Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Sommario

Zebrafish sono stati usati come organismi modello genetico affidabile nella ricerca biomedica, soprattutto con l'avvento delle tecnologie di modifica del gene. Quando sono previsti fenotipi larvali, identificazione di estrazione ed il genotipo di DNA può essere impegnativo. Qui, descriviamo una procedura efficiente genotipizzazione per larve di zebrafish, coda di ritaglio, più presto 72 h post-fertilizzazione.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) possiedono ortologhi per l'84% dei geni conosciuti per essere associati con malattie umane. Inoltre, questi animali hanno un tempo di generazione breve, sono facili da gestire, visualizzare un alto tasso riproduttivo, basso costo e sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche di microiniezione di DNA negli embrioni. Gli avanzamenti recenti nel gene strumenti di editing consentono precisa introduzione di mutazioni e transgeni in zebrafish. Malattia di modellazione in zebrafish spesso porta a fenotipi larvali e morte precoce, che può essere difficile da interpretare se genotipi sono sconosciuti. Questa identificazione precoce dei genotipi è anche necessario negli esperimenti che richiedono la messa in comune di campione, come studi di gene expression o massa spettrometria. Tuttavia, vasta selezione genotipica è limitata dai metodi tradizionali, che nella maggior parte dei laboratori vengono eseguite solo su zebrafish adulto o nelle larve post mortem. Abbiamo affrontato questo problema adattando un metodo per l'isolamento di DNA genomic di PCR-pronto da larve di zebrafish live che può essere raggiunta anche prima, come la post-fecondazione 72h (hpf). Questo tempo e tecnica economica, migliorato da un protocollo di genotipizzazione precedentemente pubblicati, permette l'identificazione di genotipi da biopsie di pinna al microscopio. Le pinne rigenerano rapidamente come si sviluppano le larve. I ricercatori sono quindi in grado di selezionare e raccogliere i genotipi desiderati all'età adulta utilizzando questa procedura basata sulla PCR genotyping di alto-rendimento.

Introduzione

Il danio zebrato (Danio rerio) è un organismo vertebrato ampiamente utilizzato come modello per le indagini di malattia anche per quanto riguarda il test preclinici di ipotesi terapeutiche^1,2,3. Questi animali hanno un tempo di generazione breve, sono facili da gestire, visualizzare un alto tasso riproduttivo, basso costo e sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche di microiniezione di DNA in embrioni⁴. Attraverso il crescente sviluppo del romanzo transgenico e gene editing tecnologie quali Zinc-Finger nucleasi (ZFN)⁵, TAL-come effettore nucleasi (TALENs)^6,7e il cluster regolarmente intervallate breve Palindromo si ripete (CRISPR) / CRISPR-collegata 9 (Cas9) sistema⁸, zebrafish è pronta a migliorare sostanzialmente la comprensione delle diverse condizioni patologiche. Queste tecnologie sono state utilizzate per creare forature mirate in entrambi somatiche e cellule germinali in zebrafish, efficientemente nascimenti geneticamente modificati animali⁸. Esempi recenti nella letteratura includono lo sviluppo positivo di modelli genetici di epilessia e disturbi metabolici in zebrafish^3,9,10,11,12 .

Con i progressi compiuti in zebrafish editing genomico, rapida e affidabile la genotipizzazione è diventato un innegabile punto dilimitazione. Identificazione delle specifiche mutazioni del DNA adiacente al luogo di destinazione prevista modifica del genoma è una fase essenziale del protocollo. Tradizionalmente, tecniche di genotipizzazione di ritaglio pinna sono di solito solo eseguita in zebrafish giovanile o adulta. Tuttavia, il tempo speso zebrafish sensibilizzazione all'età adulta (> 2 mesi) ritarda considerevolmente gli avanzamenti nella ricerca. In molti casi, l'età adulta non può essere realizzato a causa il Ko di geni essenziali (ad es., nella modellazione di malattia) o mutazioni con guadagno di funzione che conduce agli effetti nocivi fenotipici. Inoltre, diversi saggi richiedono la messa in comune delle larve, come estrazione RNA o metabolita e coinvolgono così l'identificazione preventiva dei genotipi, che può essere difficile quando sono disponibili solo post hoc, tecniche di genotipizzazione. Questi esempi di cui sopra evidenziano l'importanza delle tecniche di genotipizzazione larvale allo stesso tempo preciso e consentono il recupero completo e normale sviluppo delle larve. Genotipizzazione di zebrafish fase precoce non sembra attualmente essere ampiamente usato; Questo si riflette da recenti pubblicazioni dei modelli di malattia in cui larvali genotipi sono identificati tramite post mortem genotipizzazione anziché genotipizzazione prima dell'esecuzione dell'esperimento^12,13,14. In questa carta, una strategia di clip pinna larvale è presentata con l'obiettivo di migliorare le procedure di genotipizzazione precedentemente stabilito.

