Articolo metodologico

Iniziazione di generazione e On-Demand di attività Ictal acuta nel tessuto umano e del roditore

DOI:

10.3791/57952

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19 gennaio 2019

 ,  ,  , 
1Division of Fundamental Neurobiology, Krembil Research Institute, 2Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Division of Neurosurgery, Department of Surgery, University of Toronto, 5Division of Neurology, Department of Medicine, University of Toronto, 6Department of Physiology, University of Toronto

In questo articolo

Sommario

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Modelli di sequestro acuta sono importanti per studiare i meccanismi alla base di eventi epileptiform. Inoltre, la capacità di generare eventi epileptiform su richiesta fornisce un metodo altamente efficiente per studiare l'esatta sequenza degli eventi alla base la loro iniziazione. Qui, descriviamo i modelli di sequestro corticale acuta 4-aminopiridina stabiliti nel tessuto umano e del mouse.

Abstract

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Controllo delle crisi epilettiche rimane un problema difficile per la comunità medica. Per compiere progressi, i ricercatori hanno bisogno di un modo ampiamente studiare la dinamica di sequestro e indagare i meccanismi sottostanti. Modelli di sequestro acuta sono convenienti, offrono la possibilità di eseguire registrazioni elettrofisiologiche e possono generare un grande volume di elettrografici grippaggio-come (ictal) eventi. I promettenti risultati da modelli di sequestro acuta possono essere avanzati quindi ai modelli di epilessia cronica e studi clinici. Così, studiando i sequestri in modelli acuti che replicano fedelmente le firme elettrografiche e dinamiche di un grippaggio clinico sarà essenziale per rendere i risultati clinicamente rilevanti. Studiare gli eventi ictal in sequestro acuta modelli preparati dal tessuto umano è anche importante per rendere i risultati che sono clinicamente rilevanti. L'obiettivo fondamentale in questa carta è sul modello 4-AP corticale grazie alla sua versatilità nel generare eventi ictal negli studi sia in vivo che in vitro , così come nel tessuto umano sia il mouse. I metodi in questa carta saranno anche descrivere un metodo alternativo di induzione di sequestro utilizzando il modello Zero-Mg2 + e fornire una panoramica dettagliata dei vantaggi e limiti dell'attività epileptiform-come generati nelle diverse acuta modelli di sequestro. Inoltre, approfittando di optogenetica disponibile in commercio diversi ceppi di topi, un impulso di luce breve (30 ms) utilizzabile per attivare un evento ictal identico a quelle che si verificano spontaneamente. Allo stesso modo, soffi di 30-100 ms di neurotrasmettitori (acido Gamma-Amino butirrico o glutammato) possono essere applicati al tessuto umano per attivare eventi ictal che sono identici a quelli che si verificano spontaneamente. La capacità di innescare eventi ictal su richiesta in modelli acuti sequestro offre la ritrovata capacità di osservare l'esatta sequenza degli eventi che sono alla base della dinamica di iniziazione di sequestro e in modo efficiente valutare potenziali terapie anti-sequestro.

Introduzione

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Modelli di sequestro acuta è in grado di riprodurre con successo elettrografiche firme ricorda eventi ictal osservati nell'elettroencefalogramma (EEG) di individui che avvertono un attacco epilettico. I ricercatori usano questi eventi ictal-come (di seguito definiti 'ictal eventi') come surrogati per il grippaggio evento1. Clinicamente, eventi ictal servono come un proxy affidabile per gli eventi di sequestro, poiché i sequestri sono un disturbo neurologico che proviene dal cervello. In unità di monitoraggio di epilessia, neurologi si basano sulla rilevazione di eventi ictal per confermare regione epilettogena del cervello e isolarlo per resezione2. In unità di cure intensive, i medici controllano attività ictal per valutare se qualsiasi attività convulsiva persiste in pazienti sedati3. Controllo delle crisi epilettiche rimane per essere un problema impegnativo per la comunità medica, come 30% dei pazienti di epilessia sono farmaco resistenti al farmaco disponibile4,5, e 10% di casi medici che coinvolgono i sequestri di droga-indotto sono non risponde al trattamento standard3. Questo presenta una seria preoccupazione per la società, come 10% della popolazione americana è prospezione per sperimentare un sequestro evento nella loro vita e 3% sono tenuti a sviluppare l'epilessia6.

