Articolo metodologico

Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito

DOI:

10.3791/57978

⸱

6 luglio 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wright State University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo presenta un metodo basato sull'accoppiamento per facilitare la proiezione di sovraespressione nel lievito gemmante utilizzando una libreria di plasmide disposti.

Abstract

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Lievito è stato ampiamente utilizzato come modello nello studio di proteine associate a malattie umane. Lo screening genetico del genoma è un potente strumento comunemente utilizzato negli studi di lievito. L'espressione di un numero di proteine associate malattia di neurodegenerative in lievito causa citotossicità e formazione aggregata, ricapitolare i risultati osservati in pazienti con questi disturbi. Qui, descriviamo un metodo per lo screening di un modello di lievito della sclerosi laterale amiotrofica-associati proteina FUS per i modificatori della sua tossicità. Invece di utilizzare la trasformazione, questa nuova piattaforma di screening si basa sull'accoppiamento di lievito per introdurre una libreria disposte dei plasmidi nel modello del lievito. Il metodo di accoppiamento ha due vantaggi: in primo luogo, è altamente efficiente; in secondo luogo, la libreria allinearono pre-trasformata dei plasmidi possa essere memorizzata per a lungo termine come uno stock di glicerolo e rapidamente applicata agli altri schermi senza il passaggio di alta intensità di lavoro di trasformazione nel modello del lievito ogni volta. Dimostriamo come questo metodo può essere utilizzato con successo per geni che modificano la tossicità del FUS.

Introduzione

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Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente usato nella ricerca scientifica di base1 di comprendere processi cellulari direttamente correlati alle malattie umane. Inoltre, è stato utilizzato come organismo modello per lo studio di proteine umane di malattia-collegati, come quelli legati a malattie neurodegenerative più comuni, tra cui il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattia di Huntington e amiotrofica Sclerosi laterale (ALS)2. Un vantaggio del modello del lievito è la facilità con cui può essere eseguita una schermata di genoma per identificare vie cellulari correlate alla tossicità delle proteine correlate a malattia, dando così la comprensione nel meccanismo della loro tossicità. Una tale schermata viene chiamata uno schermo di sovraespressione biblioteca, in cui ciascuno dei 5.500 geni lievito in una libreria di serie si trasforma in un modello di lievito per identificare quali geni possono modificare tossicità quando sovraespresso. Questo metodo di screening è stato applicato con successo nei modelli lievito di più proteine associate a malattia di neurodegenerative, tra cui huntingtina per la malattia di Huntington3, α-synuclein per la malattia del Parkinson4,5 , Aβ per morbo di Alzheimer6e FUS e TDP-43 per ALS7,8,9. Mentre di solito è fatto in un modo ad alta velocità10, il passo più laborioso dello schermo sta trasformando individualmente 5.500 geni di lievito da una libreria disposte. Questo passaggio deve essere eseguita ogni volta che lo screening viene ripetuto, e ogni volta che un modello di nuova costituzione lievito deve essere studiato. È importante trovare un modo più efficiente per eseguire questa operazione.

Cellule di lievito stabile possono esistere in forme sia aploide e diploide. Ci sono due opposti tipi di cellule aploidi, accoppiamento tipo di accoppiamento un e α. cellule aploidi di ogni accoppiamento tipo producono e secernono il proprio specifico feromone accoppiamento, a cui rispondono solo le celle di tipo accoppiamento opposto. Questo consente di accoppiamento tra un e α cellule per produrre cellule diploidi stabile, a/α. Questo processo è spontaneo e altamente efficiente11. Possiamo prendere vantaggio di questo unico ciclo di vita di S. cerevisiae per introdurre la libreria di plasmide. Più in particolare, ogni gene nella libreria allinearono plasmide si trasformerà in cellule aploidi di un tipo di accoppiamento, cioè, delle cellule α. Queste cellule contenenti i geni di libreria quindi saranno conservate in magazzino di glicerolo in un formato di 96 pozzetti disposte. Per ogni modello di lievito che deve essere proiettato, cellule di lievito contenente i geni di libreria possono essere scongelate dallo stock glicerolo, e lo screening può essere fatto attraverso l'accoppiamento con il modello di lievito di interesse per il tipo accoppiamento opposto, vale a dire, tipo accoppiamento un. Questa idea dell'utilizzo di accoppiamento per riunire due geni in lievito non è nuova. È stato applicato con successo nel lievito high throughput screening due-ibrido, in cui un esca costruiscono (cioè, fusioni di dominio Gal4-DNA-binding) in un tipo di accoppiamento è riuniti attraverso l'accoppiamento con un costrutto di preda da una libreria disposte 12. Tuttavia, questa strategia non è stato mai applicata in proiezioni biblioteca sovraespressione, che hanno sempre usato metodi di trasformazione tradizionali.

