Articolo metodologico

Rapido, sicuro e semplice manuale sul comodino estrazione dell'acido nucleico per la rilevazione del Virus in campioni di sangue intero

DOI:

10.3791/58001

⸱

30 giugno 2018

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1Virus Research & Development Laboratory, Statens Serum Institut, 2Infectious Disease Research Unit, University of Southern Denmark

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per l'estrazione dell'acido nucleico rapido virus dal sangue intero virus-inattivato. L'estrazione viene eseguita direttamente nei tubi di raccolta sangue e non richiede attrezzature o elettricità. Il metodo non è dipendente da strutture di laboratorio e può essere utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo).

Abstract

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La diagnosi rapida di un'infezione è essenziale per la gestione di scoppio, contenimento del rischio e cura del paziente. Precedentemente abbiamo indicato un metodo per la rapida comodino inattivazione del virus dell'Ebola durante il prelievo di sangue per i test di sicurezza dell'acido nucleico (NA) con l'aggiunta di un buffer di lisi/associazione commerciale direttamente nei tubi di raccolta del sangue di vuoto. Utilizzando questo approccio di inattivazione comodino, abbiamo sviluppato un sicuro, rapido e semplificato sul comodino NA metodo di estrazione per il successivo rilevamento di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. L'estrazione di NA avviene direttamente nei tubi di raccolta sangue e non richiede alcuna attrezzatura o elettricità.

Dopo il sangue viene raccolto nel buffer di lisi/associazione, i contenuti sono mescolati girando a mano il tubo e la miscela viene incubata per 20 min a temperatura ambiente. Particelle di vetro magnetico (MGPs) vengono aggiunti al tubo, e il contenuto è mescolato girando a mano il tubo di raccolta. I pop sono poi raccolti sul lato del tubo di raccolta sangue usando un supporto magnetico o un magnete e un elastico. Il MGPs vengono lavati tre volte, e dopo l'aggiunta di tampone di eluizione direttamente nel tubo di raccolta, il NAs è pronto per i test di NA, quali qPCR o amplificazione isotermica loop (lampada), senza la rimozione di MGPs dalla reazione. Il metodo di estrazione NA non è dipendente da qualsiasi strutture di laboratorio e può essere facilmente utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo e reparti ospedalieri isolamento). Quando questo metodo di estrazione del NA è combinato con la lampada e uno strumento portatile, una diagnosi può essere ottenuta entro 40 min della raccolta sangue.

Introduzione

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In epidemie di virus, quando i pazienti sono limitati per i reparti di isolamento dell'ospedale o quando è necessaria una diagnosi veloce, sicura, semplice ed accurata diagnosi molecolare point-of-care è di importanza fondamentale per il contenimento di cura e rischio paziente. I due recenti focolai virali, del virus dell'Ebola (EBOV) in Africa occidentale (2013) e il virus di Zika in Sud America (2015), hanno aumentato l'interesse per migliorato point-of-care test diagnostici molecolari, come ad esempio isotermica mediata da loop trascrizione inversa amplificazione (RT-LAMP)1,2 e ricombinasi polimerasi amplificazione (RPA)3,4. RPA e RT-lampada sono rapidi, sensibili e specifici test molecolari che possono essere eseguite sui preparativi di esempio semplificato. Per il virus di Zika, RT-LAMP è stato combinato con un'analisi di flusso laterale (LFA), in grado di rilevare virus di Zika in campioni di sangue intero di non purificate entro 30 min1; Tuttavia, per EBOV, che è classificato come agente patogeno del gruppo 4 di rischio ed è altamente contagiosa, i campioni devono essere gestite sotto biosicurezza 4 (BSL-4) condizioni di livello e inattivati prima di possono eseguire qualsiasi sicuro procedure diagnostiche.

Metodi di inattivazione semplificata per EBOV, come l'aggiunta di buffer di lisi per il campione2,3,4,5, sono stati usati durante lo scoppio; Tuttavia, questi metodi richiedono una gestione in condizioni di BSL-4 con apparecchiature di laboratorio, quali biosicurezza BSL-3, centrifughe, blocchi di riscaldamento e pipette, come minimo. Questa apparecchiatura normalmente non è presente nei reparti di isolamento o in ospedali da campo. Per superare questa sfida, sono stati tentativi di eseguire la diagnostica in valigie3, e diversi dispositivi portatili e le macchine sono state sviluppate [ad esempio, un dispositivo portatile per estrazione di acidi nucleici (NA)]6. Tuttavia, i campioni positivi EBOV devono ancora essere inattivati prima che questi dispositivi possono essere utilizzati.