Studiando i sequestri in modelli di epilessia cronica è costoso, faticoso e spesso impiegano mesi per preparare7. È anche difficile effettuare registrazioni elettrofisiologiche in animali liberi di muoversi. Test clinici umani affrontano problemi simili, come pure ulteriori complessità relative al consenso del paziente, variabilità in ambiti di provenienza dei partecipanti e le considerazioni etiche e morali coinvolti8. Modelli di crisi acuta, d'altra parte, sono favorevole perché sono relativamente conveniente da preparare, costo-efficiente e in grado di generare grandi volumi di eventi ictal per Studio9. Inoltre, il tessuto è fissato in una posizione stabile, quindi le condizioni sono ideali per eseguire le registrazioni elettrofisiologiche necessarie studiare dinamiche di grippaggio e la patofisiologia di fondo correlata. Modelli di acuta crisi restano favorevoli rispetto ai modelli in silico (computer) perché sono basati su materiale biologico composto costituente rete neuronale del cervello con tutti i suoi fattori e connettività sinaptica, che non può essere catturata 10i modelli di computer anche le più dettagliate. Queste caratteristiche rendono modelli acuta sequestro pronte ad per essere efficienti a screening per potenziali terapie anti-sequestro e rendendo i risultati preliminari prima di loro avanzare per ulteriori indagini nei modelli di epilessia cronica e studi clinici.

In genere, modelli di sequestro acuta sono derivati dal tessuto normale del cervello che è stato sottoposto a condizioni di iper-eccitabile. Per indurre gli eventi ictal clinicamente rilevanti nel tessuto cerebrale sano, è importante capire che il cervello funziona in modo ottimale in un stato critico11 dove eccitazione (E) e l'inibizione (I) sono equilibrato12. Una perturbazione del E-ho equilibrio può portare allo stato iper-eccitabile sequestro in cui precipitano eventi ictal. Di conseguenza, all'interno di questo quadro concettuale, esistono due strategie principali per generare eventi ictal nelle fette del cervello (in vitro) o nelle preparazioni del intero-cervello (in vivo): sia diminuita inibizione ("disinibizione") o aumentata eccitazione ("non-disinibizione"). Tuttavia, eventi ictal sono altamente ordinati e sincronizzati gli eventi che richiedono l'influenza di interneuroni GABAergici di orchestrare la rete neurale attività13,14. Per questo motivo, non-disinibizione modelli sono i più efficaci per la generazione di eventi ictal isolato di reti neurali, come in un in vitro cervello affettare15, considerando che in vitro disinibizione modelli comunemente conducono a chiodare l'attività ricorda di interictal-come chiodare. Inoltre, all'interno di questo quadro concettuale, un evento di sincronizzazione momentaneo anche in modo affidabile può innescare un evento ictal16. Infatti, può essere attivato un evento ictal mediante qualsiasi perturbazione minori applicato al sistema neurale17 quando è a un punto di transizione ("biforcazione") stato critico18. Tradizionalmente, queste perturbazioni sono state indotte da stimolazione elettrica. Lo sviluppo recente di optogenetica in neuroscienza, tuttavia, offre ora una strategia più elegante per indurre lo stato critico transizioni16.

I metodi descritti in questo documento viene illustrato come generare eventi ictal su richiesta nei modelli di sequestro acuta sia in vitro (passaggio 1 del protocollo) e in vivo studi (punto 2 del protocollo). Essi comportano la scelta della regione del cervello, metodo di induzione del sequestro, studio tipo e specie; Tuttavia, il focus sarà sulla scelta consigliata di un modello acuto 4-AP corticale sequestro a causa della sua versatilità in un'ampia varietà di tipi di studio. Il modello di 4-AP sequestro acuta in vitro è basato sul protocollo standard per preparare fettine di cervello di alta qualità per registrazioni elettrofisiologiche e formazione immagine studia19. Questi protocolli sono già stati utilizzati per rendere in vitro fette coronali del cervello dalla corteccia somatosensory-motor di topi16,20 e gli esseri umani21. Modifiche per generare eventi ictal in questi tipi di fette del cervello sono state dimostrate in precedenza16 e tutti i dettagli sono descritti nel protocollo sotto. Il modello di 4-AP sequestro corticale acuta in vivo è basato sul protocollo standard per preparare un craniotomy per imaging studies22. La modifica è che nessuna finestra (vetrino) è installata dopo il craniotomy. Invece, agenti proconvulsivante (4-AP) vengono applicati per via topica alla corteccia esposta per indurre eventi ictal mentre l'animale è in anestesia generale. A nostra conoscenza, il nostro gruppo è stato il primo a sviluppare questo modello di grippaggio corticale acuta in vivo in topi16,23. Acuta in vivo 4-AP corticale sequestro modello preparato da topi adulti è stato sviluppato per completare il modello in vitro fetta dal tessuto giovanile. La replica dei risultati del modello di grippaggio adulto in vivo consente di generalizzare i risultati dai modelli di fetta di affrontare le preoccupazioni inerenti per quanto riguarda le condizioni di non-fisiologica di una fetta di cervello 2D (contro un 3-d del intero-cervello struttura) e le differenze fisiologiche tra tessuto giovanile e adulto.