In passato, strategie che impiegano la digestione della proteinasi K a genotipo live zebrafish larve hanno portato alla variabile della polimerasi reazione a catena (PCR) efficienza¹⁵. Anche se più recentemente pubblicato tecnica di biopsia della coda al microscopio fornito più promettenti risultati¹⁶, noi e altri gruppi non erano in grado di riprodurre l'alta efficienza e recupero di DNA segnalati dagli autori. Una grave battuta d'arresto del protocollo descritto da Wilkinson et al. ¹⁶ potrebbe essere il trasferimento del tessuto coda nella provetta PCR. Grazie alle sue dimensioni microscopiche, è difficile garantire che la pinna è stato correttamente raccolti e dispensata da pipettaggio. Per affrontare questa barriera, abbiamo sviluppato un protocollo migliore per grandi numeri di genotipizzazione di larve di zebrafish live con quasi il 100% di efficienza⁹. Utilizzando un microscalpel, la punta della coda pinna è rimosso e collocata su un pezzo di carta da filtro. Il pezzo di carta da filtro contenente il tessuto può essere visualizzato prontamente e correttamente inserito in un tubo PCR. Estrazione del DNA genomico viene quindi eseguita, seguita dall'amplificazione di PCR della regione di interesse al genotipo del campione. I vantaggi di questo metodo includono un alta efficienza PCR, un basso tasso di falsi positivi e un tasso di mortalità basso. Inoltre, la genotipizzazione di un gran numero di embrioni è possibile utilizzando questo protocollo. Il protocollo descritto nel presente documento consente pinna-ritaglio di centinaia di larve all'interno di 2-3 h utilizzando questo approccio e la corretta identificazione di pesce genotipizzati e rigenerazione di coda entro due giorni.

Protocollo

Le procedure che coinvolge soggetti animali sono stati approvati e sono conformi alle linee guida di cura degli animali fornite dal Consiglio canadese su Animal Care e Università di Ottawa comitati di cura degli animali.

1. preparazione

1. Preparare la superficie di dissezione registrando un coperchio di scatola di Petri di 9 cm con nastro autoclave in tutta la sua superficie interna. Posizionarlo sotto un microscopio stereo.
2. Posizionare la post-fecondazione 3-5 giorni (dpf) larve di zebrafish in un Petri dish e anestetizzare in ˜1.5 mM tricaina nei media di 1 x E3 dell'embrione (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄, pH 7,2).
3. Tagliare l'estremità della punta di una pipetta di P1000 con un paio di forbici o una lama di rasoio per un diametro di 2 mm per accogliere una larva di dpf 3 con minimo sforzo.

