mostrare l'interazione tra HIF-1 α e ARNT di protocollo. In questo protocollo, le cellule ipossiche sono state raccolte in condizioni ipossiche e tampone di lavaggio di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) era anche pre-equilibrato a condizioni di ipossia prima dell'uso per mitigare la degradazione della proteina o proteina complessa dissociazione durante la riossigenazione. Inoltre, le frazioni nucleari sono stati successivamente estratti per concentrare e stabilizzare le proteine nucleari endogene ed evitare possibili risultati spuri spesso visto durante la sovraespressione della proteina. Questo protocollo consente di dimostrare endogeni e nativi di interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali in condizioni di ipossia.

Introduzione

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L'ipossia si verifica quando viene fornito ossigeno insufficiente di cellule e tessuti del corpo. Esso svolge un ruolo critico in vari processi fisiologici e patologici, quali il differenziamento di cellule staminali, infiammazione e cancro1,2. Fattori inducibili dall'ipossia (HIFs) fungono da eterodimeri composto di una subunità α ossigeno-regolato e una subunità β costitutivamente espressa anche conosciuto come ARNT3. Tre isoforme della subunità HIF-α (HIF-1 α, HIF-2α e HIF-3 α) e tre subunità HIF-β (ARNT/HIF-1 β, ARNT2 e ARNT3) sono state identificate fino ad oggi. HIF-1 α e ARNT sono espresso ubiquitariamente, considerando che HIF-2α, HIF-3 α, ARNT2 e ARNT3 hanno limitato più espressione modelli4. Il complesso della proteina HIF-1 è il regolatore chiave della risposta ipossia. In condizioni di ipossia HIF-1 α diventa stabilizzato, poi trasloca nel nucleo e dimerizza con ARNT5. Successivamente, questo complesso si lega a specifici nucleotidi conosciuti come elementi reattivi di ipossia (HREs) e regola l'espressione di geni bersaglio coinvolti in diversi processi tra cui l'angiogenesi, eritropoiesi e glicolisi6. Oltre a questa risposta "canonica", la via di segnalazione di ipossia è noto anche per diafonia con risposta cellulare più vie come tacca e nucleare della fattore-kappa B (NF-κB) di segnalazione7,8,9.

L'identificazione delle proteine interagenti romanzo HIF-1 è importante per una migliore comprensione dell'ipossia via di segnalazione. In contrasto con ARNT, che è insensibile ai livelli di ossigeno e costitutivamente espressa, i livelli della proteina HIF-1 α sono strettamente regolati dai livelli di ossigeno cellulare. Al normoxia (21% di ossigeno), proteine di HIF-1 α sono rapidamente degradata10,11. La breve emivita di HIF-1 α al normoxia presenta sfide tecniche specifiche per la rilevazione della proteina da estratti cellulari, così come per l'identificazione di proteine che interagiscono HIF-1 α. Inoltre, diversi fattori di trascrizione, compresi quelli del complesso HIF-1 traslocano nel nucleo sotto condizioni di ipossia12,13,14. La maggior parte dei metodi attualmente utilizzati per studi di PPI sono eseguita usando non-fisiologica iperespressione delle proteine. Tale sovraespressione della proteina è stata segnalata per causare difetti cellulari differenti attraverso i meccanismi multipli compreso sovraccarico delle risorse, squilibrio stechiometrico, interazioni promiscue e via modulazione15,16. In termini di studi PPI, sovraespressione della proteina può portare a falsi negativi positivi, o addirittura falsi, risultati a seconda delle proprietà della proteina e le funzioni delle proteine overexpressed. Pertanto, i metodi attuali per gli studi di PPI necessario essere modificato al fine di rivelare la PPIs fisiologicamente rilevanti in condizioni ipossiche. Precedentemente abbiamo dimostrato l'interazione tra HIF-1 e il fattore di trascrizione famiglia Ets GA-legante della proteina (GABP) in cellule P19 hypoxic, che contribuisce alla risposta del promotore Hes1 a ipossia17. Qui, descriviamo un protocollo di co-immunoprecipitazione per studiare PPIs tra proteine endogene nucleari in condizioni di ipossia. L'interazione tra HIF-1 α e ARNT è mostrato come un proof of concept. Questo protocollo è adatto per la dimostrazione delle interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali in condizioni di ipossia, compresi ma non limitati all'identificazione di proteine interagenti HIF-1.