Il metodo di apertura su richiesta evento ictal è dimostrato usando entrambi sbuffi di neurotrasmettitori con un picospritzer o optogenetica strategie. Al meglio della nostra conoscenza, il nostro gruppo è il primo ad avviare eventi ictal nel tessuto umano usando neurotrasmettitori tramite un picospritzer16. Per le strategie di optogenetica, il ceppo di topi C57BL/6 è il ceppo convenzionale utilizzato per esprimere i transgeni. L'espressione di channelrhodopsin-2 (ChR2) in interneuroni GABAergici o cellule piramidali glutamatergic fornirà la possibilità opzionale di generare eventi ictal on-demand con brevi impulsi di luce. Ceppi di topi optogenetica adatto comprendono la variante C57BL/6 disponibile in commercio che esprime la ChR2 in entrambi interneuroni, utilizzando il mouse vescicolare GABA trasportatore promotor (VGAT)24, o cellule piramidali, utilizzando l'antigene delle cellule di timo del mouse 1 Promotor (Thy1)25. Questi topi VGAT-ChR2 e Thy1-ChR2 disponibili in commercio offrono la possibilità di attivare i neuroni GABAergici o neuroni glutamatergici, rispettivamente, nella neocorteccia con blu (470 nm) luce. La capacità di generare gli eventi ictal on demand in modelli di sequestro acuta può offrire nuove opportunità per studiare la dinamica l'inizio di grippaggio e in modo efficiente valutare potenziali terapie anti-sequestro.

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Protocollo

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Tutte le ricerche che coinvolgono i pazienti è stata effettuata nell'ambito di un protocollo approvato dal Comitato Università salute rete ricerca etica in conformità con la dichiarazione di Helsinki. Procedure che coinvolgono gli animali erano in conformità con le linee guida del Consiglio canadese su Animal Care e approvato dal comitato di cura di Krembil Research Institute animale.

