Articolo metodologico

Semplice induzione chirurgica della perdita dell'udito conduttiva con verifica utilizzando la visualizzazione dell'otoscopio e la risposta di clap di clap di comportamento in ratto

DOI:

10.3791/57993

⸱

26 ottobre 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, México, 2State Key Laboratory of Marine Pollution (SKLMP), City University of Hong Kong, Hong Kong, 3Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine and Life Sciences, City University of Hong Kong, Hong Kong, 4Department of Physics, City University of Hong Kong, Hong Kong, 5Department of Clinical Oncology, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong, 6Department of Materials Science and Engineering, City University of Hong Kong, Hong Kong

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un'induzione della perdita dell'udito conduttiva replicabile tramite la puntura chirurgica della membrana tipopanica e la verifica mediante la visualizzazione dell'otoscopio e la valutazione comportamentale tramite clap startle.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'ipoacusia conduttiva (CHL) è un'imposizione uditiva prevalente negli esseri umani. L'obiettivo del protocollo è descrivere una semplice procedura chirurgica per indurre CHL nei roditori. Il protocollo dimostra CHL da puntura a membrana timpanica. La verifica della chirurgia CHL è stata effettuata mediante esame di otoscopio e valutazione comportamentale mediante risposta clap startle, sia replicabile che affidabile, e sono semplici metodi per dimostrare che si è verificata la perdita dell'udito. La semplice procedura CHL è vantaggiosa per la sua riproducibilità e flessibilità nei diversi inseguimenti nella ricerca sulla perdita dell'udito. I limiti di indurre CHL con un approccio chirurgico sono associati alla curva di apprendimento per eseguire la procedura chirurgica e la fiducia nell'esame audiologico. L'induzione di un'ipoacusia da parte della CHL consente di studiare facilmente le manifestazioni neurali e gli esiti comportamentali della perdita dell'udito.

Introduzione

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La prevalenza della perdita dell'udito nei bambini e negli adulti è di circa il 19,5%1 e 15,2%2 rispettivamente. Tuttavia, circa il 39,3% di tutti i neonati con uno screening acustico anomalo non riceve un trattamento correttivo come riportato dai Centers for Disease Control3. La perdita dell'udito è una condizione ampiamente studiata e il roditore è un modello robusto per studiare i normali disturbi dell'udito e dell'udito4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15. Disturbi dell'udito come la perdita dell'udito conduttiva (CHL) portano ad un aumento della depressione sinaptica a breve termine nella corteccia uditiva4, che si traduce in pendenze psicometriche meno profonde associate a soglie di rilevamento della modulazione di frequenza 5. I modelli di perdita dell'udito conduttivi mediante rimozione/spostamento chirurgico della malleus, della puntura della membrana timpanica (TM) o del tappo per le orecchie sono facilmente impiegabili e consentono la rapida induzione del modello di perdita dell'udito5,14 ,15,16,17,18. L'obiettivo del presente protocollo e metodo è quello di dimostrare un modello CHL semplice e riproducibile nei roditori.

L'attuale protocollo è poco costoso (300 USD con tutti gli strumenti) e facilmente modificabile per le diverse attività di ricerca. Il ratto ha avuto valutazioni dettagliate dell'anatomia dell'orecchio medio19,20,21,22,23, approcci chirurgici24, modelli in otite media25, 26,27 e TM rigenerazione foratura16,17,18,28,29,30, che lo rende un modello ideale per studiare perdita dell'udito. Qui, una semplice procedura di induzione di CHL è descritta con la verifica tramite otoscopio e valutazione comportamentale con risposta clap startle nel ratto, che poi può essere utilizzata per esplorare ulteriori sequele di perdita dell'udito. La procedura CHL è indotta dalla puntura chirurgica della TM. La verifica della procedura CHL viene eseguita dalla visualizzazione dell'otoscopio per determinare l'assenza della TM. La valutazione comportamentale viene eseguita da un livello di pressione sonora (SPL) ad alto decibel (dB). Questo metodo è stato applicato in precedenza in una varietà di roditori. È facile da replicare, produce robuste differenze psicometriche e cambiamenti nelle risposte fisiologiche neurali4,5,16,17,18.

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Protocollo

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L'attuale studio e le procedure sono stati approvati dai comitati etici della ricerca sugli animali della City University di Hong Kong, dell'Università di Hong Kong e del Dipartimento della Salute della Regione Amministrativa Speciale di Hong Kong.