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Protocollo

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In questa sezione del protocollo, che utilizza 293A embrionali umane del rene (HEK293A) cella, s segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana a Nanyang Technological University, Singapore.

1. induzione di ipossia in cellule di HEK293A

  1. Preparare quattro piatti di 10cm e semi di 3 – 5 x 106 HEK293A cellule per piatto in 10 mL Dulbecco per volta medium dell'Aquila (DMEM, glucosio di 4,5 g/L) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, 110 mg/L sodio piruvato, 100 U/mL di penicillina e 100 mg / mL di streptomicina. Coltura le cellule in un 37 ° C, 5% CO2 incubator.
    Nota: Cella semina deve essere effettuata in una cappa di sicurezza biologica (BSC). Le superfici di tutti i materiali ad essere messi in BSC dovrebbero essere cancellate con etanolo al 70%.
  2. 24 h dopo la semina, quando le cellule hanno raggiunto l'80 – 90% confluency, mettere due piatti nel subchamber di ipossia nel vano portaoggetti incubatore (Vedi Tabella materiali) con 1% O2 e 5% CO2 a 37 ° C e tenere gli altri due piatti al normoxia (21% O 2, 5% CO2 a 37 ° C) per 4 h. utilizzare un insieme di condizioni di normossia e cellule ipossiche per valutare il trattamento di ipossia mediante western blot e utilizzare l'altro set di celle per gli esperimenti di co-immunoprecipitazione.
    Nota: I livelli di ossigeno possono essere impostati a 0 – 5% e la durata del trattamento ipossia può essere variata a seconda del tipo di cella e obiettivo di studio.

2. intera cellula ed estrazione nucleare

Nota: Vedi tabella 1 per informazioni sui buffer utilizzata nel presente protocollo.