1. protocollo i: acuto In vitro sequestro modello

  1. Preparazione di soluzioni di dissezione e liquido cerebrospinale artificiale
    1. Carbogenate acqua ultrapura (che è acqua filtrata con una resistività di MΩ·cm 18,2) con carbogen (95% O25% CO2) per 5 min utilizzando aria diffusori a bolle pietra (aeratori per acquari).
      Nota: Pietre dell'aria possono essere collegate per il serbatoio carbogen regolatore tramite standard tubo in silicone. Se pietre dell'aria non sono disponibili, tenuta chiusa l'estremità del tubo in silicone e colpisca i piccoli fori nella guarnizione per consentire al gas di carbogen a bolla fuori e carbogenate la soluzione.
    2. Preparare una soluzione di dissezione sciogliendo i soluti da tabella 1 in acqua ultrapura. Aggiungere CaCl2 a una soluzione che è stata carbogenated per almeno 5 min per aiutarlo a sciogliere.
      Nota: In alternativa, aggiungere CaCl2 in primo luogo, modo che può dissolversi facilmente in una soluzione di insatura. La soluzione, in forma liquida, dovrebbe essere 300-320 mOsm/L e un pH di 7,4 dopo essere saturato con carbogen.
      1. Raffreddare la soluzione di dissezione per 0 - 4 ° C. Lasciare la soluzione in frigorifero durante la notte o mettere la soluzione in freezer per 1 h e monitorare continuamente la temperatura.
        Nota: La soluzione di dissezione può essere conservata per fino a 3 notti; eliminare in seguito.
      2. Carbogenate la soluzione di dissezione per 5-10 minuti prima dell'uso.
        Nota: Idealmente, la soluzione dovrebbe compaiono come fanghiglia o la transizione per granita prima dell'uso.
    3. Preparate del roditore del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) sciogliendo i soluti da tabella 2 (o tabella 3 per umano ACSF) in acqua ultrapura. Carbogenate la soluzione ACSF mentre si è in un bagno di acqua riscaldato a 35 ° C fino all'utilizzo. Aggiungere CaCl2 a una soluzione che è stata carbogenated per almeno 5 min per aiutarlo a sciogliere.
      Nota: In alternativa, aggiungere CaCl2 primo modo che può dissolversi più facile in una soluzione di insatura. La soluzione, in forma liquida, dovrebbe essere 290-320 mOsm/L e un pH di 7,4 dopo essere saturato con carbogen. Soluzioni dovrebbero essere fatto in volumi 1, 2 o 4 L a seconda della durata degli esperimenti. Fare 4 L per una giornata intera (8h) di esperimenti. Il ACSF dovrebbe essere fatta fresca ogni giorno; Non conservare per più di 1 d.
  2. Dissezione del mouse per raccogliere il tessuto cerebrale
    Nota: Per il tessuto umano, procedere al passaggio successivo (passaggio 1.3) sul fare fette del cervello con il vibratome. I blocchi a forma di cubo (1 cm3) del tessuto cerebrale dovrebbero essere ottenuti dal neurochirurgo utilizzando le procedure precedentemente descritte26,27.
    1. Raccogliere tutti gli strumenti e materiali necessari per le dissezioni di animali. Impostare l'area di lavoro per preparare le dissezioni di animali.
      1. Controllare il serbatoio carbogen (95 %O2/5%CO2) per garantire che non sia vuota. Se c'è meno di 500 psi di pressione residua, sostituire la bombola del gas prima di esperimenti.
      2. Calibrare il vibratome (vibrazione affettatrice tessuto lama) secondo il manuale di istruzioni del produttore. Regolare del vibratome impostazione per avere un'ampiezza di taglio di 1 mm e una velocità di taglio di 0.12 mm/s.
        Nota: Le impostazioni ottimali possono differire per ogni taglierina lama di tessuto di vibrazione individuale; Tuttavia, in generale, l'ampiezza deve essere alta e la velocità di taglio dovrebbe essere bassa.
      3. Riempire la camera di incubazione fetta di cervello (cioè, il custode di fetta di cervello) con ACSF e bubble è con carbogen. Quindi posizionare la camera di incubazione in un bagno di acqua a 35 ° C.
        Nota: Utilizzare roditore ACSF per fette del cervello del roditore e umano ACSF per fette di cervello umano.
    2. Ottenere un mouse giovanile di entrambi i sessi, fra l'età di 13 d (p13) per 21D (p21, dove p0 è la data di nascita).
    3. Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (55 mg/kg di peso corporeo). Una volta che il mouse è anestetizzato, come indicato dall'assenza del riflesso del pizzico di punta, prontamente di usare uno strumento ghigliottina IFP-approvato per decapitare il mouse in un movimento rapido.
      Nota: Preparare l'iniezione di sodio pentobarbital secondo le procedure raccomandate dalle linee guida istituzionali.
    4. Tenere il naso del mouse per stabilizzare la testa decapitata e delicatamente fare un'incisione mediana a partire tra gli occhi del mouse e lungo l'intera lunghezza del cuoio capelluto per esporre il cranio. Garantire che il cranio non è compresso dalla pressione esercitata dal rasoio. Utilizzare l'angolo del bordo del rasoio per aumentare la precisione di taglio.
    5. Divaricare i lembi di cuoio capelluto del mouse utilizzando le dita per esporre il cranio. Quindi, utilizzare il fresh corner del rasoio per fare un'incisione lungo la linea mediana del cranio; prestare particolare attenzione a evitare il contatto con la corteccia cerebrale.