Precedentemente abbiamo segnalato un metodo di inattivazione rapida virus sul comodino per il EBOV7e la Vaccinia virus del Cowpox virus8 tramite l'aggiunta di un buffer di lisi/associazione commerciale in provette di raccolta del sangue di vuoto ordinario, consentendo per la diretta trasferimento di sangue dal paziente nel buffer inattivazione7. Questa inattivazione diretta e immediata in un sistema chiuso Elimina la necessità di gestire i campioni utilizzando qualsiasi contenimento rigoroso, ad esempio BSL-4 condizioni7, e i campioni possono essere gestiti in condizioni normali di BSL-2. Questo metodo di inattivazione è compatibile con diversi sistemi di estrazione di NA, come robot e mano purificazione Kit7; Tuttavia, questi metodi richiedono apparecchiature di laboratorio, come robot, centrifughe e l'elettricità, che non sono sempre presenti nel campo impostazioni o all'interno di reparti ospedalieri isolamento.

In questo rapporto, descriviamo un sicuro, rapido e semplificato NA estrazione metodo manuale per la successiva rilevazione molecolare di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. Il metodo di estrazione NA non richiede attrezzature diverse da un supporto magnetico/magnetico. Nessun centrifughe, riscaldamento isolati, o energia elettrica sono necessari per l'estrazione di NA. Quindi, questo metodo non è dipendente da strutture di laboratorio e può essere facilmente utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo, in reparti ospedalieri di isolamento o con impostazioni di risorse limitate). Il metodo di estrazione del NA è rapida e semplice e può essere utilizzato direttamente in qualsiasi test NA a valle, quali qPCR, RT-qPCR, lampada o RT-LAMP. Quando questo metodo di estrazione del NA è combinato con uno strumento portatile a batteria isotermico e lampada, una comodino diagnosi possono essere ottenuta in 40 min della raccolta sangue.

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Protocollo

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Il Comitato etica della ricerca biomedica, regione della capitale ha dato il consenso informato, e tutti i metodi descritti qui sono stati esentati da una recensione del sistema del comitato etico, in conformità con la legge danese sui progetti di sviluppo di analisi.

1. preparazione di provette sottovuoto per inattivazione di Virus e NA rapida estrazione

Attenzione: Il buffer utilizzato per questo protocollo contiene tiocianato di guanidinium (GITC) e un tensioattivo non ionico, che sono irritanti. Misure di sicurezza di laboratorio appropriati, utilizzare una cappa a flusso e indossare guanti durante la manipolazione di esso. Evitare qualsiasi contatto pelle e occhi. Se il buffer è stato versato, la superficie contaminata non dovrà essere disinfettata mai direttamente con cloramina o ipoclorito di sodio (i principi attivi in "bleach") perché questa miscela può condurre alla formazione di cianuro tossico. In primo luogo, pulire il buffer versato con il tessuto assorbente. Successivamente, pulire la superficie con etanolo al 70% e poi con acqua e infine, utilizzare cloramina o ipoclorito di sodio.

  1. Per preparare i tubi a vuoto raccolta sangue, iniettare 1.6 mL di buffer di lisi commerciale specifico in un tubo a vuoto EDTA 4 mL perforando il coperchio del tubo usando un ago 25 x 1 e una siringa da 3 mL.
    Nota: Non rimuovere il coperchio del tubo a vuoto. Il vuoto deve essere mantenuto.
  2. Conservare i tubi a vuoto contenente il tampone a temperatura ambiente fino all'utilizzo.
    Nota: I tubi sono stabili per almeno 1 anno dopo la loro preparazione.

2. preparazione del buffer per l'estrazione di NA

  1. Per preparare i buffer per un'estrazione di NA, posizionare due 1.8 mL, due 4.5 mL e un 3,6 mL tubi in un rack.
  2. Aggiungere, pipettando, 960 µ l di particelle di vetro magnetico (pop) a un tubo pulito 1,8 mL e un'etichetta con MGPs. Risospendere la sospensione MGP completamente prima di esso il pipettaggio.
    Nota: Il MGPs tendono a raccogliere rapidamente nella parte inferiore del tubo.
  3. Aggiungere, pipettando, 4 mL di tampone di lavaggio sono in una provetta pulita 4,5 mL ed etichettarlo come WB-1.
    Attenzione: Il tampone di lavaggio I contiene cloruro di guanidinio, che è irritante. Misure di sicurezza di laboratorio appropriati, utilizzare una cappa a flusso e indossare guanti durante la manipolazione di esso. Evitare qualsiasi contatto pelle e occhi.
  4. Aggiungi, pipettando, 1,5 mL di tampone di lavaggio II in una provetta pulita 3,6 mL ed etichettarlo come WB-2.
  5. Aggiungere, pipettando, 3 mL di tampone di lavaggio III in una provetta pulita 4,5 mL ed etichettarlo come WB-3.
  6. Aggiungi, pipettando, 100 µ l di tampone di eluizione in una provetta pulita 1,8 mL ed etichettarlo come EB.
  7. Memorizzare i buffer aliquotati a temperatura ambiente fino all'utilizzo.
    Nota: I tubi sono stabili per almeno 1 mese dopo la loro preparazione.