  1. Raccogliere le cellule di controllo normoxia.
    1. Rimuovere il supporto di cultura dall'aspirazione e lavare le cellule con 10 mL di DPBS (PH 7.0-7.2) usando una pipetta da 10 mL.
      Nota: Evitare di toccare il monostrato cellulare con la pipetta. Durante il lavaggio, pipettare delicatamente DPBS abbattendo il muro della piastra di coltura cellulare per evitare la perdita delle cellule.
    2. Pipettare 5 mL DPBS ghiacciata nella piastra e raschiare le cellule sulla superficie della piastra in PBS ghiacciata con un raschietto di cella.
    3. Trasferire la sospensione cellulare in provette coniche da 15 mL e tenere sul ghiaccio.
  2. Raccogliere le cellule coltivate in condizioni di ipossia.
    1. Pre-equilibrare il DPBS a condizioni ipossiche inserendo un flacone di reagente di vetro dall'esperimento di 00ml scoperti 1riempito con DPBS nel subchamber di ipossia (1% O2 e 5% CO2 a 37 ° C) per 24 ore in anticipo.
    2. Circa 1 h prima della raccolta delle cellule di ipossia trattato, posizionare una scatola di ghiaccio contenente ghiaccio nella camera di lavorazione del vano portaoggetti, che è stato equilibrato al 1% O2 e 5% CO2. Trasferire il flacone contenente il pre-equilibrato DPBS ipossica dalla subchamber di ipossia a camera di lavorazione e posizionarlo sul ghiaccio.
    3. 4 h dopo il trattamento di ipossia, trasferire le cellule dalla subchamber di ipossia nella camera di trattamento che è stato pre-equilibrato al 1% O2 e 5% CO2.
    4. Rimuovere il supporto di cultura dall'aspirazione e sciacquare le cellule una volta con 10 mL Pipettare ghiacciata DPBS hypoxic pre-equilibrato con un 10 mL.
    5. Aggiungere 5 mL DPBS ghiacciata pre-equilibrato con un 5 mL Pipettare e sloggiare le cellule da raschiare con un raschietto di cella.
    6. Inclinare la piastra di coltura delle cellule e raccogliere le cellule indipendente utilizzando una pipetta da 10 mL. Trasferire la sospensione cellulare in DPBS in provette coniche da 15 mL e tenere sul ghiaccio.
    7. Aprire la porta tra le camere elaborazione e buffer del vano portaoggetti, entrambi i quali sono stati pre-equilibrati per 1% O2 e 5% CO2. Trasferire le provette coniche da 15 mL sul ghiaccio che contengono le cellule di ipossia trattato dalla camera di elaborazione per l'alloggiamento di buffer. Aprire la porta della camera del tampone e rimuovere completamente le cellule dal vano portaoggetti.
  3. Pellet sia le cellule normossiche da 2.1 e le cellule ipossiche da 2.2 mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C.
  4. Preparare l'intera cellula estratti.
    1. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone di lisi di gelida radio immunoprecipitazione assay (RIPA) contenente 50 mM pH Trisaminomethane cloridrato (Tris-HCl) 8.0, 150 mM di cloruro di sodio (NaCl), 1% tergitol-tipo NP-40 (NP-40), 0,5% sodio desossicolato, e 0.1% sodio dodecil solfato (SDS), completato con 1 x cocktail di inibitore della proteasi (Vedi Tabella materiali) pipettando il pellet cellulare su e giù più volte.
    2. Trasferire i lisati cellulari in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 mL e tenere il ghiaccio per 30 min con occasionali Vortex.
    3. Centrifugare i lisati cellulari a 13.000 x g per 10 min a 4 ° C.
    4. Raccogliere il surnatante, aliquotare 50 µ l del surnatante in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.
  5. Preparare gli estratti nucleari utilizzando un'estrazione nucleare kit (Vedi tabella materiali).
    1. Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 500 µ l di NL di buffer di lisi completati con 1 x cocktail di inibitore della proteasi e 0,1 M ditiotreitolo (DTT) pipettando il pellet cellulare su e giù più volte.
    2. Aggiungere 25 µ l di soluzione detergente NP alla sospensione cellulare e vortexare per 10 s a velocità massima.
    3. Centrifuga a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C.
    4. Raccogliere il surnatante (estratti citoplasmatici), aliquotare 50 µ l del surnatante in provette microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.
    5. Risospendere il pellet contenente nuclei delle cellule in 500 µ l di tampone di lisi NL completati con 1 x cocktail di inibitore della proteasi e 0,1 M DTT nel Vortex per 5 s alla velocità massima.
    6. Centrifugare a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C e salvare la pallina nucleare.
    7. Risospendere il pellet nucleare in 50 µ l di estrazione Buffer NX1 completati con 1 x cocktail di inibitore della proteasi pipettando il pellet su e giù più volte.
    8. Incubare per 30 min su ghiaccio, su vortex per 10 s ogni 5 min alla massima velocità.
    9. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C.
  6. Desalificare estratti nucleari.
    1. Raccogliere il surnatante da passo 2.5.9 e trasferire nelle periferiche mini dialisi con un volume massimo di 100 µ l per unità.
    2. I dispositivi mini dialisi di Cap e metterli in un dispositivo di galleggiamento.
    3. Mettere il dispositivo di galleggiamento in un becher contenente 500 mL di tampone di dialisi pre-refrigerati (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20% glicerolo, 100 mM di cloruro di potassio (KCl), 0,2 mM acido etilendiamminotetracetico (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) e 0,5 mM DTT) ed incubare per 30 min a 4 ° C con agitazione delicata.
      Attenzione: PMSF è pericoloso. Evitare il contatto diretto con la pelle o per inalazione.
    4. Raccogliere i campioni dall'angolo dei dispositivi mini dialisi e trasferire nella nuova per microcentrifuga da 1,5 mL.
    5. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C, aliquota 25 µ l di ogni surnatante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.