    6. Inserisci scheggia forcipe in zoccoli dell'occhio del mouse per stabilizzare la testa decapitata e inserirlo in una capsula di Petri piena di freddo (0 - 4 ° C) soluzione di dissezione. Assicurarsi che la testa è completamente immersa nella soluzione di dissezione.
    7. Utilizzare un secondo set di pinze scheggia delicatamente staccarsi del cuoio capelluto del mouse, rimuovere l'osso del naso di peeling e rimuovere la parte posteriore (lato caudale) del cranio.
      Nota: L'osso del naso dei topi giovanili è molto morbido e facilmente rotto.
    8. Utilizzare una spatola micro per tagliare i nervi ottici, nervi di trigeminal e del midollo spinale. Quindi, usare la spatola micro per separare delicatamente il cervello dal cranio. Lasciare il cervello completamente sommerso in di Petri riempito con soluzione di dissezione.
  3. Preparazione di fette corticali dalla corteccia somatosensory-motor
    1. Riempire la vasca tampone del vibratome con ~ 150 mL di freddo (0 - 4° C) soluzione di dissezione.
      Nota: In alternativa, mantenere tampone in freezer fino a quando necessario per mantenere una temperatura bassa durante la procedura di taglio.
    2. Incollare il tessuto cerebrale da mouse o umani sul palco vibratome (titolare/vassoio campioni) utilizzando colla adesiva istantanea. Per topi, tagliare una piccola porzione caudale del cervello (cioè, il cervelletto) affinché esso possa essere facilmente incollato sul portacampioni (consentendo la parte rostrale del cervello per affrontare il soffitto).
      Nota: In alternativa, fettine di cervello orizzontale del mouse possono essere preparati incollando il lato dorsale del cervello sul supporto del campione (il lato ventrale del cervello dovrebbe affrontare il soffitto)28.
    3. Posizionare delicatamente il portacampioni (con tessuto cerebrale) in tampone. Garantire che la porzione dorsale del cervello sta affrontando la lama del vibratome.
      Nota: È fondamentale per ridurre al minimo la quantità di tempo che il cervello è esposto all'aria.
  4. Taglio del tessuto di cervello e collezione
    1. Affettare il cervello a 450 μm fette spesse utilizzando il vibratome nella dorsale alla direzione ventrale. Assicurarsi che il cervello rimane completamente ancorato al vassoio del campione mentre tagliarlo.
      1. Effettuare il primo taglio nel cervello del topo per rimuovere il bulbo olfattivo. Quindi, apportare tagli successivi fino a quando l'area somatosensoriale-motor è osservato (a circa metà strada tra il bulbo olfattivo e bregma).
        Nota: Facoltativamente, affettare il cervello in sottili fette (200 μm) fino a che il corpo calloso appare la vista della corona del cervello, che indica che l'area somatosensoriale-motor è vicino.
    2. Utilizzare una pipetta di trasferimento wide-bore per raccogliere le sezioni coronale (450 μm) che contengono l'area somatosensoriale-motor e li immergere in una piastra Petri contenente freddo (0 - 4 ° C) soluzione di dissezione.
    3. Utilizzare la lama di un rasoio nuova e tagliare qualsiasi tessuto in eccesso dalle fette. Per le sezioni coronali da topi, eseguire una resezione trasversale appena sotto la commissura neocorticale (cioè, corpo calloso). Non tagliare in un movimento della sega; semplicemente applicare una pressione sulla lama nel tessuto e utilizzare un pennello dettagliare per separare delicatamente il tessuto. Assicurarsi di ridurre al minimo il movimento della sezione corona.
    4. Uso di una pipetta di trasferimento wide-bore per trasferire la porzione dorsale delle fette della corona che contengono la neo-corteccia (strato 1-6) per un secondo piatto di Petri piena di caldo (35 ° C) ACSF per un momento (~ 1 s). Poi, prontamente trasferire le fette di una camera di incubazione contenente caldo (35 ° C) carbogenated ACSF.
      Nota: La finalità del trasferimento nella piastra di Petri con ACSF è quello di ridurre al minimo il trasferimento della soluzione di dissezione alla camera di incubazione durante il trasferimento di fettine di cervello con la pipetta di wide-bore. Utilizzare la camera d'incubazione pozzi multipli per tenere fette differenti del cervello organizzati.
    5. Scartare il resto del cervello e carcassa di animale secondo le linee guida istituzionali.
  5. Incubazione e manutenzione
    1. Lasciare le fette di cervello leggermente sommerse nella camera di incubazione a 35 ° C per 30 min. Quindi, rimuovere la camera di incubazione dal bagnomaria e lasciarlo tornare a temperatura ambiente (20-25 ° C). Aspettare 1 ora per le fette di cervello recuperare prima di eseguire registrazioni elettrofisiologiche.
      Nota: Assicurarsi che non siano senza bolle d'aria che raccolgono sotto le fette di cervello nella camera di incubazione. Bolle d'aria sono interfacce aria che causano danni ai tessuti. Le fette di cervello del mouse possono essere mantenute per 6-8 h, mentre il tessuto cerebrale umano può essere immagazzinato per fino a 24 h in una camera di incubazione di bene-carbogenated con l'appropriato ACSF.
  6. Registrazioni elettrofisiologiche dello strato corticale superficiale
