Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Xuan Guo; Yiqing Zhao; Hieu Nguyen; Tonghua Liu; Zhenghe Wang; Hua Lou

doi:10.3791/57889

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

8.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/57889

⸱

26 agosto 2018

Xuan Guo¹^,² , Yiqing Zhao¹^,³ , Hieu Nguyen¹ , Tonghua Liu² , Zhenghe Wang¹^,³ , Hua Lou¹^,³^,⁴

¹Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University, ²Department of Endocrinology, Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, ³Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University, ⁴Center for RNA Science and Therapeutics, Case Western Reserve University

In questo articolo

Sommario

È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.

Abstract

Splicing alternativo (AS) si verifica in oltre il 90% dei geni umani. Il pattern di espressione di un esone alternativamente impiombato spesso è regolato in modo specifico del tipo di cella. COME espressione di modelli in genere vengono analizzati mediante RT-PCR e RNA-seq utilizzando campioni di RNA isolato da una popolazione di cellule. In situ esame di come modelli di espressione per una particolare struttura biologica può essere effettuato da RNA in situ di ibridazione (ISH) usando le sonde essone-specific. Tuttavia, questo uso particolare di ISH è stato limitato poiché esoni alternativi sono generalmente troppo brevi per la progettazione di sonde essone-specific. In questo rapporto, l'uso di BaseScope, una tecnologia sviluppata di recente che si avvale di corti oligonucleotidi antisenso in RNA ISH, è descritto per analizzare come i modelli di espressione nelle sezioni di cervello di topo. Esone 23a di neurofibromatosi di tipo 1 (Nf1) viene utilizzato come esempio per illustrare che sonde di giunzione esone-esone breve mostrano segnali di ibridazione robusto con elevata specificità nell'analisi di RNA ISH su sezioni di cervello di topo. Ancora più importante, i segnali rilevati con sonde specifiche inclusione e saltando essone utilizzabile per calcolare in modo affidabile la percentuale impiombata in valori di Nf1 esone 23a espressione in diverse aree anatomiche di un cervello di topo. Il protocollo sperimentale e metodo di calcolo per analisi sono presentati. I risultati indicano che BaseScope fornisce un nuovo e potente strumento per valutare come espressione modelli in situ.

Introduzione

Splicing alternativo (AS) è un processo comune che si verifica durante la maturazione del pre-mRNA. In questo processo, un esone possa essere incluse differenzialmente nel mRNA maturo. Così, attraverso AS, un gene può generare molti mRNA che codificano per prodotti proteici differenti. Si stima che 92 – 94% dei geni umani sottoposti a¹^,d'impionbatura alternativa². Modelli di splicing alternativo che anormale è derivato da mutazioni genetiche sono state collegate a un gran numero di malattie, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica, la distrofia miotonica e cancro³^,