3. valutazione del trattamento ipossia tramite rilevazione dell'espressione della proteina e localizzazione subcellulare di HIF-1 α

  1. Determinare la concentrazione nella proteina della cellula intera o nucleare/citoplasmico estratti facendo uso dell'analisi di un kit di dosaggio acido (BCA) proteina bicinconinico secondo istruzioni18 del produttoremicropiastre.
  2. Diluire i lisati cellulari in 1 x Laemmli tampone contenente 5% 2-mercaptoetanolo e bollire a 95 ° C per 5 min.
    Attenzione: Non toccare la superficie del blocco riscaldante, poiché può provocare ustioni.
  3. Separare le proteine elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE).
    1. Caricare uguali quantità di proteina (25 µ g) in ciascun pozzetto di un gel di SDS-PAGE prefabbricati di gradiente (4 – 20%), insieme a 3 µ l di marcatore di peso molecolare.
    2. Esegua il gel in tampone contenente 2,5 mM Tris, glicina 19,2 mM, 0,01% SDS, PH8.3 per 30 min a 200 V di corsa.
  4. Trasferire le proteine dal gel alla membrana di nitrocellulosa.
    1. Montare il panino di trasferimento (carta da filtro-gel-membrana-filtro di carta) con il gel sul lato anodo e la membrana sul lato catodo della cassetta.
    2. Inserire la cassetta nel trasferimento serbatoio riempito con tampone di trasferimento contenente 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glicina 19,2 mM e 20% metanolo.
      Attenzione: Metanolo è infiammabile e deve essere conservato all'interno l'armadietto di immagazzinaggio liquido infiammabile.
    3. Effettuare il trasferimento per 1 h a 100 V in camera fredda.
  5. Bloccare la macchia nel tampone di bloccaggio da 10 mL contenente 50 mM Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.1 Tween 20 e 5% senza grassi del latte per 1 h a temperatura ambiente in un agitatore.
  6. Incubare la macchia con l'anticorpo anti-HIF-1 α (diluizione 1/500) nello stesso tampone bloccante durante la notte a 4 ° C.
  7. Lavare la macchia 3 volte per 5 min ogni volta con 50 mL di TBS-T.
  8. Incubare la macchia con perossidasi di rafano (HRP)-anticorpo secondario coniugato (diluizione 1/1.000) in 10 mL TBS-T contenente 5% non-grasso di latte secco per 1 h a temperatura ambiente.
  9. Lavare la macchia 3 volte per 5 min ogni volta con 50 mL di TBS-T.
  10. Mix 500 µ l ciascuna di chemilumescent avanzata (ECL) Reagente A e B in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e agitare brevemente.
  11. Applicare il substrato di ECL il blot e incubare per 1 min a temperatura ambiente.
  12. Catturare i segnali a chemiluminescenza utilizzando un charge coupled device (CCD) sistema di imaging basata su videocamera.
    1. Scolare in eccesso substrato ECL toccando il bordo della membrana con una velina e posizionare la membrana in un foglio di protezione.
    2. Posizionare la membrana sul vassoio campione del CCD sistema di imaging basata su videocamera.
    3. Lanciare il software di elaborazione immagine (Vedi Tabella materiali) e catturare le immagini con le seguenti impostazioni: File → nuovo protocollo → monocanale → Protocol Setup → Gel imaging (applicazione: Chemi; Area Imaging: Gel pronto Bio-Rad; Imaging dell'esposizione: Il software automaticamente consente di ottimizzare il tempo di esposizione per bande intensi) protocollo di esecuzione →
      Nota: E ' possibile impostare manualmente il tempo di esposizione, per ottenere immagini ottimali.

