Articolo metodologico

Un metodo volumetrico per la quantificazione di Vasospasm cerebrale in un modello murino di emorragia subaracnoidea

DOI:

10.3791/57997

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28 luglio 2018

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1Department of Neurosurgery, Medical Center of the Johannes Gutenberg - University, 2Department of Neuroradiology, Medical Center of the Johannes Gutenberg - University, 3Platform for Biomaterial Research, Medical Center of the Johannes Gutenberg - University, 4Department of Anesthesiology, Medical Center of the Johannes Gutenberg - University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo di questo articolo è di presentare un metodo che consente una ricostruzione 3-dimensionale dell'albero cerebrovascolare in topi dopo micro tomografia computata e determinazione dei volumi di segmenti vascolari intero che possono essere utilizzati per quantificare il vasospasm cerebrale in modelli murini di emorragia subaracnoidea.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'emorragia subaracnoidea (SAH) è un sottotipo di ictus emorragico. Vasospasm cerebrale che si verifica all'indomani del sanguinamento è un fattore importante per determinare il risultato paziente e pertanto è spesso preso come un endpoint dello studio. Tuttavia, negli studi sugli animali piccoli su SAH, quantificazione di vasospasm cerebrale è una sfida importante. Qui, viene presentato un metodo ex vivo che permette la quantificazione dei volumi dei segmenti intera imbarcazione, che possono essere utilizzati come una misura oggettiva per quantificare vasospasm cerebrale. In una prima fase, colata di endovascular del vasculature cerebrale viene eseguita utilizzando un agente radiopaco. Quindi, dati a sezione trasversale di formazione immagini sono acquisiti tramite micro tomografia computata. Il passaggio finale consiste nella ricostruzione 3-dimensionale dell'albero vascolare virtuale, seguita da un algoritmo per calcolare il centro linee e volumi dei segmenti vaso selezionato. Il metodo ha provocato una ricostruzione virtuale altamente accurata dell'albero cerebrovascolare mostrato da un confronto basato sul diametro di campioni anatomici con loro ricostruzioni virtuali. Confrontato con diametri di nave da solo, i volumi di nave evidenziano le differenze tra vasi angiospastiche e non angiospastica mostrati in una serie di SAH e topi falsità-azionati.

Introduzione

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Aneurysmatic emorragia subaracnoidea (SAH), un sottotipo di ictus emorragico, è una malattia comune nelle unità di cura di neurointensive. Oltre a lesione cerebrale precoce (EBI), che comprende il danno cerebrale causato da spurgo evento stesso, un altro fattore importante determinare l'outcome del paziente è ischemia cerebrale in ritardo (DCI), definito dalla clinica deterioramento attraverso alterata cerebrale aspersione o infarto cerebrale non associato a interventi chirurgici o interventistica1,2,3. Meccanismi importanti che contribuiscono a DCI sono vasospasmo di grandi vasi cerebrali da un lato; d'altra parte, disfunzioni microcircolatorie con vasospasmo di microvasi e microthrombosis e di ischemia legate alla depressione di diffusione corticale svolgono un ruolo (rivisto in Martini 20141). Pertanto, diagnosi di vasospasmo dei grandi vasi cerebrali è di fondamentale importanza nella pratica clinica e viene visualizzato un endpoint importante in molti studi clinici e sperimentali.

Nonostante il fatto che le caratteristiche di vasospasm in modelli murini di SAH non sono direttamente trasferibili ai modelli murini, pazienti umani di SAH vasospasmo correlato sono stati di crescente importanza negli ultimi anni. In questi modelli SAH è indotta da endovascular filamento perforazione4,5,6,7,8, transection del citernale vasi9o iniezione di sangue nel CSF10 ,11,12. Contrariamente ai grandi modelli animali di SAH, che tradizionalmente sono stati progettati per studiare vasospasmo13, modelli murini hanno il grande vantaggio che numerosi ceppi di topi transgenici sono disponibili. Questo li rende un ottimo strumento per studiare i meccanismi molecolari che portano al vasospasmo e DCI. Tuttavia, la determinazione di vasospasm cerebrale nei topi è impegnativo. Infatti, contrariamente ai grandi modelli animali in cui vasospasmo può essere esaminato tramite tecniche di imaging clinici, in vivo imaging per analizzare vasospasm cerebrale nei topi non è ancora disponibile. Di conseguenza, vasospasmo comunemente è determinato usando entrambi di10,di sezioni istologiche11 o microscopicamente dopo fusione dei vasi cerebrali7,9,12. Tuttavia, queste tecniche hanno lo svantaggio di tale nave diametri sono esaminati in punti definiti solo.