Il nostro laboratorio precedentemente stabilito un modello di lievito del ALS-collegato della proteina FUS7. Attraverso lo screening di biblioteca di sovraespressione utilizzando il metodo di trasformazione abbiamo scoperto cinque geni di lievito (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1e VHR1) che tossicità di FUS quando sovraespresso di soccorso. Questi risultati sono stati confermati in modo indipendente con uno studio simile di un altro gruppo8. hUPF1, un omologo umano di ECM32, più successivamente è stato indicato per sopprimere tossicità in cellule neuronali primarie13 e in un modello animale di ALS14 pure. Utilizzando questi cinque geni come prova di principio, dimostriamo che tutti e cinque i geni salvare tossicità FUS allo stesso modo quando vengono introdotte nel modello del lievito FUS di accoppiamento. Poiché le cellule di lievito contenente i geni di libreria possono essere memorizzate permanentemente in Stock in glicerolo e rivivere ogni volta che necessario, questo metodo basato sull'accoppiamento rimuoverà il passo che richiede tempo di trasformazione ogni volta che la libreria deve essere schermato contro. Dato che l'accoppiamento è altamente efficiente, con nessuna trasformazione di plasmide coinvolta, questa strategia diminuisce anche significativamente il costo associato di purificazione e trasformazione di una libreria di grande plasmide. Si applicherà con successo questo metodo in una libreria di screening contro il modello di lievito di FUS.

La procedura per lo screening basato sull'accoppiamento è brevemente descritta nella Figura 1. Inizialmente, la biblioteca di plasmide allinearono si trasforma in un ceppo di lievito aploidi di accoppiamento tipo α utilizza un protocollo di trasformazione del lievito di alto-rendimento in cui ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contiene lievito trasformato con un plasmide di libreria specifica. Questa raccolta di lievito trasformato viene salvata come uno stock di glicerolo che può essere scongelato e fatto rivivere per uso più tardi. Il modello di lievito di interesse, in questa cassa tossicità FUS, deve essere generato in un ceppo di lievito aploidi con il tipo di accoppiamento opposto (accoppiamento tipo un). In un modo ad alta velocità utilizzando sterile 96-pin replicatori, il ceppo FUS e ceppi di lievito che contiene la libreria di plasmide sono trasferiti per piastre da 96 pozzetti contenenti contenuti multimediali e permesso di mate. Dopo l'accoppiamento, un piccolo volume da ogni bene della cultura accoppiamento viene trasferito per piastre da 96 pozzetti contenenti media sintetico abbandono nel quale lievito solo diploide contenente entrambe le unità follicolari e geni di libreria possono crescere. Una macchina robotica spotting viene quindi utilizzata per trasferire cultura lievito da ciascun pozzetto su piastre di agar dove viene indotta l'espressione del FUS e i geni di biblioteca.  Inoltre, la coltura di lievito è macchiato per controllare le piastre di agar dove FUS e i geni della biblioteca non sono espressi. A seguito di crescita su piastre di agar, saranno identificati geni che salvare o aggravano la tossicità FUS.

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Protocollo

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Nota: Il protocollo descritto qui è stato progettato per lo screening di plasmidi libreria contenute in dieci piastre da 96 pozzetti ma può essere scalato verso l'alto o verso il basso di conseguenza. Il protocollo deve essere ripetuta per completare lo screening di tutta la libreria. Di solito, lo screening contro 10 piastre di geni libreria ogni volta che può essere gestito comodamente da 1 persona.

1. preparazione per la trasformazione del lievito di 96 pozzetti

Nota: Questo passaggio viene eseguito come in precedenza descritto7,10.

  1. Aliquotare e 5 µ l (circa 50 – 100 ng) del plasmide del DNA da una libreria di plasmide disposti in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo tondo.
    Nota: Un esempio di una libreria di questo tipo sarebbe un lievito gene sovraespressione biblioteca10.
  2. Inoculare 150 mL di media del lievito peptone destrosio (YPD) in un pallone da 500 mL con una Colonia (2 – 3 mm di diametro) del ceppo di lievito aploidi W303α. Incubare per loro una notte a 30 ° C con agitazione (200 giri).
  3. La mattina seguente, misurare il OD600 della cultura durante la notte e diluire la coltura di lievito a OD600 = 0.1 a (fino a) 2 L di YPD. Incubare a 30 ° C con agitazione (200 giri) per ~ 5 h fino a quando raggiunge la cultura OD600 = 0,4 – 0,6.