4. immunoprecipitazione e rilevamento delle proteine immunoprecipitati

  1. Lavare 50 µ l di perle di proteina A/G sepharose in 500 µ l di tampone TBS in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e pellet le perline mediante centrifugazione a 3.000 x g per 2 min a 4 ° C.
  2. Eliminare il supernatante e risospendere le sfere in 100 µ l di tampone TBS.
  3. Aggiungere 2 µ l di anticorpo monoclonale anti-ARNT (1,4 mg/mL) o il mouse dell'immunoglobulina G (IgG) (1,4 mg/mL) che è stato preparato mediante ricostituzione IgG di topo di 0,7 mg in 500 µ l di tampone TBS.
  4. Collocare la microcentrifuga da 1,5 mL contenente microsfere in un rotatore del tubo ed incubare per 2 ore a 10 giri/min in camera fredda.
    Nota: Maneggiare i tubi delicatamente e tenere la sospensione contenente le perline nella parte inferiore del tubo.
  5. A pellet le perline mediante centrifugazione a 3.000 x g per 2 min a 4 ° C ed eliminare i sovranatante.
  6. Diluire 200 µ g della proteina nucleare lisato ottenuto nel passaggio 2.6.5 in 800 µ l di buffer IP composto da 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glicerolo, inibitore di proteasi di 0,2% NP-40 e 1 x cocktail. Incubare il lisato con i branelli accoppiati anticorpi ottenuti nel passaggio 4.5 durante la notte a 4 ° C.
  7. A pellet le perline mediante centrifugazione a 3.000 x g per 2 min a 4 ° C, eliminare i sovranatante e lavare le perle 3 volte con 1 mL ghiacciata TBS contenente 0,2% NP-40.
  8. Cuocere le perline in 50 µ l tampone di Laemmli campione a 95 ° C per 5 min.
  9. Centrifugare le perline a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C, raccogliere il surnatante e scartare le perline.
    Nota: Il surnatante possa essere memorizzato a 4 ° C per breve periodo o a-20 ° C per il lungo termine.
  10. Rilevare la presenza di HIF-1 α dai complessi proteina immunoprecipitata con western blot come precedentemente descritto nel passaggio 3.3 in poi.
    Nota: Quantificazione della proteina non è necessaria per questo passaggio. Caricare tutto volume (50 µ l) del surnatante di ogni campione in ciascun pozzetto di un gel di SDS-PAGE prefabbricati di gradiente (4 – 20%)

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Risultati

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Per valutare la risposta cellulare all'ipossia, l'espressione sono stati esaminati i livelli e localizzazione subcellulare delle componenti del trattamento seguente complesso di ipossia HIF-1. HEK293A cellule sono state coltivate in condizioni di ipossia per 4 h o tenuti a normoxia come controlli. Livelli della proteina HIF-1 α e ARNT sono stati esaminati in cellule intere o nucleare/citoplasmico estratti mediante western blot. Come previsti, totali livelli di HIF-1 α sono stati aumentati...