1. Animali

  1. Utilizzare ratti Sprague-Dawley (SD) di due mesi (N - 90, 200-250 g).
    NOTA: i roditori sono stati forniti dall'unità animale da laboratorio accreditata dell'Università di Hong Kong.
  2. Mantenere i ratti sotto una temperatura costante di 25 gradi centigradi e del 60-70% di umidità presso l'Unità di Ricerca Animale di Laboratorio.
  3. Casa roditori in cicli di luce / buio 12/12-h con accesso al cibo e acqua potabile, ad libitum.
  4. Acclimatarsi roditori per l'ambiente abitativo per almeno un giorno prima della chirurgia CHL.
  5. Raccogliere il roditore dal mischia e anesizzare il roditore con un cocktail di ketamina e xilarina (80-100 mg/kg: 5-10 mg/kg, rispettivamente) tramite iniezione intraperitoneale (combinare 1,0 mL di ketamina con 0,5 mL di xilarcome concentrazione finale).
    NOTA: Utilizzare una siringa da 1 mL con un ago da 23-25G. Iniettare circa 0,2 mL per 100 g di peso corporeo del ratto per 30 min di anestesia.
  6. Eseguire il pizzico del dito del dito per verificare la sensazione di dolore e per corroborare l'anestesia corretta. Una reazione al pizzico dell'aldito profondo (per ritiro dell'arto posteriore) indica un'anestesia insufficiente.

2. Configurazione chirurgica

  1. Sterilizzare tutte le attrezzature in un autoclave o bicchiere caldo perline sterilizzatore prima di iniziare l'intervento chirurgico. Pulire l'area chirurgica con il 70% di etanolo.
  2. Utilizzare guanti di lattice e camice da laboratorio prima di iniziare la procedura.
  3. Posizionare un drappo chirurgico sterile sul banco pulito (Figura 1A).
  4. Sterilizzare microforbici e un otoscopio prima dell'intervento chirurgico per ridurre al minimo l'infezione dell'orecchio (Figura 1B).
  5. Posizionare le microforbici e l'otoscopio nell'area sterile.
  6. Posizionare il roditore nel campo chirurgico e in allineamento con il chirurgo.
  7. Procedere con l'induzione chirurgica di CHL.

3. Induzione chirurgica della perdita dell'udito conduttiva

  1. Posizionare la coda e la testa del roditore allineati in posizione prona, testa più vicina al chirurgo.
  2. Visualizzare l'orecchio sinistro e destro del roditore sotto l'otoscopio per garantire una sana membrana timpanica (Figura 2a). Valutare l'orecchio destro e sinistro di ogni roditore per verificare le condizioni sane prima dell'induzione della CHL.
  3. Afferrare l'elica dell'orecchio ed estendere il canale uditivo esterno (ad esempio, canale uditivo, meatus uditivo esterno, qui canale uditivo) per far sì che l'interno diventi oscurato e annerito dalla profondità. Qui, il canale uditivo è reso perpendicolare alla superficie della TM.
    NOTA: Assicurarsi che il cannel uditivo sia direttamente parallelo ora e che la TM formi un angolo retto con l'asse di inserimento delle microforsors. Sarà visualizzato come un tubo nero senza luce. A volte il canale uditivo deve essere inclinato con una leggera angolazione, circa 15 gradi rispetto alla superficie planare del cranio. Questo assicura che la mano del chirurgo sia perpendicolare alla superficie della TM.
  4. Introdurre le micro forbici al centro del canale uditivo prestando attenzione a non sfiorare o graffiare il tessuto del canale uditivo e procedere leggermente, circa 5 mm dal centro dell'oscurità, spingendo in avanti delicatamente attraverso il centro della TM.
    NOTA: la foratura TM può essere confermata da un suono pop quando le punte micro-forbice perforano la TM. Il suono popping può essere ascoltato a circa 2 min 52 s nel video. Questo non è un suono forbice; questo è un suono di puntura TM. Come misurato dopo l'analisi, il "pop" è di circa 20 dB SPL maggiore del suono di sottofondo come registrato da un microfono ad alta frequenza. Non c'è bisogno di verificare il suono "pop" in questa misura, la visualizzazione dell'otoscopio è sufficiente. L'investigatore potrebbe dover praticare l'esentire di un "pop" durante ogni procedura di CHL.
  5. Aprire immediatamente le micro forbici a molla e ruotare tre volte dopo aver forato la TM per garantire lo spostamento della testa del malleus lontano dal TM (solo se si desidera lo spostamento malleo).
  6. Rimuovere le microfors afors e posizionare il roditore sotto l'otoscopio per la visualizzazione.
    NOTA: È importante notare che non dovrebbe verificarsi alcun sanguinamento significativo dopo la procedura chirurgica. Eutanasia il roditore e non procedere alla valutazione comportamentale se si verifica un sanguinamento.
  7. Indurre CHL bilaterale procedendo come sopra nell'orecchio opposto.