2. lievito trasformazione

  1. Raccolta la cultura lievito di riempimento 8 bottiglie di centrifuga sterile da 250 mL e li centrifugazione a temperatura ambiente a 3.000 x g per 10 min. Pour il sovranatante senza interrompere il pellet.
    Nota: Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a temperatura ambiente.
  2. Lavare il lievito con acqua distillata sterile H2O. Per questo, aggiungere 100 mL di sterile H2O per ogni bottiglia di centrifuga e vortexare per risospendere il pellet cellulare. Combinare le cellule lavate in 2 bottiglie e centrifuga li a 3.000 x g per 5 minuti versare il sovranatante.
  3. Lavare le cellule in ogni bottiglia in 100 mL di 0.1 M LiOAc/1XTE (100mm LiOAc; 10 mM Tris, pH 8.0; 1 mM EDTA) e li Centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti versare il sovranatante.
  4. Durante la centrifugazione, bollire 5 mL di sperma di salmone DNA (10 mg/mL) a 100 ° C utilizzando un riscaldatore di blocco per 3 min e poi raffreddarlo sul ghiaccio.
  5. Risospendere il pellet cellulare in 25 mL di 0.1 M LiOAc/1XTE in ogni bottiglia, combinare le celle sedimento e trasferirli in un matraccio da 150 mL. Aggiungere 5 mL di DNA dello sperma salmone pre-raffreddato e incubare a 30 ° C con agitazione (225 giri/min) per 30 min.
  6. Versare il composto di cellule in un serbatoio di reagente monouso sterile e, usando una pipetta multicanale, trasferire 35 µ l della miscela delle cellule in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti turno-inferiore contenente il DNA del plasmide di biblioteca. Piastre di vortice il 96 pozzetti utilizzando un Vortex piastra per 1 min a 1.000 giri/min. Incubare le piastre a 30 ° C per 30 minuti senza agitazione.
    Nota: Non mettere le piastre, quindi il calore può trasferire in modo più efficiente. Abbiamo trovato che nel Vortex le piastre da 96 pozzetti a 1.000 giri/min non causa liquido fuoriesca i pozzi, ma una velocità sicura vortice dovrebbe essere testata prima di eseguire il passaggio.
  7. In un pallone, preparare 200 mL di buffer di trasformazione contenente una concentrazione finale di 40% PEG3350, 10% DMSO e 0,1 M LiOAc. Preparare il tampone di trasformazione immediatamente prima dell'uso e mescolare agitando.
  8. Rimuovere 96 piatti dall'incubatrice 30 ° C e mescolare per 30 s a 1.000 giri/min utilizzando la piastra Vortex. Aggiungere 125 µ l di buffer di trasformazione in ciascun pozzetto e poi vortice le piastre per 1 min a 1.000 giri/min.
  9. Incubare le piastre a 30 ° C per 30 min e quindi il calore shock il lievito inserendo le piastre in un'incubatrice di 42 ° C per 15 min.
    Nota: Non mettere le piastre.
  10. Centrifugare le piastre per 5 min a 3.000 x g. Rimuovere il buffer di trasformazione dai pozzetti invertendo le piastre sopra un bidone dei rifiuti e con forza il buffer dalle piastre di dumping. Asciugare rapidamente le piastre invertite su un tovagliolo di carta pulito per rimuovere qualsiasi liquido sulla parte superiore delle piastre.
  11. Sciacquare le cellule aggiungendo le piastre 200 µ l di dropout minimo medio corrispondente al marcatore selezionabile sul plasmide di biblioteca.
    Nota: Abbiamo usato un Ura-mezzo sintetico.
  12. Centrifugare le piastre per 5 min a 3.000 x g e rimuovere il surnatante sopra un bidone dei rifiuti come descritto al punto 2.10.
  13. Aggiungere 160 µ l di minimo medio-Ura contenente 2% di glucosio. Vortice le piastre per 1 min a 1.000 giri/min e li Incubare a 30 ° C per 48 h senza agitazione. Dopo 48 h, notare che un pellet di lievito trasformato è visibile nella parte inferiore di ciascun pozzetto.
  14. Usando un erogatore liquido, aggiungere 100 µ l di glucosio contenente Ura-media in tutti i pozzetti di un nuovo set di piastre da 96 pozzetti.
  15. Vortice le piastre contenenti il lievito trasformato (dal punto 2.13) a 1.000 giri/min per 30 s. utilizzando un replicatore di 96-pin plastica sterile, inserire i perni nei pozzetti contenenti il lievito trasformato e quindi li inoculare nei rispettivi pozzetti delle piastre nuove riempiti di media. Incubare le piastre nuove a 30 ° C per 24 h.
    Nota: Se lavora con 10 tavole, il mezzo può anche essere distribuito manualmente utilizzando pipette multicanale.
  16. Dopo 24 h, un pellet di lievito dovrebbe essere visibile nella parte inferiore di ciascun pozzetto contenente lievito trasformato con successo. Per salvare questi ceppi di lievito come scorte di glicerolo, aggiungere 50 µ l di glicerolo al 50% ad ogni pozzetto, vortice le piastre per 30 s a 1.000 giri/min, sigillare le piastre con nastro di sigillamento e congelarli a-80 ° C.
    Nota: La procedura descritta in precedenza solo bisogno di essere eseguito una volta. Future proiezioni dei modelli differenti di lievito contro lo stessa libreria USA e getta il serbatoio del reagente possono iniziare dalle scorte di glicerolo e procedere immediatamente dalla procedura riportata di seguito.

