Blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico

Summary

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare strutture fini dei nervi periferici ottenendo e macchiatura blu 1-2 µm sezioni con toluidina

Abstract

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con gli assoni motori o sensoriali. Grazie alla distribuzione capillare, i nervi periferici sono spesso danneggiati a causa di trauma o della malattia. Come sono state sviluppate metodi e strategie per valutare la lesione periferica del nervo in modelli animali, funzione e rigenerazione, analizzando la morfometria del nervo periferico è diventata una misura essenziale risultato terminale. Sezioni di macchiatura del nervo trasversale blu di toluidina ottenute da sezioni del nervo resina incorporata è un metodo riproducibile per le valutazioni qualitative e quantitative dei nervi periferici, consentendo la visualizzazione del numero di morfologia degli assoni e grado di mielinizzazione. Questa tecnica, come con molti altri metodi istologici, può essere difficile da imparare e padroneggiare utilizzando protocolli standard scritte. L'intento di questa pubblicazione è pertanto per accentuare i protocolli scritti per la macchiatura dei nervi periferici con videografia del metodo, utilizzando i nervi sciatici raccolti dai ratti blu di toluidina. In questo protocollo, descriviamo in vivo fissazione del nervo periferico e raccolta del tessuto e la post-fissazione con 2% tetrossido di osmio, l'incorporamento dei nervi in resina epossidica e ultramicrotomo sezionamento dei nervi allo spessore di 1-2μm. Sezioni del nervo poi trasferito ad un vetrino e colorato con blu di toluidina, dopo che essi sono quantitativamente e qualitativamente valutati. Esempi dei problemi più comuni sono indicati, così come passaggi per attenuare questi problemi.

Introduction

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con assoni sensoriali o motori¹. Nervo periferico difetti causati da patologie mediche e trauma rappresentano un problema importante di sanità pubblica e avere grande impatto economico^2,3. Nonostante i progressi nel valutare gli esiti delle lesioni del nervo periferico e comprensione di rigenerazione del nervo, metodi tradizionali come l'istologia del nervo e tecniche di colorazione sono strumenti essenziali per qualitativamente e quantitativamente valutare la salute del nervo come una misura di esito termi....

Protocol

Questo progetto sono stati utilizzati ratti Sprague Dawley adulti e tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali di Università del Wyoming.

1. chirurgia e nel Vivo del nervo fissazione

Nota: Informazioni sul fornitore per tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella materiali.

Nota: In vivo la fissazione del nervo viene utilizzata per conservare i tessuti e ridurre il degrado strutturale che può verificarsi tra il momento della morte e raccolta dei nervi....

Results

Resina incorporati nervo periferico sezioni colorate con toluidina blu consentono quantificazioni di accurati dati istologici. Una panoramica della procedura è illustrata nella (Figura 2). Nervo sciatico sezioni incorporato nel terreno di resina e colorato con blu di toluidina ha mostrato chiare immagini con risoluzione ottimale (figure 3). Danno del nervo può causare molti cambiamenti nel nervo strutture morfologiche, ad esempio, cambiamenti.......

Discussion

Gli esami delle strutture morfologiche della lesione del nervo periferico e la rigenerazione sono soggetti frequenti di Studio¹³. In questo protocollo, descriviamo la procedura per ottenere immagini di alta qualità per quantificazioni di dati istologici utilizzando tessuto di nervo sciatico del ratto incorporato in blocchi in resina e colorato con blu di toluidina. Questa tecnica fornisce un'immagine della morfologia del nervo in cui la rigenerazione del nervo può essere quantificata misurando il .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione salina tampone fosfato di Dulbco	Gibco	14200-075
soluzione di glutaraldeide	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148
fosfato di sodio monobasico monoidrato	Sigma-Aldrich	S9638
blu di toluidina O	Sigma-Aldrich	T3260
Tetraborato di sodio decaidrato	Acros Organics	205950010
Isoflurano	Piramal	NDC 66794-013-25
Kit di terreno per inclusione epossidica	Sigma-Aldrich	45359
Soluzione di idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	72068	Per regolare il pH fissativo di Trump
Acetone	Fisher Chemical	170942
Soluzione di tetrossido di osmio	Sigma-Aldrich	75632
VWR Micro vetrini, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Coperchio per microscopio in vetro	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Glass Knife Maker	RMC Products	GKM-2
Ultramicrotome	Prodotti	RMC MT-XL
15 mL Provetta conica	Falcon	ISO 9001
Eppendorf Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Sigma-Aldrich	T9661
Fiala di vetro da 4 mL	Sigma-Aldrich	854190
Lamette da barba	VWR	55411-050	Per il taglio del blocco di resina
Perfect Loop	Microscopia Elettronica Scienze	70944	Per la raccolta di sezioni sottili
di resina Strisce di coltelli in vetro ultra 6,4 mm x 25 mm x 400 mm	Microscopia elettronica Sciences	71012
Forno da 100 Watt	Millipore
Whatman Carta da filtro	Sigma-Aldrich	WHA10010155
Pipetta in plastica da 3 mL	Kit microchirurgico Sigma-Aldrich	Z331740
	precisione
Microscopio a fluorescenza Olympus Doppia			telecamera CCD a colori e monocromatica, DP80