Basato su un precedente studio7, questo manoscritto presenta un metodo per obiettivo e analisi riproducibili di vasospasm in un modello murino di SAH. Il metodo si basa sulla perfusione e fusione dei vasi cerebrali, ex vivo l'esame micro-CT, ricostruzione digitale dell'albero della nave e successiva valutazione dei volumi dei vasi cerebrali intero.

Protocollo

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Esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato responsabile cura degli animali (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) e secondo il tedesco Animal Welfare Act (TierSchG). Tutte le linee guida internazionali, nazionali e istituzionali applicabili per la cura e l'uso di animali sono state seguite.

In questo studio, sono stati utilizzati topi C57BL6 maschi (età 10-12 settimane). In breve, l'emorragia subaracnoidea è stata indotta da perforazione filamento endovascular nell'ambito dell'anestesia con isoflurano. L'arteria carotide esterna sinistra era preparato chirurgicamente. Quindi, un filamento è stato inserito nell'arteria carotica esterna e avanzato intracranially attraverso l'arteria carotica interna che è stata perforata presso la carotide T, inducendo un'emorragia subaracnoidea. Un aumento nella pressione intracranica è stato preso come un indicatore di successo endovascular perforazione. Un protocollo dettagliato di un modello di perforazione del filamento endovascular di SAH in topi è stato pubblicato da altri8,14.

1. aspersione ed Endovascular Casting

  1. In questo studio, perfusione è stata eseguita 72 ore dopo l'induzione di SAH. Inducono anestesia iniettando intraperitonealmente 5 µ g/g corpo peso (bw) midazolam, 30 ng/g bw fentanyl e 0,5 µ g/g bw medetomidin. Continuare solo dopo che è stato raggiunto un sufficiente livello di anestesia, che è confermato dall'assenza di reazioni agli stimoli del dolore.
  2. Aprire il torace, il ventricolo sinistro con una cannula di 21G di puntura, aprire l'atrio destro e morsetto aorta discendente come descritto altrove15.
  3. Eseguire una perfusione transcardiaca utilizzando le seguenti soluzioni: tampone (i) Dulbecco fosfato isotonico contenenti MgCl2 e CaCl2 a pH 7.4 con glucosio 1 g/L e (ii) soluzione di paraformaldeide 4%.
    1. Iniziare la perfusione con soluzione (i) per 2 minuti e continuare con la soluzione (ii) per 4 minuti.
    2. Infondere le soluzioni ad una temperatura di 37 ° C e utilizzando una pompa a pressione controllata con tasso variabile aspersione di irrorare con una pressione costante di 70 mmHg, che è stato trovato per essere la pressione di perfusione ottimale per analizzare vasospasmo in topi16. Evitare una perdita di pressione quando si passa dalla soluzione (i) alla soluzione (Ii).
  4. Dopo perfusione con soluzioni (i) e (ii), continuare la perfusione per 20 minuti a temperatura ambiente con agente di casting radiopaco (Vedi Tabella materiali) ad un tasso costante di 0,2 ml/min.
  5. Consentire per la polimerizzazione del materiale radiopaco colata a 4 ° C durante la notte. Quindi rimuovere il cervello dal cranio come descritto in precedenza17, trasferire il campione di soluzione al 4% PFA e conservare il campione a 4 ° C fino al micro esame di CT.