3. accoppiamento tra celle contenenti geni biblioteca e Query lievito

  1. Per rivivere i ceppi Biblioteca dello stock di glicerolo, prendere le piastre da 96 pozzetti fuori dal congelatore-80 ° C, togliere il nastro di tenuta e lasciare che il lievito scongelare a temperatura ambiente per circa 30 min.
  2. Una volta che il lievito si è sciolto, utilizzare un replicatore di 96-pin plastica sterile per inoculare le scorte di glicerolo a 160 µ l di fresco Ura-media contenente 2% di glucosio in piastre da 96 pozzetti e li Incubare a 30 ° C per 24 h. immediatamente dopo gli sforzi di libreria sono utilizzati , sigillare le piastre con nastro di tenuta e restituirli al congelatore-80 ° C.
  3. Lo stesso giorno i ceppi di biblioteca (W303α) vengono scongelati, inoculare il ceppo di lievito query (qui, FUS in W303a) a 50 mL di YPD e crescere in una notte a 30 ° C con agitazione a 250 giri/min.
  4. La mattina dopo, versare il ceppo di lievito di query per un serbatoio di reagente monouso sterile e aliquota 160 µ l del ceppo query in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale.
  5. Utilizzando il liquido dispenser, erogare 160 µ l di media YPD in ciascun pozzetto di dieci piastre da 96 pozzetti. Utilizzare queste tavole più tardi per l'accoppiamento del ceppo di lievito di query con il lievito di biblioteca.
  6. Brevemente vortice la piastra a 96 pozzetti contenenti il ceppo di query e quindi utilizzare un replicatore 96-pin sterile per trasferire la query ceppo alle piastre YPD.
  7. Brevemente vortice la libreria colare piastre e, per ogni piatto di ceppo di libreria, utilizzare un nuovo replicatore 96-pin sterile per trasferire i ceppi di biblioteca per i piatti YPD che sono stati inoculati con il ceppo di query.
    Nota: Cellule in glicerolo perdono la loro vitalità dopo diversi cicli di gelo-disgelo. Restituendo i ceppi di libreria per l'archiviazione a lungo termine (congelatore a-80 ° C) più presto manterrà la libreria in buona qualità e pronto per un utilizzo futuro. Adeguatamente mantenuto, lo stock di glicerolo può essere congelato e scongelato almeno 10 volte. Inoltre è consigliabile mantenere una copia di lavoro e copie di backup dello stock di glicerolo. Quando lo stock di lavoro non funziona, immediatamente fare una nuova copia dalla copia di backup di lavoro.
  8. Incubare le piastre YPD a 30 ° C per 24 h. nota che un pellet di lievito sarà visibile nella parte inferiore di ciascun pozzetto dopo 24 h.
  9. Riempimento a 96 pozzetti con un mezzo di filtraggio minimo contenente 2% raffinosio, corrispondente ai marcatori selezionabili sul plasmide nel ceppo di query e il plasmide di libreria (ad es., qui Ura - suo-).
  10. Utilizzare un replicatore 96-pin sterile per trasferire il lievito da YPD accoppiamento culture per i terreni selettivi. Incubare le piastre a 96 pozzetti a 30 ° C per 48 h; solo cellule che accoppiato di lievito e diploide formato celle e, pertanto, contengono entrambi il plasmide di query e il plasmide biblioteca sarà in grado di crescere in questa media. Dopo 2 giorni, osservare che una pallina è visibile sul fondo dei pozzetti.