    Nota: Gli eventi Ictal sono osservati nelle registrazioni extracellulari campo locale (LFP) potenziali da fettine di cervello. La LFP della fetta del cervello possono essere osservate e registrate con un'interfaccia tipo camera29 o un array di multi-elettrodi sommerso (MEA) sistema16. La procedura è stato descritto in precedenza16 e ulteriori dettagli sono descritti di seguito.
    1. Utilizzare una pipetta di trasferimento wide-bore o un pennello dettagliare per spostare una fetta di cervello su carta pretagliata lente leggermente più grande che si è tenuto in luogo utilizzando una pinzetta dentale. Trasferimento la carta per lenti (che la fetta di cervello sta riposando su) alla camera di registrazione e fissarlo in posizione con uno schermo di arpa.
    2. Fase calda (35 ° C), carbogenated ACSF perfusato attraverso la camera di registrazione sopra la fetta di cervello a una velocità di 3 mL/min (~ 1 goccia/s). Utilizzare un termometro digitale per garantire che la camera di registrazione è di 33-36° C.
    3. Tirare gli elettrodi di vetro con un'impedenza di 1-3 MΩ da un tubo di vetro borosilicato (con un diametro esterno di 1.5 mm) utilizzando un estrattore. Recupero informazioni gli elettrodi di vetro con ACSF (~ 10 µ l) utilizzando una siringa Hamilton. Immediatamente scartare l'elettrodo se la punta è danneggiata.
      Nota: Bleach il filo d'argento (5 min) e consentire solo una minima parte (cioè, la punta) del filo in argento per essere sommerso gli elettrodi di vetro retro-riempito di ACSF per ridurre al minimo il rumore e la deriva durante le registrazioni. Rimuovere qualsiasi eccesso ACSF dall'elettrodo di vetro con una siringa Hamilton se necessario.
    4. Uso un microscopio stereo 20x accuratamente l'elettrodo di registrazione vetro in superficiale corticale di guida per livello (2/3) mediante manipolatori manuali. Record/vista l'attività elettrica della fetta del cervello in un computer con software standard.
      Nota: Fette vitali del cervello (alta qualità) esporrà un robusto potenziale evocato in risposta a stimoli elettrici applicati (100 µs, 30-300 μA) o impulsi di luce (30 ms, 10 mW/mm2) per il tessuto optogenetica.
  7. Induzione di grippaggio-come attività
    1. Irrorare ACSF contenente 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) sopra la fetta di cervello. Sciogliere 80 mg di 4-AP in 8,5 mL di acqua per fare una soluzione stock di 100 mM 4-AP. aggiungere 100 µ l di soluzione di riserva 4-AP 100 mM a 100 mL di ACSF per raggiungere un perfusato ACSF con 100 µM 4-AP.
      Nota: In alternativa, utilizzare Zero-Mg2 + ACSF (tabella 4), una soluzione ACSF modificata contenente no aggiunto Mg2 +, per irrorare la fetta di cervello. Per il tessuto umano, è necessario utilizzare una combinazione di 100 µM 4-AP in Zero-Mg2 + umano ACSF (tabella 5) per ottenere risultati ottimali. Il tempo medio per eventi ictal a comparire è di 15 min; Tuttavia, potrebbe richiedere fino a 40 min per alcune fette di cervello.
  8. Generazione di sequestro su richiesta: una strategia di optogenetica per topi optogenetica
    1. Applicare un impulso breve (30 ms) di blu (470 nm) luce (con un'intensità di uscita minimo 1 mW/mm2 ) per avviare un evento ictal. Utilizzare un manipolatore manuale per posizionare una fibra ottica di 1.000 µm core diametro (0,39 NA) direttamente sopra l'area di registrazione.
      Nota: Impostare la velocità della foto-stimolazione per abbinare la velocità desiderata dell'occorrenza dell'evento ictal (cioè, 1 impulso ogni 50 s). Tuttavia, il tasso non può essere eccessivamente esagerato dal tasso intrinseco in cui si verificano eventi ictal.
  9. Generazione di sequestro su richiesta: una strategia non-optogenetica per tessuto umano
    1. Posizionare la fetta di cervello in modo che gli strati superficiali sono a Monte, e gli strati profondi sono a valle nel flusso di perfusato attraverso la camera di registrazione.
    2. Tirare un elettrodo di vetro (lo stesso tipo utilizzato per le registrazioni LFP) e toccare delicatamente la punta con un pulitore delicato compito di creare una piccola apertura. Recupero informazioni l'elettrodo con ~ 25 µ l di 100 mM GABA (disciolto in acqua) e allegarlo alla picospritzer. In alternativa, recupero informazioni l'elettrodo con 200 µM glutammato (disciolto in acqua).
      Nota: Per stimare il volume viene soffiato da picospritzer (~ 50 µ l), applicare un soffio di prova su una piastra di plastica (preferibilmente quadrettata). Quindi, applicare una goccia di volumi noti (vale a dire, 10 µ l, 20 µ l, 50 µ l o 100 µ l) con una pipetta per un confronto con il soffio di prova.
    3. Applicare dei soffi del neurotrasmettitore (GABA o glutammato) al tessuto umano con un picospritzer (10-20 psi per 30-100 ms) per avviare un evento ictal. Applicare una sola boccata di 100mm GABA sullo strato profondo (5) del tessuto cerebrale per generare eventi ictal nello strato superficiale (2/3). In alternativa, applicare una sola boccata di 200 µM glutammato direttamente sullo strato superficiale per generare eventi ictal nello strato superficiale.
      Nota: Impostare la velocità della picospritzer soffio per abbinare la velocità desiderata dell'occorrenza dell'evento ictal (cioè, 1 impulso ogni 50 s). Tuttavia, il tasso non può essere eccessivamente esagerato dal tasso intrinseco in cui si verificano eventi ictal.