2. micro tomografia computata

  1. Posizionare il cervello al centro di un tubo di plastica con una pinza anatomica smussata. Scegliere un tubo con un diametro leggermente maggiore rispetto al campione per garantire che l'oggetto non si muova durante l'acquisizione di immagini. Utilizzare garza per chiudere il tubo.
  2. Collegare il tubo di plastica per il motore micro-fare un passo sul sistema di posizionamento (CNC) calcolatore-navigato-controllo in cabina a raggi x, in cui l'oggetto viene ruotato attorno al suo asse orizzontale.
  3. Allineare l'esempio del campo di vista sotto radiografia a raggi x. Per ottenere l'ingrandimento massimo, posizionare l'oggetto più vicino possibile alla fonte di raggi x e massimizzare la distanza e il rivelatore per quanto possibile.
  4. Utilizzare un protocollo di acquisizione dell'immagine di step-and-shoot con i seguenti parametri di scansione: impostare il tempo di esposizione per 1 s per ogni proiezione ottimizzare il rapporto segnale-rumore (SNR), tubo di tensione 80 kV (corrente 38 µA), rotazione di 360° con conseguente 1.000 proiezioni.
  5. Per la ricostruzione dei dati RAW utilizzare un algoritmo di proiezione posteriore filtrata applicando il filtro di Shepp-Logan con una matrice di voxel 1024 x 1024 x 1024 utilizzando software di ricostruzione (Vedi Tabella materiali). Per un'ulteriore analisi, importare i dati DICOM risultanti in software di visualizzazione 3D (Vedi Tabella materiali).

3. 3-dimensionale ricostruzione dell'albero vascolare intracranica e determinazione dei volumi di nave

Nota: Informazioni di base sulle funzioni del software di visualizzazione possono essere trovati utilizzando la funzione di aiutare.

  1. Importare dati Dicom in software di visualizzazione utilizzando la funzione di importazione.
  2. Visualizzare l'albero di nave con la funzione Volren. Scegliere la soglia di visualizzazione in modo che le grandi arterie cerebrali sono raffigurate in profili taglienti. È importante utilizzare la stessa soglia di visualizzazione per tutti i set di dati appartenenti alla serie sperimentale.
  3. Dissezionare virtualmente le arterie cerebrali basali (cerchio di Willis) con la funzione VolumeEdit che circonda i vasi con il cursore. Quindi praticamente dissezionare il segmento di vaso per essere analizzati. Di conseguenza, è possibile ruotare il modello 3-dimensionale dell'albero vascolare al fine di separare con precisione tutti i piccoli rami dall'arteria principale. È essenziale per l'ulteriore analisi eliminare tutte le navi tranne il segmento di vaso per essere analizzati.
  4. Applicare la funzione Autoskeleton con soglia impostata su soglia di visualizzazione, che genera un centro-linea -base SpatialGraph.
  5. Quindi, applicare la funzione SpatialGraphToLineSet per creare una linea set. Dividere la linea impostata nel suoi singoli sottosegmenti manualmente scegliendo i singoli sottosegmenti con il cursore e cliccando su "split". Questo passaggio è fondamentale al fine di calcolare i volumi dei singoli sottosegmenti.
  6. Utilizzare la funzione LineSetToSpatialGraph per creare un grafico spaziale nuovamente.
  7. Utilizzare la funzione SpatialGraphStatistics per determinare la lunghezza, volume e diametro di ogni sottosegmento. Per la visualizzazione con codice colore che rappresenta il corso del diametro del vaso, utilizzare la funzione SpatialGraphView. Impostare il segmento di colorazione a "spessore", che correla con il diametro del vaso. È importante scegliere la stessa mappa di colore per tutti i set di dati appartenenti alla serie sperimentale.
  8. Aggiungere le lunghezze dei sottosegmenti per determinare quali i sottosegmenti devono essere inclusi nell'analisi ulteriore. Nel presente studio abbiamo valutato un segmento di vaso composto da 1 mm dell'arteria carotica interna prossimale della carotide T e 2,5 mm dell'arteria cerebrale centrale distale della carotide T. Quindi aggiungere i volumi per determinare il volume del vaso del segmento nave stabilita.

Risultati

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Ricostruzione virtuale dell'albero vascolare intracranica 3-dimensionale