2. pinna ritaglio delle larve di Zebrafish

1. Pick up una larva anestetizzata utilizzando la micropipetta P1000 modificata e appoggiare la larva di pesce zebra sul nastro autoclave posizionato sul coperchio scatola di Petri.
2. Rimuovere la soluzione di tricaina in eccesso che circondano la larva utilizzando una micropipetta. La zona dovrebbe essere asciutta come possibile con successo sezione e ritirare la pinna ma ancora bagnato per assicurare la sopravvivenza.
3. Usando un bisturi micro sezione caudale sotto un microscopio stereo come indicato in Figura 1, come descritto in Wilkinson et al.¹⁶. Durante l'incisione, applicare una pressione costante all'interno del sito di gap del pigmento della pinna caudale, distale al limite della circolazione sanguigna (Figura 1A). Applicare una leggera pressione per evitare di danneggiare la notocorda.
4. Visualizzare la pinna sezionata al microscopio e posizionare il pezzo sopra la punta della lama microscalpel (Figura 2A). Posizionare il microscalpel contenente la pinna sulla superficie di un piccolo pezzo di carta da filtro.
   Nota: A causa della presenza dei melanociti nel tessuto transected, questo passaggio permette la visualizzazione della pinna come un piccolo punto nero (Figura 2B).
5. Utilizzando le forbici e pinzette (Figura 2), trasferire la carta da filtro contenente la pinna per una piastra PCR a 96 pozzetti, contenente 25 μL di soluzione di NaOH 50 mM per pozzetto (Figura 2D).
6. Preparare una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto, numerazione il bene secondo l'etichetta della piastra PCR. Con la pipetta di P1000 modificata riempita con 200 µ l di fresco 1 x E3 media di embrione, raccogliere con cura la larva di pesce zebra con una leggera pressione. Dispensare la larva nella piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti, nello stesso numero bene come la piastra PCR (Figura 2E).
7. Assicurarsi che la carta da filtro sia ben immersa nella soluzione (Figura 2F). Pulire la lama del microscapel e pinzette tra ciascuno tagliato per evitare la contaminazione incrociata di immersione in soluzione di 70% EtOH. Pulire la lama con tessuto/salvietta di carta pulita.
8. Ripetere i passaggi 2.1-2.7 tutti gli embrioni sono stati ritagliati.
9. Memorizzare le larve nella piastra a 96 pozzetti a 28 ° C, finché non sono stati identificati i genotipi.
   Nota: I media di embrione non ha bisogno di essere cambiato, poiché il protocollo può essere facilmente completato in meno di 2 giorni. Se è necessario più tempo, è consigliato un cambiamento di media.

3. genomic DNA estrazione

1. Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare i campioni a 1.000 x g per 1 min per assicurarsi che tutti i giornali di filtro sono sommerse all'interno della soluzione di NaOH.
2. Per la lisi del tessuto, riscaldare i campioni in un termociclatore a 95 ° C per 5 min seguita da un raffreddamento a 4 ° C per 10 min.
3. Aggiungere 6 μL di 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 a ciascun campione. Vortice.
4. Centrifugare brevemente la piastra a 1.500 x g, per 5 min a temperatura ambiente.
5. Utilizzare 1,5 μL del surnatante del DNA per reazione di PCR.
6. Preparare una PCR al genotipo le larve, come illustrato nella tabella 1-2.
   Nota: Il presente protocollo è stato testato per due applicazioni: multiplex reazioni di PCR, rivelando il genotipo utilizzando gel di agarosio⁹e dell'eteroduplex fusione assay (HMA) rivelando i genotipi utilizzando gel di poliacrilammide elettroforesi (pagina)¹⁷.

4. alternativa estrazione genomico usando una resina chelante

1. Completare il passaggio 2.5 con l'aggiunta di carta da filtro con la pinna ritagliata a una piastra PCR a 96 pozzetti, contenente 30 μL del 5% chelanti resina (copolimero di stirene-divinilbenzene contenenti ioni iminodiacetate accoppiati).
   Nota: Questo tipo di resina viene comunemente utilizzato per la preparazione di DNA PCR-pronto in un modo veloce ed efficiente¹⁸e lisi del tessuto.
2. Seguire i passaggi 2.6-2.8 come indicato.
3. Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare brevemente i campioni per assicurarsi che tutti i carta da filtro è sommerso all'interno la resina chelante.
4. Per la lisi del tessuto, riscaldare i campioni in un termociclatore a 95 ° C per 15 min, seguito da un raffreddamento a 4 ° C per 10 min.
   Nota: Questo passaggio permette di lisi e successivo legame di perline resina polar a componenti cellulari mentre DNA e RNA rimangono in soluzione.
5. Centrifugare brevemente i campioni per pellet le perle di resina e ottenere il DNA nella sospensione.
6. Seguire i passaggi 3.5-3.6 per completare la procedura di genotipizzazione.