4. analisi di spotting

  1. Dopo 48 h di crescita nei mezzi selettivi contenenti raffinosio, spot il lievito su piastre di agar.
    1. Preparare 2 set di piastre di Ura-His-dropout contenenti 2% agar utilizzando lastre di polistirene chiaro, uno contenente 2% galattosio e altri contenenti glucosio 2%.
    2. Piastre di vortice il 96 pozzetti per 1 minuto a 1.000 giri/min, quindi individuare il lievito per le piastre di Ura-His-dropout contenenti galattosio 2% e 2% agar (FUS e Biblioteca geni sono indotti) e le piastre di Ura-His-dropout contenente glucosio 2% e 2% agar (geni FUS e biblioteca represso) utilizzando una macchina robotica spotting, mediante il quale la cultura in ogni bene è macchiata sulle piastre di agar in quadruplice copia (vale a dire, la cultura in 1 bene è notata a 4 punti sulla piastra di agar).
    3. Dopo spotting, lasciate le piastre di agar asciugare e poi posizionarli capovolti in un'incubatrice di 30 ° C. Fotografare le piastre di agar ogni 24 h per registrare una crescita più veloce/più lievito in cui è salvata la tossicità per il ceppo di query o per registrare una crescita più lenta e meno in cui la tossicità per il ceppo di query è esacerbata. Incubare le piastre per 4 giorni.
      Nota: La cultura in ogni bene può essere individuata su piastre di agar 1-a-1, come mostrato in un metodo basato sulla trasformazione precedente10. Tuttavia, la 1-a-4 spotting qui (che può comodamente essere impostato utilizzando la macchina robotica spotting) aumentando la robustezza del test riducendo il numero di falsi positivi. Risultati positivi vengono considerate solo quando tutte le 4 colonie dallo stesso ben mostrano un fenotipo simile.

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Risultati

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L'ALS-collegato della proteina FUS, una proteina legante RNA/DNA, precedentemente è stata studiata in lievito aploidi7,8. Utilizzando la selezione genetica del metodo basato sulla trasformazione scoperto parecchi geni di lievito che sopprimono la tossicità FUS. L'omologo umano di uno dei geni di lievito più successivamente è stato dimostrato per essere efficace a sopprimere la tossicità in una primaria delle cellule di un neurone ...

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Discussione

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Qui, descriviamo un protocollo per eseguire una schermata di sovraespressione di plasmide in lievito mediante accoppiamento per introdurre la libreria di plasmide nel modello del lievito. Utilizzando questo approccio, più modelli di lievito della tossicità delle proteine malattia neurodegenerative possono essere selezionate utilizzando la stessa raccolta di lievito trasformata con una libreria di plasmide. Solo il laborioso processo di trasformazione deve essere eseguita una volta, dopo quale lievito altamente efficiente...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Siamo grati per la premurose discussioni con i membri del laboratorio Ju e laboratorio di Zhong e il sostegno finanziario da Wright State University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
salmone sperma DNA (SS-DNA)Sigma-Aldrich  D1626
YPD brodoResearch Products International (RPI)Y20090
Agar Fisher granulatoSci BP97445
D-(+)-GlucoseResearch Products International (RPI)G32040
D-(+)-GalactoseResearch Products International (RPI)G33000
D-(+)-Raffinosio PentahydrateResearch Products Internazionale (RPI)R20500
Solfato di ammonioFisher SciA702-500
Sintetico Ura- drop out mediumClontech630416
Integratore di aminoacidi di lievito -Istidina / -UracilClontech630422
Lievito base di azoto senza aminoacidi e solfato di ammonioResearch Products International (RPI)Y20060
Dimetil solfossido (DMSO)Fisher SciS67496
Acetato di litio, anidroFisher SciAC268640010
Polietilenglicole 3350 (PEG-3350)Spettro chimico PO125-12KG
Replicatore a 96 pin ScinomixSCI-5010-OS
Nunc OmniTrayThermo Sci140156
Corning Costar Piastra per test a 96 pozzetti, fondo rotondo con coperchioFisher Sci07-200-760non trattato, sterile
Eppendorf  Research plus Pipetta multicanaleEppendorfTI1369005230-300ul volume
Fisherbrand  Isotemp Bagni a secco digitali/Riscaldatori a blocchiFisher Sci88-860-023
Eppendorf  MixMateEppendorf21-379-00
Eppendorf 5810R CentrifugaFisher Sci05-413-112
Centrifuga Avanti J-26 XPIBeckman393127
MultiFlo FX Dispenser multimodaleBioTek
Rotore HDA   Strumenti
Singer

Riferimenti

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Yeast MatingPlasmid Library ScreeningFUS ToxicityYeast TransformationGlycerol Stock StorageSelective Medium GrowthRobotic SpottingAgar Plate AssayNeurodegenerative Disease ModelOverexpression Screening

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