Il protocollo descritto qui utilizza un approccio di photolabeling in topi neonati per identificare in modo specifico le cellule immuni che emigrano dal colon in siti extra-intestinali. Questa strategia sarà utile per studiare le interazioni ospite-microbiome nella vita in anticipo.
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Articolo metodologico
In Vivo Photolabeling delle cellule del colon per valutare il potenziale migratorio delle cellule ematopoietiche in topi neonatali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comunità batteriche enteriche sono stabilite all'inizio della vita e influenzano la funzione e lo sviluppo delle cellule immuni. Il microbiota neonatale è suscettibile di numerose influenze esterne, tra cui l'uso di antibiotici e dieta, che urta la suscettibilità alle malattie autoimmuni ed infiammatorie. Disturbi come la malattia di viscere infiammatoria (IBD) sono caratterizzati da un massiccio afflusso di cellule immuni agli intestini. Tuttavia, le cellule immunitarie condizionate dal microbiota possono inoltre emigrare fuori gli intestini per influenzare le risposte immunitarie a siti extra-intestinali. Così, c'è una necessità di identificare e caratterizzare le cellule che possono trasportare messaggi microbici dall'intestino ai luoghi distali. Qui, descriviamo un metodo alle cellule di etichetta nel colon dei topi neonati in vivo che consenta la loro identificazione presso siti extra-intestinali dopo la migrazione.
Introduzione
Il tratto gastrointestinale dei mammiferi ospita centinaia di specie di batteri presenti in un rapporto simbiotico con l'host1. Le cellule immunitarie presenti nell'ambiente locale applicare una coesistenza pacifica con questi microbi e stabilire una barriera protettiva contro le invasioni di agente patogeno. Così, bi-direzionale interazioni tra le cellule immunitarie e il microbiota sono fondamentali per stabilire una comunità commensale che educa il sistema immunitario dell'ospite e imposta la soglia per la reattività immune agli agenti patogeni. Cambiamenti nel microbiche composizione, o disbiosi, può disturbano l'omeostasi immunitaria e per....
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Protocollo
Tutte le procedure degli animali sono state effettuate con l'approvazione di e conforme ai istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) presso il Massachusetts General Hospital.
Attenzione: Questo protocollo prevede l'utilizzo di un laser di classe 3b (LG3). LG3 laser occhiali di sicurezza devono sempre essere utilizzati quando si opera questo laser. Opportune linee guida formazione e sicurezza devono essere seguite per evitare il rischio di lesioni.
1. progettazione e assemblaggio di Laser
- Collegare il diodo luminoso (LED) (405 nm, 19,3 mW, mA 1400, accoppiati in fibra) al LED driver tramite<....
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Risultati
Un cavo in fibra ottica è stato utilizzato per trasportare 405 nm luce in due punti dei topi diasportato 2 - giorno-vecchi PhAM. In precedenti esperimenti, un 30 s esposizione era deciso a dare una massima fotoconversione delle cellule del colon con minima citotossicità (Figura 1A). Di conseguenza, sequenziale 30 esposizioni di s dei diversi segmenti del colon sono state effettuate come descritto nel protocollo. In seguito l'esposi.......
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Discussione
L'identificazione e la caratterizzazione delle cellule che interagiscono e sono influenzati dal microbiota del colon sono importanti e dovrebbero facilitare la comprensione di come le informazioni dal microambiente mucoso viene inoltrati al resto del corpo. Un metodo per studiare la migrazione delle cellule dell'intestino richiede l'isolamento di cellule associato all'intestino, seguita da un trasferimento adottivo in topi destinatari per determinare i modelli di tessuto-homing e funzione12,<.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Nitya Jain è stato sostenuto da un premio di transizione di carriera NIH/NIAID 1K22AI116661-01.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | ATTENZIONE: questo è un laser di Classe 3b. Quando si utilizza il laser, è necessario indossare occhiali di sicurezza. Emette una lunghezza d'onda di 405 nm con una corrente di 1400 mA. È accoppiato in fibra. Accetta il connettore SMA. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| driver LED | THORLABS | LEDD1B | Pilota una corrente costante di 1200 mA attraverso il laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Cavo patch Optogenetics | THORLABS | M87L01 | Cavo lungo 1 m con connettore SMA. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Cannula in fibra ottica | Lenti doriche | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 Cannula | lunga 5 mm con diametro esterno di 500 &; m e un diametro interno di 480 µm. Il valore NA è 0,5. La ghiera è in zirconia, diametro esterno di 1,25 mm. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Alimentatore | THORLABS | KPS101 | Alimenta 15 V con una corrente di 2,4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| occhiali di sicurezza laser LG3. | Lenti THORLABS | LG3 | Orange con trasmissione della luce visibile del 47% https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| luce rossa | Scienze della microscopia elettronica | 74327-10 | Lampada da 15 W https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Isolamento delle cellule intestinali | |||
| Isoflurano | Patterson Veterinario | 07-893-1389 | ATTENZIONE: l'inalazione di questo anestetico può causare vertigini, sonnolenza o persino perdita di coscienza. Questo anestetico dovrebbe essere utilizzato in una cappa di Classe II. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| siero di vitello | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | concentrazione 0,5 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | ATTENZIONE: nocivo se ingerito e provoca irritazione cutanea. Concentrazione 1 M https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Piastra di Petri con https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 di concentrazione |
| 1 M Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F | |
| Filtro cellulare da 70 micron | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Agitatore micromagnetico | Fisherbrand | 1451364 | Sciacquare con etanolo al 70% dopo ogni utilizzo. Sciacquare più volte in acqua distillata prima di ogni utilizzo. La barra è lunga 8 mm con una forma ottagonale. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Piastra di agitazione magnetica | Agitatori da laboratorio Corning | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | |
| https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipetta sierologica da 14387165 Thermo Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 10 mL Falcon | 357530 | ||
| pipetta sierologica da 25 mL | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| provetta da centrifuga conica da 15 mL | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| provetta da centrifuga conica da 50 mL | Thermo Scientific | 339653 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 | |
| Sospensione a cellula singola | |||
| Provette Eppendorf | Seal-Rite | 1615-5500 | Contiene 1,5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Omogeneizzatore tissutale | Kimble | K7495400000 | Richiede 2 batterie AA. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Punte per omogeneizzatore | Kimble | 7495210590 | Plastic, puntali da 0,5 mL https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| tampone di lisi ACK | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| Filtro cellulare da 40 micron | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Anticorpi | |||
| BV786 anti-topo CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor lame | VWR | 55411-050 | Utilizzare per la decapitazione. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
Riferimenti
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198
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Ristampe e permessi