3. sangue raccolta dai pazienti con segni e sintomi di un'infezione da Virus

Attenzione: Prendere misure di sicurezza di laboratorio appropriati durante la raccolta di sangue intero dal paziente. Indossare guanti e occhiali. Se il paziente è in isolamento, si prega di seguire le procedure di livello 4 di biosafety.

  1. Per raccogliere endovenosa intero sangue dal paziente, utilizzare un ago a farfalla con tubo di prolunga di piccolo calibro e una vuoto provetta contenente un tampone di lisi/associazione. Appoggiare il braccio del paziente in una posizione verso il basso e posizionare il tubo di raccolta inferiore l'ago a farfalla. Inserire l'ago a farfalla nella vena del paziente e fissare il tubo di vuoto di sangue insieme all'estensione di piccolo calibro.
    Nota: Questo impedirà il riflusso.
  2. Dopo la raccolta del sangue, mescolare il contenuto del tubo girando il tubo 5 - 10 volte.
    Nota: A causa del vuoto restante nel tubo di raccolta sangue contenente 1,6 mL di tampone di lisi/associazione, il volume del campione raccolto sarà automaticamente 1,6 mL.
  3. Disinfettare la parte esterna del tubo utilizzando etanolo al 70%.
  4. Incubare le provette per 20 min a temperatura ambiente.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e i tubi di raccolta sangue intero possono essere conservati a-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C o 37 ° C per almeno 1 mese7.
  5. Continuare direttamente per il metodo di estrazione NA semplificato.

4. semplificato NA estrazione del sangue intero

  1. Per purificare NA dal Lisi/associazione buffer-inattivato sangue prelevato, miscela il contenuto della provetta lanciando il vuoto tubo a mano 5-10 volte.
  2. Rimuovere con cautela il coperchio del tubo e il coperchio di scarico.
  3. Versare il preparato aliquota di MGPs (1 mL) direttamente nel tubo di raccolta sangue.
  4. Posto un nuovo coperchio da un tubo di raccolta sangue inutilizzati nella provetta contenente il campione.
  5. Appoggiare un dito sul coperchio per garantire che il tubo sia ben chiuso e mescolare il contenuto del tubo girando il tubo di raccolta sangue a mano 5 - 10 volte.
  6. Posizionare il tubo nel supporto magnetico e tieni un dito sul coperchio per garantire che il tubo sia ben chiuso.
  7. Capovolgere il supporto magnetico con il tubo di un paio di volte di mano per assicurarsi che tutti i pop sono raccolti sul lato del tubo con il magnete.
    Nota: Il supporto magnetico può essere sostituito con un magnete di forma allungato e un elastico.
  8. Rimuovere il coperchio del tubo ed eliminare il contenuto della provetta utilizzando una pipetta monouso o semplicemente versando il contenuto in un tubo di raccolta da 50 mL.
    Nota: Evitare di aerosol dal tubo 50 mL collezione chiudendo il tubo con un coperchio.
  9. Versare il preparato aliquota di WB-1 (4 mL) direttamente nel tubo di raccolta di sangue.
  10. Mettere il coperchio sul tubo e posizionare un dito sul coperchio per garantire che il tubo sia ben chiuso.
  11. Rimuovere il tubo dal supporto magnetico, tenere il coperchio ben serrato con un dito.
    Nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, semplicemente rimuovere il magnete e la banda di gomma dal tubo.
  12. Risospendere il MGPs girando il tubo di raccolta sangue a mano 5 - 10 volte.
  13. Ripetere i passaggi da 4.6-4.8.
  14. Versare il preparato aliquota di WB-2 (1,5 mL) direttamente nel tubo di raccolta di sangue.
  15. Mettere il coperchio sul tubo e rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
    Nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, semplicemente rimuovere il magnete e la banda di gomma dal tubo.
  16. Appoggiare un dito sul coperchio per garantire che il tubo sia ben chiuso.
  17. Risospendere il MGPs girando a mano il tubo di raccolta sangue per pochi secondi.
  18. Ripetere il passaggio 4.6-4.8.
  19. Versare il preparato aliquota di WB-3 (3 mL) direttamente nel tubo di raccolta di sangue.
  20. Mettere il coperchio sul tubo e rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
    Nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, semplicemente rimuovere il magnete e la banda di gomma dal tubo.
  21. Appoggiare un dito sul coperchio per garantire che il tubo sia ben chiuso.
  22. Risospendere il MGPs girando il tubo di raccolta sangue a mano 5 - 10 volte.
  23. Ripetere i passaggi da 4.6-4.8.
  24. Versare il preparato aliquota di EB (100 µ l) direttamente nel tubo di raccolta di sangue.
  25. Mettere il coperchio sul tubo e rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
    Nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, semplicemente rimuovere il magnete e la banda di gomma dal tubo.
  26. Risospendere il pop in EB toccando il tubo di raccolta sangue 5 - 10 volte con un dito.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui, e i tubi possono essere conservati a-20 ° C.
  27. Trasferire una goccia (5-8 µ l) del sedimento MGPs alla miscela di reazione di amplificazione NA a valle utilizzando una pipetta monouso 1,5 mL (qualsiasi amplificazione di NA diagnostica a Valle saggio come lampada/RT-LAMP o saggi qPCR/RT-qPCR possono essere utilizzati).
    Nota: Il NAs verrà stick per il pop, quindi assicuratevi di utilizzare il MGPs nella reazione di amplificazione NA a valle. Mescolare la sospensione MGP prima dell'uso. Dopo la miscelazione, il MGPs raccoglierà nella parte inferiore del tubo.

