Descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale, seguite dal sequenziamento di RNA di cella singola. Questo metodo consente analisi dello sviluppo del pancreas endocrino lignaggio, eterogeneità e trascrittomica dinamiche di cella.
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Articolo metodologico
Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule endocrine del pancreas, che sono raggruppate in isolotti, regolano la stabilità di glucosio nel sangue e il metabolismo energetico. I tipi distinti delle cellule in isolotti, tra cui insulina-secrezione delle cellule β, sono differenziati da progenitori endocrini comuni durante la fase embrionale. Le cellule endocrine immature espandere tramite proliferazione delle cellule e maturare durante un periodo di sviluppo lungo postnatale. Tuttavia, i meccanismi alla base di questi processi non sono chiaramente definiti. Cella singola RNA-sequenziamento è un approccio promettente per la caratterizzazione di popolazioni distinte delle cellule e l'analisi delle cellule lignaggio differenziazione pathways. Qui, descriviamo un metodo per il cella singola RNA-sequenziamento delle cellule β del pancreas isolato dal pancreas embrionale, neonatale e postnatale.
Introduzione
Il pancreas è un organo metabolico vitale nei mammiferi. Il pancreas è costituito da scomparti endocrini ed esocrini. Le cellule endocrine del pancreas, tra cui cellule β che producono insulina e glucagone-producendo le cellule α, raggruppare in cluster degli isolotti di Langerhans e coordinatamente regolano l'omeostasi del glucosio sistemico. Disfunzione delle cellule endocrine si traduce in diabete mellito, che è diventato un problema importante di sanità pubblica in tutto il mondo.
Le cellule endocrine del pancreas sono derivate da Ngn3+ progenitori durante l'embriogenesi1. Più tardi, durante il periodo....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Pechino.
1. pancreas isolamento
-
Per gli embrioni E17.5 (giorno embrionale 17,5):
- Stimare il giorno embrionale 0,5 in base al punto di tempo quando viene visualizzato il plug vaginale.
- Sacrificare i topi incinto di somministrazione di CO2 . Spruzzare la pelliccia addominale con alcool al 70%.
- Praticare un'incisione a forma di V con le forbici dalla zona genitale che si estende alle costole. Questo processo viene aperto completamente la cavità addomina....
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Risultati
Pancreas sono stati sezionati da topi embrionali, neonatali e postnatali (Figura 2A e 2B). Per topi oltre postnatale giorno 18 anni di età, l'effetto digestivo dipende dal grado di aspersione; di conseguenza, l'iniezione è il passo più importante per l'isolamento dell'isolotto (Figura 2-2E e tabella 6). Come era possibile riempire il pancreas durante questo pass.......
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Discussione
In questo protocollo, abbiamo dimostrato un metodo efficace e facile da usare per studiare i profili di espressione di singole cellule delle cellule β del pancreas. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per isolare le cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale e per eseguire analisi trascrittomica unicellulare.
Il punto più critico è l'isolamento di cellule β singolo in buone condizioni. Pancreas completamente irrorato rispondono meglio alla successiva digestione. Insu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il centro nazionale per Protein Sciences, Beijing (Peking University) e il centro di Tsinghua di Pechino per la piattaforma di Computing di Life Science. Questo lavoro è stato supportato dal Ministero della scienza e tecnologia della Cina (2015CB942800), National Foundation Natural Science of China (31521004, 31471358 e 31522036) e finanziamenti da Tsinghua di Pechino centro per le scienze della vita a C.-chrysantha
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Collagenasi P | Roche | 11213873001 | |
| Tripsina-EDTA (0,25 %), rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Pinze | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Pinze | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Ago 1/2" Lunghezza | BD | 305106 | |
| Stereomicroscopio | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereomicroscopio a fluorescenza | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5424R | |
| Polistirene Tubo a fondo tondo con tappo per filtro cellulare | BD-Falcon | 352235 | |
| Micropiastra PCR a 96 pozzetti | Axygen | PCR-96-C | |
| Tappetino sigillante in silicone | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Provetta per PCR a pozzetti sottili | Extragene | P-02X8-CF | |
| Selezionatore cellulare | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Pipetta capillare | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Acqua distillata | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Inibitore della RNasi ricombinante | Takara | 2313 | |
| Trascrittasi inversa Superscript II | Invitrogen | 18064-014 | |
| Tampone primo filamento (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaina | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Acqua priva di nucleasi | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads Perline XP | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit di preparazione V2 per Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| Kit indice TruePrep V3 per Illumina | Vazyme | TD203 | N6XX e 24 N8XX |
| Tecnologie analitiche avanzate | DNF-474 | ||
| 1x HBSS senza Ca2+ e Mg2+ | 138 mM di NaCl; 5,34 mM KCl 4,17 mM NaHCO3; 0,34 mM Na2HPO4 0,44 mM KH2PO4 | ||
| Buffer | 1 &volte; HBSS contenente 10 mM di HEPES, 1 mM di MgCl2, 5 mM di glucosio, pH 7,4 | ||
| tampone | 1 & HBSS contenente 15 mM HEPES, 5,6 mM di glucosio, 1% FBS, pH 7,4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO | ||
| 5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR | |||
| inneschi | 5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Innesco | 5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Innesco | 5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Primer | 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Primer | 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3' |
Riferimenti
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the....
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Ristampe e permessi