Gli alberi vascolari intracranici 3-dimensionale ricostruiti fornito un'altamente accurata anatomia vascolare (Figura 1). Per valutare la precisione, abbiamo effettuato un confronto basato sul diametro tra diametri di nave determinati microscopicamente e dalle ricostruzioni virtuali 3-dimensionale a 2 punti anatomicamente definiti (1: sinistra arteria cerebrale media (MCA) 1 mm distale della carotide T; 2: destra MCA 1 mm distale della carotide T). Determinazione microscopica dei diametri di nave, è stata utilizzata una fotocamera ad alta risoluzione (Infinity X-21, Deltapix) con DeltaPix Insight software versione 2.0.1 calibrata per una scala micrometrica. Per questa valutazione, sono stati analizzati 10 campioni di cervello (5 SAH, sham 5). Questi erano da una serie di 12 topi, in 7 di cui è stata indotta un' SAH, mentre 5 ha subito la chirurgia di sham (2 animali del gruppo di SAH morto giorni postoperatori 1 e 2, rispettivamente). Non c'erano differenze significative tra i diametri determinati microscopicamente e virtualmente, che indica un'accurata ricostruzione virtuale dell'anatomia vascolare intracranica (Determinazione microscopica vs ricostruzione virtuale, Media ± errore standard: lasciato MCA 150 ± 9 µm vs sinistra MCA 150 ± 8 µm; MCA 153 ± 8 µm vs154 ± 9 µm a destra, Vedi Figura 2).

Quantificazione di vasospasm cerebrale in topi con SAH

Per quantificare il vasospasmo cerebrale, sono stati (i) il volume di un segmento di vaso predefiniti rappresentante 3,5 mm, che consiste dell'arteria carotica interna (AIC) di 1 mm e 2,5 mm MCA sulla sinistra e (ii) la nave diametri a 2 punti anatomicamente definiti (MCA di sinistra e destra) determinati nei campioni di cervello dal SAH e animali falsità-azionati (n = 5). Il volume del vaso era significativamente più basso in SAH rispetto al sham (36 ± 4 nL vs 71 ± 9 nL, p < 0,05). Diametri di nave erano più bassi in SAH rispetto al sham (lasciato MCA: 140 µm ± 11 vs 160 ± 10 µm, p = 0.11; destra MCA: 130 ± 16 µm vs 158 ± 13 µm, p < 0.05; vedere la Figura 3), mentre il livello di significatività è stato raggiunto solo per analys è del MCA giusto.

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Figura 1. Ricostruzione virtuale dell'albero vascolare intracranica. (A) Mostra un campione rappresentativo del cervello; (B) Mostra il corrispondente praticamente ricostruito l'albero vascolare. (C) diversi colori visualizzazione del diametro di sinistra MCA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2 . Accuratezza della ricostruzione digitale del vasculature. Diametri medi misurati dai campioni di cervello ricostruito 3D rispetto a quelli determinati microscopicamente. I dati vengono visualizzati come media ± errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3 . Volume del serbatoio e diametro del vaso dopo SAH. (A) misurati confronto di MCA diametri da 3D ricostruito sistema vascolare in SAH e sham topi. Volume del serbatoio (B) in SAH e sham topi. I dati vengono visualizzati come media ± errore standard della media. p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Modelli murini di SAH sono uno strumento importante per la ricerca di base SAH. Vasospasm cerebrale è usato frequentemente come un endpoint negli studi sperimentali che studiano i meccanismi che conducono alla DCI dopo SAH9,11. Tuttavia, la quantificazione di vasospasm cerebrale in topi o altri piccoli modelli animali di SAH sono impegnativi. Comunemente, vasospasmo è quantificato tramite ex vivo determinazione dei diametri di nave in punti definiti anatomiche dopo aspersione endovascular e colata7,9,12 o tramite determinazione della circonferenza delle navi definite su istologico sezioni10,11. Tuttavia, questi metodi presentano alcuni svantaggi: Vasospasm viene valutato solo in determinati punti anatomici; vasospasmo delle vicine segmenti vascolari può fuoriuscire la valutazione. Reperti istologici presentano un'altra fonte di errori. Inoltre, la valutazione può essere piuttosto soggettiva, perché la posizione esatta dove viene misurato il diametro del vaso è determinata dallo sperimentatore.