5. applicazione 1: Multiplex PCR seguita da analisi del Gel dell'agarosi

1. Seguendo la tabella 1, impostare una reazione di PCR multiplex per consentire la discriminazione tra mutanti omozigoti, eterozigoti e larve WT. Utilizzare un termociclatore 96 pozzetti per eseguire le reazioni di PCR utilizzando il ciclismo condizioni descritte nella tabella 3.
   Nota: Le reazioni di PCR possono essere eseguite anche in qualsiasi altro cycler termico PCR convenzionale. Questo esempio descrive la strategia PCR utilizzata da Pena, et al. ⁹ per identificare aldh7a1 WT e gli alleli del mutante 5-bp inserimento nella stessa reazione multiplex.
2. Preparare un gel di agarosio 1% in tampone borato di sodio, macchiato con 1 x GelRed.
   Nota: 20x stock tampone borato di sodio è fatto di 40 mL di NaOH 10 M, 1800 mL di ddH₂O, pH regolato a 8.5 con 76 g di acido borico e poi completato a volume finale di 2 L utilizzando ddH₂O.
3. Esegua il gel in tampone borato di sodio 1 x 15 min a 250 V. Per facilitare il processo, se possibile, utilizzare un sistema gel compatibile con pipette multicanale per attivare le funzionalità di throughput superiore riducendo il tempo di caricare i campioni.
4. Il gel sotto la luce ultravioletta (UV) per permettere la distinzione dei diversi genotipi dell'immagine.

6. applicazione 2: Eteroduplex saggio di fusione

1. Preparare la pagina 12% gel utilizzando la piastra distanziatrice di 1,5 mm e i pettini 15-campioni. Preparare due gel di pagina utilizzando 12,21 mL di ddH₂O, 2,52 mL di 10x Tris/Borato/EDTA (TBE), 10 mL di 30% di acrilammide, 250 μL di 10% ammonio persolfato (APS) e 20 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED). Utilizzare 1 x TBE buffer (0,089 M Tris-HCl, acido borico 0,089 M e 0,002 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) come tampone di corsa.
2. Riscaldare i prodotti di PCR a 94 ° C per 5 min.
3. Lasciare raffreddare le provette su ghiaccio o nel termociclatore per 10 min a 4 ° C.
4. Caricare 10 µ l per campione PCR e 8 μL di marker di peso molecolare.
5. Eseguire la pagina a 150 V in 1 x TBE utilizzando un sistema di elettroforesi verticale per 1 h o fino a quando il marcatore di peso molecolare quasi raggiunge la linea del piede della lastra di vetro.
6. Il gel sotto luce UV per permettere la distinzione dei diversi genotipi dell'immagine.

Risultati

L'efficienza del protocollo è stato dimostrato dalla genotipizzazione la prole di una croce eterozigoti (aldh7a1^{+ ot100}, qui indicato come aldh7a1^{+ /-}) (Figura 3A- C)⁹. L'allele del mutante aldh7a1^ot100ha un inserimento 5-base pair (bp) nel primo esone codifica del gene aldh7a1 di zebrafish che conduce a frameshift e perdita di funzio...

Discussione

Gene strumenti di editing sono state impiegate per introdurre precisamente mutazioni e transgeni in zebrafish negli ultimi anni^5,6,7,8. Durante la malattia di modellazione in zebrafish, primi fenotipi larvali o giovanili sono spesso osservati^9,12,13,14. Il protocollo ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di Petri	Corning	430167
Microscalpel	World Precision Instruments	500249
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ1500
Tricaina/Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato	Sigma-Aldrich	E10521
Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti	Costar	3595
PCR a 96 pozzetti piatto	Fisher	14230232
NaOH	Fisher	S25548A
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
NaCl	Fisher	BP358-10
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391
5% Chelex 100 sodico forma	Sigma-Aldrich	C7901
GelRed 1x	Biotium	41003
Acido borico	Sigma-Aldrich	B6768
Sistema Sub-Cell Model 192	Bio-Rad
30 % soluzione di acrilammide/bis, 37,5: 1	Bio-Rad
GoTaq Green Master Mix, 2	Promega	M7123
(panni usa e getta Kimwipes)	Sigma-Aldrich	Z188956
marcatore di peso molecolare da oltre 1 kb	Thermo Scientific	SM1343
Acqua senza nucleasi	Sistema Sigma-Aldrich	W4502
Sub-Cell Model 192 (sistema su gel di agarosio ad alto rendimento)	Bio-Rad
sistema verticale di elettroforesi su gel Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad