Proteasi sono strettamente regolamentati enzimi coinvolti in processi biologici fondamentali e dysregulated proteasi attività unità progressione di malattie complesse come il cancro. Obiettivo di questo metodo consiste nel creare nanosensori che misurano proteasi attività in vivo producendo un segnale di fenditura che è rilevabile dall'urina di host e discrimina la malattia.
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Articolo metodologico
Nanosensori per rilevare attività della proteasi In Vivo per la diagnostica non invasiva
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteasi sono enzimi multifunzionali che si specializzano nell'idrolisi di legami peptidici e controllano ampi processi biologici, compreso l'omeostasi e Allostasi. Inoltre, l'attività della proteasi dysregulated unità patogenesi ed è un biomarcatore funzionale di malattie come il cancro; Pertanto, la capacità di rilevare attività della proteasi in vivo può fornire informazioni clinicamente rilevanti per la diagnostica biomedica. L'obiettivo del presente protocollo è quello di creare nanosensori sonda per attività della proteasi in vivo producendo un segnale quantificabile nelle urine. Queste proteasi nanosensori costituiti da due componenti: una nanoparticella e substrato. Le funzioni di nanoparticelle per aumentare la consegna di Half-Life e substrato di circolazione malattia nei siti di destinazione. Il substrato è una sequenza di brevi peptidi (6-8 AA), che è progettata per essere specifici di una proteasi di destinazione o un gruppo di proteasi. Il substrato è coniugato alla superficie della nanoparticella e viene terminato da un giornalista, ad esempio un marker fluorescente, per il rilevamento. Come proteasi dysregulated fendono il substrato peptide, il reporter viene filtrato in urina per quantificazione come biomarcatore di attività della proteasi. Qui descriviamo la costruzione di un nanosensore per proteinasi metallica della tabella 9 (MMP9), che è associato con la progressione del tumore e metastasi, per la rilevazione di cancro colorettale in un modello murino.
Introduzione
Proteasi sono enzimi multifunzionali che si specializzano nell'idrolisi di legami peptidici e hanno il controllo significativo rispetto a molti processi biologici, compreso l'omeostasi, Allostasi e malattia1. Uno stato alterato di attività della proteasi è stato correlato ad una varietà di malattie, compreso cancro e la malattia cardiovascolare, rendendo i candidati attraenti di proteasi per sviluppo in biomarker clinici2,3. Inoltre, l'attività della proteasi è funzionalmente collegati a distinte pathogeneses, gli esiti dei pazienti e la prognosi di malattia4. In....
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Protocollo
È necessario effettuare i seguenti esperimenti animali istituzionale approvazione istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) alla istituzione del ricercatore. Inoltre, strutture di standard di cura degli animali (ad es., alloggiamento chambers, cappe animale sterile, surrenalectomia alloggiamenti per amputate e CO2 alloggiamenti per euthanization etico endpoint) sono necessarie per svolgere correttamente queste esperimenti. Speciale formazione e assistenza con queste strutture può essere forniti da laboratorio di ricerca fisiologica (PRL) alla istituzione di uno. Tutto il lavoro animale è stato approvato dal IACUC al Georgia Tech (protocoll....
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Risultati
La maggior parte della popolazione della IONPs è intorno al diametro medio, che vanno da 40-50 nm. Dopo PEGilazione, questo intervallo di grandezza ha un'emivita di circolazione di circa 6 ore13 in vivo (Vedi Figura 2a). Se si vuole selezionare per una gamma di particolari dimensioni, uno può utilizzare cromatografia di esclusione di formato per isolare le frazioni IONP con differenti diametri. Le nanoparticelle di TEM appari.......
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Discussione
Questo metodo viene descritto lo sviluppo di Nanosensori basati su attività costituito da proteasi substrati coniugati ad un nucleo di nanoparticelle. L'evento di clivaggio proteolitico è soprannominato "switch farmacocinetiche," perché prodotti fenduti peptidici sono più piccoli rispetto al limite di filtrazione renale dimensione di 5 nm23 e filtro in urina per produrre un segnale non invadente. Pertanto, è importante utilizzare le nanoparticelle o vettori con un raggio idrodinamico è maggiore di.......
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Dichiarazioni
Dr. Kwong è co-fondatore e serve come consulente a Glympse Bio, che sta sviluppando prodotti legate alla ricerca descritta in questo documento. Questo studio potrebbe influire sulla sua situazione finanziaria personale. I termini di questo accordo sono stati esaminati e approvati dal Georgia Tech secondo le proprie politiche di conflitto di interessi
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da un direttore di NIH nuovo Innovator Award (premio No. DP2HD091793). Q.D.M. è supportato dal programma di borse di ricerca laureato NSF (Grant No. DGE-1650044). B.A.H è supportato dalla nazionale istituti di salute GT BioMAT formazione sovvenzione premio numero 5T32EB006343 così come il Presidente di Georgia Tech Fellowship. G.A.K. tiene un premio alla carriera all'interfaccia scientifica del fondo benvenuto di Burroughs. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,2 µ m filtri per siringhe | VWR | 4652 | |
| ago 18G | VWR | 89134-024 | |
| 15 mL conici | VWR | 89039-670 | |
| 250 mL pallone di Erlenmeyer | VWR | 89000-362 | |
| Barra di agitazione | VWR | 58949-006 | |
| Piastra riscaldante/agitatore magnetico | VWR | 97042-634 | |
| Acido | acetico glacialeVWR | 97064-482 | |
| Albumina da siero bovino (BSA) | Thermo Fisher | A13100 | |
| Cloruro di ferro (III) esaidrato | Sigma | 236489 | |
| Cloruro di ferro (II) tetraidrato | Sigma | 44939 | |
| Epicloridrina | Sigma | 45340-500ML-F | |
| DMF | Sigma | D4551 | |
| Ammonio Idrossido | Sigma | 320145-500ML | |
| Pellet di idrossido di sodio | Sigma | 221465-500G | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Borato di sodio | Sigma | B9876 | |
| L-Cisteina | Sigma | 168149-100G | |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| PBS compresse | Sigma | P4417 | |
| destrano | Pharmacosmos | 5510 0020 9006 | |
| Amicon 15 mL 10k filtri, 24 confezioni | Millipore | UFC901024 | |
| Amicon 15 mL 30k filtri, 24 confezioni | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon 15 mL 100k filtri, 24 confezioni | Millipore | UFC910024 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | NanoZS | |
| Slide-A-Lyzer Cassetta per dialisi | LifeTech | 66130 | |
| Dynabeads MyOne Tosylactivated | LifeTech | 65501 | |
| SIA | Life Tech | 22349 | |
| PEG 20k | Laysan Bio | MPEG-SH-20K-1g | |
| Anticorpo alla fluoresceina [2A3] | GeneTex | GTX10257 | |
| Hiload 16/600 superdex 200 | GE Healthcare | 45-002-490 | |
| Lettore di piastre | Fisher | BTCYT5M | |
| BD Siringhe da insulina | Fisher | NC0872854 |
Riferimenti
- Lopez-Otin, C., Bond, J. S. Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).
- Hua, Y., Nair, S. Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology....
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Ristampe e permessi