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Risultati

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Il protocollo presentato qui è semplice ed efficace e può essere ampiamente applicato a qualsiasi analisi molecolare deve essere eseguita su campioni di sangue intero infettiva inattivati con il buffer di lisi/associazione. Il flusso di lavoro per l'inattivazione di sangue e l'estrazione di NA è illustrato nella Figura 1, compresa la preparazione di sangue raccolta tubi a vuoto7 (Figura 1A), la raccolta di...

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Discussione

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In questo rapporto, descriviamo un sicuro, rapido e semplice manuale sul comodino NA metodo di estrazione per la rilevazione molecolare a valle di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. Il metodo di estrazione NA descritto è stato sviluppato per essere eseguito direttamente su campioni di sangue intero raccolti in provette sottovuoto contenente la lisi/binding buffer (Tabella materiali)7. Questo buffer specifico inattiva EBOV7...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Susanne Lopes Rasmussen e Solvej Kolbjørn Jensen per la loro assistenza tecnica e per la gestione dei campioni clinici. Questo progetto fa parte del Consorzio EbolaMoDRAD, che ha fruito di un finanziamento innovativo medicina iniziativa 2 impresa comune sotto concessione contratto N ° 115843. Questa impresa comune riceve supporto da EFPIA e programma di innovazione e ricerca Orizzonte 2020 dell'Unione europea.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette Vacutainer K2 EDTA (4 mL)Becton Dickinson368861
Plus Prelievo di sangueBecton Dickinson362725
23G x 1 agoBecton Dickinson300800
SIRINGA LUER LOK (3 mL)Becton Dickinson309658
Ago a farfalla con tubo di prolunga di piccolo diametroJø rgen Kruuse A/S121714
1% VirkonNomeco A/S849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lisi/Tampone legante - RicaricaRoche Diagnostics A/S03246752001
MagNA Pure LC Kit di isolamento dell'acido nucleico totaleRoche Diagnostics A/S3038505001
Nunc™ Provette criogeniche per biobanche e colture cellulari (1,8 mL)Thermo Fisher Scientific375418
Nunc™ Provette criogeniche per biobanche e colture cellulari (3,6 mL)Thermo Fisher Scientific379189
Nunc™ Provette criogeniche per biobanche e colture cellulari (4,5 mL)Thermo Fisher Scientific379146
DynaMag™-5 MagnetThermo Fisher Scientific12303D
Pipetta di trasferimento (3,5 mL)Sarstedt86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco&commercio; Pipette per trasferimento puntali fini (1,5 mL)Thermo Fisher Scientific231
Thermo Scientific™ Nunc&commercio; Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene da 50 mlThermo Fisher Scientific339652

Riferimenti

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