2. protocollo II: Acuta In vivo modello di grippaggio

  1. Chirurgia e preparazione chirurgica
    1. Ottenere un topo adulto (p35 - p60) di entrambi i sessi.
    2. Profondamente anestetizzare mouse con ketamina (95 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Eseguire il test di riflesso toe-pizzico per garantire che il mouse è sedato. In alternativa, utilizzare isoflurano (4% per induzione, 1,5-2% per la chirurgia) per anestetizzare il mouse.
      Nota: La scelta degli anestetici possa avere un impatto il sequestro attività30,31.
    3. Montare il mouse in una cornice stereotassica proteggendo la testa con le barre di orecchio. Posto un pad riscaldato sotto il mouse per tutta la durata dell'intervento chirurgico.
    4. Radere la parte superiore della testa del mouse utilizzando un roditore trimmer per esporre il cuoio capelluto. Iniettare 0,3 mL di lidocaina con un 25 5/8 in ago nel periostio per evitare un eccessivo sanguinamento o dolore. Applicare unguento oculare agli occhi del mouse per impedire loro di seccarsi durante l'esperimento.
    5. Stringere e sollevare il centro del cuoio capelluto del mouse per valutare se i suoi riflessi sono andati. Successivamente, eseguire un orizzontale tagliare per esporre il bregma alla regione di lambda del cranio. Raschiare delicatamente l'intera area esposta del cranio con un tampone di cotone per creare una superficie asciutta.
    6. Eseguire una craniotomia di 4 mm di diametro a coordinate 2,0 mm lateromedial e-2,00 mm rostrocaudal per esporre la corteccia somatosensoriale. Segnare la posizione con un cerchio (4 mm di diametro) utilizzando un pennarello indelebile. Trapano intorno al cerchio con un martello pneumatico dentale fino a quando lo strato restante dell'osso craniotomia facilmente cede quando spinto verso il basso. Applicare la soluzione salina sullo strato di osso prima di rimuovere il craniotomy con il forcipe di scheggia. Successivamente, applicare la soluzione salina calda nella regione esposta.
  2. Metodi di registrazione e induzione chimica dei sequestri
    1. Tirare gli elettrodi di vetro con un'impedenza di 1-3 MΩ da un tubo di vetro borosilicato (con un diametro esterno di 1.5 mm) utilizzando un estrattore. Recupero informazioni gli elettrodi di vetro con ~ 10 µ l di ACSF o soluzione fisiologica utilizzando un Hamilton siringa. Immediatamente scartare l'elettrodo se la punta è danneggiata.
      Nota: Bleach il filo d'argento (5 min) e consentire solo una minima parte (cioè, la punta) del filo in argento per essere sommerso gli elettrodi di vetro retro-riempito di ACSF per ridurre al minimo il rumore e la deriva durante le registrazioni. Rimuovere qualsiasi eccesso ACSF dall'elettrodo di vetro con una siringa Hamilton se necessario.
    2. Utilizzare un manipolatore manuale per guidare l'elettrodo di vetro in superficiale corticale strato (2/3) nell'area somatosensoriale-motor. Record/vista l'attività elettrica della fetta del cervello in un computer con software standard.
      Nota: Layer 2/3 è di circa 0,3 mm di profondità dalla superficie32.
    3. Applicare topicamente ~0.5 salino di 4-AP mM 1,5 mL sulla corteccia esposta del mouse con una siringa fino a coprire completamente il craniotomy. Sciogliere 14 mg di 4-AP in 100 mL di soluzione fisiologica per rendere una soluzione stock di salino 4-AP 1,5 mM.
      Nota: Preparare la soluzione salina 4-AP prima dell'inizio dell'esperimento. In media, eventi ictal appaiono 15-30 min dopo l'applicazione topica.
  3. Su richiesta generazione di sequestri in optogenetica topi
    1. Applicare un impulso breve (30 ms) di blu (470 nm) luce (con un'intensità di uscita minimo 10 mW/mm2 ) per avviare un evento ictal. Utilizzare un manipolatore manuale per posizionare una fibra ottica di 1.000 µm core diametro (0,39 NA) direttamente sopra l'area di registrazione.
      Nota: Impostare la velocità della foto-stimolazione per abbinare la velocità desiderata dell'occorrenza dell'evento ictal (cioè, 1 impulso ogni 300 s). Tuttavia, il tasso non può essere eccessivamente esagerato dal tasso intrinseco in cui si verificano eventi ictal.