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Discussione

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Il complesso di HIF-1 è un regolatore dell'omeostasi dell'ossigeno cellulare e regola una pletora di geni coinvolti in diverse risposte adattative cellulari all'ipossia. Identificazione di nuove proteine interagenti di HIF-1 è importante per la comprensione della trasduzione del segnale ipossico. Esperimenti di co-immunoprecipitazione comunemente utilizzati per studi di PPIs per delineare vie di trasduzione del segnale cellulare. Tuttavia, la sovraespressione di proteina è ancora ampiamente usata e questo può portare ad ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Assoc. Prof. ssa Sin Tiong Ong per l'utilizzo della workstation ipossia. Questo lavoro è stato supportato dal testo seguente: Singapore Ministry of Education, MOE 1T1-02/04 e MOE2015-T2-2-087 (a Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University avviamento sovvenzione M4230003 (p.o.b.), il Consiglio svedese della ricerca, il Famiglia Erling Persson Foundation, la Fondazione di Novo Nordisk, l'af di Stichting Jochnick Foundation, l'associazione svedese di diabete, la compagnia di assicurazione di Scandia, la ricerca sul diabete e Wellness Foundation, Fondazione di ormeggio von Kantzow, il Programma di ricerca strategico nel diabete al Karolinska Institutet, l'ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage e Knut e Alice Wallenberg Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiale
1,0 M Tris-HCl tampone, pH 7,4 1st BASE1415
Proteina A/G Perle di SefarosioAbcamab193262
Proteina IgG naturale di topoAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x tampone campione LaemmliBio-Rad1610737
2-MercaptoetanoloBio-Rad1610710
Nitrocellulosa Membrana    Bio-Rad1620112
Blotting-Grade BlockerBio-Rad1706404Latte scremato in polvere per applicazioni di western blotting
10x Tris Buffered Saline (TBS)Bio-Rad1706435
10% Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/Glycine Buffer Bio-Rad1610771
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610374
IgG anti-coniglio, segnalazione cellulare anticorpo legata a HRP7074
IgG anti-topo, anticorpo legato a HRP Segnalazione cellulare7076
Reagente ECL SignalFireSegnalazione cellulare6883
salina tamponata con fosfato di DulbeccoCorning21-030-CV
Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)Anticorpo beta Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1Novus BiologicalsNB100-124 Concentrazione: 1,4 mg/mL
Anticorpo HIF-1 alfaNovus BiologicalsNB100-479Concentrazione: 1,0 mg/mL
YY1 AnticorpoNovus BiologicalsNBP1-46218Concentrazione: 0,2 mg/mL
Kit di proteine nucleari QproteomeQiagen37582Il tampone di lisi NL e il tampone di estrazione NX1 sono forniti nel kit
Anticorpo GAPDHSanta Cruzsc-47724Concentrazione: 0,2 mg/mL
Glicerolo (≥ 99%)SigmaG5516
Cloruro di potassioSigmaP9541
tampone RIPASigmaR0278
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM, 4,5 g/L glucosio)Thermo Fisher Scientific 11995065
Ditiotreitolo (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Siero fetale bovinoThermo Fisher Scientific10270106
HEK293A linea cellulareThermo Fisher ScientificR70507
Metanolo Thermo Fisher Scientific67-56-1
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122
Pierce Compresse di inibitori della proteasi Thermo Fisher Scientific88660
Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225
Punta di caricamento del gel QSPThermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Filter Paper, Pretagliato, 7,5 x 10 cmBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN  Cella di elettroforesi verticale Tetra per mini gel prefabbricati, con Mini Trans-Blot Modulo e alimentatore di base PowerPacBio-Rad1658034
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricatiBio-Rad4561083
ChemiDoc XRS+ SistemaBio-Rad1708265
GuantoBioSpherixI-Glove
Synergy HTX Lettore di micropiastre multimodale PipetteBTS1LFTA
Costar 5mL StripetteCorning4487
Pipette sierologiche Costar 10mL StripetteCorning4488
Pepette sierologiche Costar 25mL StripetteCorning4251
Corning Micropiastre in polistirene nero a fondo trasparente a 96 pozzettiCorning3631
15mL High Clarity PP conici provette da centrifugaCorning352095
Raschietto per piccole celleCorning3010
Gilson  Kit 4 pipette Pipetman LGilsonF167370P2, P20, P200, P1000 e accessori
Provette per microcentrifuga in polipropilene da 1,5 mlGreiner Bio-One 
PIPETBOY acu 2 PipettatoreINTEGRA Biosciences155 000 
Armadi per la conservazione di liquidi infiammabili JustriteJustrite Manufacturing Co.896000
Miscelatore a vorticeLabnetS0200
Incubatore a CO2NuAireNU-5820
Agitatori orbitaliStuartSSL1
Rotatore a tubo SB3StuartSB3
MicroCL 21R MicrocentrifugaThermo Fisher Scientific75002470
Sorvall ST 16 CentrifugaThermo Fisher Scientific75004240
Piastre per colture tissutali (100 mm)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo per dialisiThermo Fisher Scientific6958010K MWCO, 0,1 mL
Boe galleggianti per 0,1 mL Slide-A-Lyzer MINI Dispositivi per dialisiThermo Fisher Scientific69588
LSE Riscaldatori digitali per bagno seccoThermo Fisher Scientifico1168H25
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Riferimenti

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