4. Visualizzazione otoscopio

  1. Confermare un intervento chirurgico CHL di successo con un otoscopio utilizzando uno speculum di piccolo diametro per visualizzare l'orecchio medio del roditore.
  2. Valutare ogni roditore prima e dopo la procedura chirurgica CHL sotto l'otoscopio. Garantire la conferma della normale TM (Figura 2a) e della TM danneggiata dopo l'induzione di CHL (Figura 2b).
  3. Cura post-operatoria per il roditore
    1. Posizionare il roditore nella gabbia di casa sotto una lampada calda.
    2. Osservare l'induzione del roditore dopo la CHL fino a quando i diritti del roditore stesso.
    3. Iniettare il roditore con il siero di glucosio (dextrose/saline) per recuperare coscienza e mettere il roditore nella gabbia di casa per il recupero.
      NOTA: Utilizzare un ago da 23G con una siringa da 10 mL per iniettare 5 mL di salina dopo l'intervento chirurgico CHL.
    4. Iniettare il roditore via intramuscolare con Enrofloxacin antibatterico 0,05 mg/kg due volte durante il periodo di recupero di 24 ore.
    5. Osservare regolarmente il roditore per il comportamento del dolore o sintomi dopo l'intervento chirurgico.

5. Valutazione comportamentale (convalida dell'induzione della CHL) - risposta clap startle

  1. Corroborato CHL (dopo la conferma dell'otoscopio) 24 ore dopo l'intervento chirurgico con la valutazione comportamentale costituita dal clap-startle-test.
  2. Posizionare il ratto indotto dalla CHL accanto a un ratto normale in due gabbie adiacenti separate.
  3. Mettere i roditori in una stanza silenziosa.
  4. Stare a circa 0,5 m di distanza dai roditori e procedere a applaudire con durate egualmente distanziate un certo numero di volte (5 applausi sono stati scelti e distanziati su 1 secondo).
    NOTA: L'applauso prodotto dall'applauso della mano misurato 40 dB SPL maggiore del suono di sottofondo come registrato da un microfono ad alta frequenza.

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Risultati

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La semplice procedura CHL è stata eseguita su 90 ratti e da questo gruppo 2 ha avuto sanguinamento significativo e 2 non hanno avuto perdita dell'udito il giorno successivo, come valutato da clap startle comportamentale. Questi quattro ratti sono stati scartati. I ratti dovrebbero essere scartati come descritto dai motivi della discussione a causa di complicazioni. L'induzione di foratura e/o malleus spostamento/rimozione di malleus (Figura 2B) provoca CHL, c...

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Discussione

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Descriviamo una semplice induzione chirurgica di CHL con verifica utilizzando la visualizzazione dell'otoscopio e la risposta comportamentale dell'applauso nel ratto. Qui dimostriamo il metodo sul ratto e in precedenza questo metodo è stato applicato a gerbilli e topi. Il metodo può essere facilmente adottato per altri roditori. L'induzione di CHL consente lo studio di una sottile forma di perdita dell'udito che si manifesta nelle alterazioni corticali uditive e nei risultati comportamentali psicofisici...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interessi finanziari o non finanziari.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dall'Hong Kong Research Grants Council, Early Career Scheme, Project #21201217 to C. L., per il progetto Brain mapping ha guidato l'elettrofisiologia con applicazioni nella ricerca sull'inquinamento acustico e acustico. Ringraziamo il Posgrado en Ciencias Biomédicas, l'Instituto de Neurobiologa dell'Universidad Nacional Autnoma de México (UNAM), il Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) México per la Graduate Fellowship 578458 a FAM Manno.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Guanti in lattice, polivinile o nitrileAMMEXUtilizzare guanti senza polvere Forbici
(vedi Fig. 1b)RWD Life ScienceS11035-08Lunghezza totale 8,0 cm, con tagliente da 3,5 mm, o micro pinze simili. Le pinzette standard con azione a molla saranno sufficienti
Otoscopio mini 3000HEINE D-008.70.120ML'otoscopio LED standard sarà sufficiente
per ratti o topiJAX labsQualsiasi piccolo roditore
Piccola gabbia per roditoriTecniplast1284LServono due gabbie per separare il roditore CHL dal roditore udente. Se i roditori sono a diretto contatto tra loro, si spaventeranno a vicenda. Dimensioni della gabbia 365 x 207 x 140 mm, superficie del pavimento: 530 cm2/82,15 in2
a molla Micro da 8 mil

Riferimenti

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