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Risultati

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L'applicazione di 100 µM 4-AP a fette del cervello corticale µm e medie di 450 (intatto) buona qualità da un giovanile VGAT-ChR2 mouse affidabile indotto ictal eventi ricorrenti (> 5 s) entro 15 min (Figura 1Ai). L'applicazione di 100 µM 4-AP a fette di scarsa qualità è provocato da eventi di rottura o chiodare l'attività (Figura 1Aii). In media, il 40% delle fette da ogni cervello di topo dissecata generato correttamente even...

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Discussione

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Le fette di cervello sono trattate con un farmaco proconvulsivante o un'alterata perfusato ACSF aumentare eccitabilità della rete neurale e promuovere una precipitazione degli eventi ictal (elettrografici grippaggio-come eventi). Per i topi, le fette della corona preferite dell'area somatosensoriale-motore dovrebbero contenere la corteccia del cingulate, zona 2 (CG), ma non l'area di retrosplenial (RS); Questi marcatori anatomici consentono di identificare la gamma delle fette della corona che sono i migliori per l'induz...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da istituti canadesi di ricerca sanitaria (MOP 119603 a Peter L. Carlen e Taufik A. Valiante), l'Istituto del cervello di Ontario (a Taufik A. Valiante) e il Mightex Student Research Grant (contro Michael Chang). Vorremmo ringraziare Liam Long per la sua assistenza nella contaminazione il manoscritto dei video. Vorremmo riconoscere Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran e Shadini Dematagoda per la loro assistenza nella compilazione le figure e le tabelle in questo manoscritto. Figure 1A, 3A, 4Ae 6A sono tutte le figure originali realizzate dai dati pubblicati in Chang et al. 16.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pentobarbital di sodioN/AN/AAcquistato tramite i fornitori del Toronto Western Hospital
Siringa da 1 mmN/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Ago sterile da 25 G 5/8"N/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Lama di rasoio a filo singolo (2x)N/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Colla adesiva istantaneaN/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Carta per lentiN/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Piastra di Petri in vetro (2x)N/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Pinza per schegge (2x)N/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Micro spatola con manico in PVCN/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Micro spoon con estremità piattaN/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Detailing brush 5/0N/AN/AAcquistato da una boutique d'arte
Pipetta di trasferimento a foro largoN/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Pinzetta dentaleN/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Termometro (digitale)N/AN/AAcquistato il Amazon.ca
Controllare il serbatoio del carbogeno (95%O2/5%CO2) N/AN/AAcquistato tramite i fornitori del Toronto Western Hospital
VibratomoLeicaN/AAcquistato tramite i fornitori del Toronto Western Hospital Camera
di incubazione della fetta di cervello (nota anche come custode della fetta di cervello) Scientific Systems Design IncN/A
Cloruro di sodio (NaCl)N/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Bicarbonato di sodioN/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
DestrosioN/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Cloruro di potassio (KCl)N/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Solfato di magnesio (MgSO4 H2O)N/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Fosfato di sodio monobasico monoidrato (HNaPO4· H2O)N/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
Cloruro di calcio (CaCl2· 2H2O)N/AN/AAcquistato tramite UT Med Store
SaccarosioN/AN/AAcquistato tramite UT Med Store

Riferimenti

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