L'obiettivo era pertanto di stabilire un metodo che quantifica il vasospasm cerebrale calcolando il volume del vaso di segmenti di intero vaso cerebrale da formazione immagine a sezione trasversale dati7. Il vantaggio più importante del metodo volumetrico qui presentato è quella intera imbarcazione segmenti possono essere esaminati. Questo evita la necessità della definizione di un punto dove si misura il diametro del vaso. Un ulteriore vantaggio della valutazione di segmenti vascolari intero è che presumibilmente presenta un parametro più oggettivo per quantificare il vasospasmo di determinazione dei diametri di nave in determinati punti dove può fuoriuscire del vasospasmo della nave più prossimale o distale valutazione. Rappresentazione digitale dei diametri vaso utilizzando un codice di colori consente una stima intuitiva del grado di vasospasmo. Inoltre, la valutazione volumetrica conduce a più grandi differenze fra vasi angiospastiche rispetto alla valutazione dei diametri vaso come mostrato nei risultati rappresentativi. La ricostruzione virtuale ottenuta con il metodo presentato qui rispecchia fedelmente l'anatomia vascolare. Ciò è dimostrato dalla valutazione della serie rappresentativa, in cui la nave diametri misurato microscopicamente e dalle ricostruzioni digitali erano simili, che riproduce le osservazioni di un precedente studio7. Tuttavia, nonostante i suoi vantaggi, ulteriori studi sono necessari per valutare o meno il metodo presentato qui è superiore ai convenzionali metodi di analisi di vasospasmo.

Una limitazione del metodo presentato qui è che essa offre più tempo rispetto all'analisi microscopica di campioni di cervello fuso o analisi istologica (micro CT scansione tempo 90 minuti per campione di cervello, elaborazione dati 45 min per campione del cervello). Inoltre, la disponibilità di micro scanner CT può limitarne l'applicazione. Il numero di animali esaminati qui era sufficiente a dimostrare la fattibilità del protocollo descritto in questo manoscritto. Tuttavia, se il protocollo deve essere utilizzato negli studi di trattamento, animale numeri avrebbe dovuto essere calcolato basato sugli effetti attesi sul vaso volumi e diametri. Un'altra limitazione di questo e altri studi utilizzando modelli murini di SAH è che il vasospasm è determinato ex vivo. Questo rende impossibile di studi longitudinali che indagano i valori basali prima di induzione di SAH e vasospasmo in diversi momenti. Anche se gli studi hanno dimostrato che è possibile rappresentare l'anatomia di grandi vasi intracranici di topi in vivo mediante risonanza magnetica tomografia18, angiografia di tomografia computata19o sottrazione digitale L'angiografia20, questi metodi, a nostra conoscenza, non sono ancora stati utilizzati per analizzare vasospasm cerebrale in murino SAH modelli in vivo. Della nota, la ricostruzione digitale del vasculature cerebrale con successiva valutazione volumetrica di vasospasm cerebrale qui presentato non è limitata all'uso su ex vivo micro CT dati. Se alta risoluzione vascolare croce componibile imaging cerebrale in topi dovrebbe diventare disponibile in futuro, potrebbe essere utilizzato per eseguire un'analisi volumetrica del vasospasmo in vivo.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Parti di questo studio sono parte della tesi dottorale di T. Pantel, presentata alla facoltà di medicina dell'Università Johannes-Gutenberg di Magonza. Lo studio è stato sostenuto dalla Stiftung Friedhelm libera e la Stiftung Neurochirurgische Forschung (sovvenzioni di A.N.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Medetomidina Pfizer, Karlsruhe, Germanian.a.Midazolam
Ratiopharm, Ulm, Germanian.a.Fentanyl
 Curamed, Karlsruhe, Germanian.a.Venofix
21GB Braun Melsungen AG, Melsungen, Germaniacannula n.a.21G 
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato contenente MgCl2 e CaCl2, pH 7,4 Sigma-Aldrich, Amburgo, GermaniaD8662 
Soluzione di paraformaldeide al 4% Sigma-Aldrich, Amburgo, Germania100496
Microfil MV-122 Flowtech Inc., Carver, MA, USAn.a.Sistemaradiopaco
Y.FoxYxlon, Garbsen, Germanian.a.Reconstruction
Studio versione software 1.2.8.1TeraRecon, Francoforte sul Meno, Germanian.a.Softwarericostruzione
Amira software versione 5.4.2 FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USAn.a.Softwarevisualizzazione
PHD ultra pompa a siringaHarvard Apparatus70-3Pinza anatomica a pressione controllata
della pompa (smussata)B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germania160323_v 
Infinity X-21Deltapix, Maalov, Danimarcan.a.fotocameraad alta risoluzione
DeltaPix Insight versione software 2.0.1Deltapix, Maalov, Danimarcan.a.C57BL6
mouseCharles River, Colonia, Germania
Micro-CT di di

Riferimenti

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