Chirurgia di impianto cocleare e registrazioni di risposta elettricamente evocate uditive del tronco cerebrale in topi C57BL/6

Summary

Modelli animali di impianti cocleari possono far progredire le conoscenze delle basi tecnologiche di trattare la perdita permanente dell'udito neuro-sensoriale con stimolazione elettrica. Questo studio presenta un protocollo chirurgico per assordante acuta e l'impianto cocleare di un array di elettrodi in topi come pure la valutazione funzionale con risposta uditiva del tronco cerebrale.

Abstract

Gli impianti cocleari (CIs) sono dispositivi di neuroprosthetic che possono fornire un senso dell'udito ai sordi. Tuttavia, un IC non è possibile ripristinare tutti gli aspetti dell'udito. Miglioramento della tecnologia dell'impianto è necessaria se gli utenti CI sono per percepire musica ed eseguire in ambienti più naturali, come udito una voce con concorrenti chiacchieroni, riflessioni e altri suoni. Tale miglioramento richiede animali da esperimento per capire meglio i meccanismi della stimolazione elettrica della coclea e le risposte del sistema intero uditivo. Il mouse è un modello sempre più attraente grazie ai molti modelli genetici disponibili. Tuttavia, l'uso limitato di questa specie come modello CI è principalmente a causa della difficoltà di impiantare elettrodi piccoli. Ulteriori dettagli circa la procedura chirurgica sono pertanto di grande interesse per espandere l'uso di topi nella ricerca CI.

In questo rapporto, descriviamo in dettaglio il protocollo per assordante acuta e l'impianto cocleare di un array di elettrodi nel ceppo del mouse C57BL/6. Dimostriamo l'efficacia funzionale di questa procedura con risposta elettricamente evocate uditive del tronco cerebrale (eABR) e mostrano esempi di stimolazione del nervo facciale. Infine, si discute anche l'importanza di includere una procedura assordante quando si utilizza un udito normalmente animale. Questo modello di mouse fornisce una potente opportunità per lo studio dei meccanismi genetici e neurobiologici che sarebbero di pertinenza per utilizzatori di IC.

Introduction

Gli impianti cocleari (CIs) sono dispositivi elettronici che possono fornire un senso dell'udito di persone con perdite uditive severe e profonde. Utilizza elettrodi impiantati chirurgicamente nella coclea dell'orecchio interno per stimolare direttamente il nervo uditivo. Ad oggi, CI è il maggior successo protesi sensoriali e ha aiutato più di 600.000 persone in tutto il mondo¹. Tuttavia, il dispositivo ha carenze. In primo luogo, le prestazioni fornite dal dispositivo variano notevolmente tra i destinatari. In secondo luogo, discorso in ambienti rumorosi e musica sono ancora scarsamente percepiti dalla maggior parte degli utenti CI.

Per molti anni, i modelli animali sono stati utilizzati per comprendere meglio questi problemi nella ricerca di CI e di migliorare continuamente la sicurezza e l'efficacia dei dispositivi. I modelli hanno dato informazioni preziose in diversi fenomeni, come la plastica cambiamenti nel cervello che si svolgono seguendo CI impianto², l'effetto dell'applicazione di terapia genica per preservare l'udito residuo³e proprietà biofisiche della stimolato elettricamente nervo uditivo⁴, tra molti altri esempi.

I topi sono un organismo modello potente a causa della grande disponibilità di modelli genetici della sordità. Altri vantaggi includono la possibilità di manipolare il genoma di topo (ad es., tramite il sistema CRISPR-Cas), la possibilità di utilizzare avanzate tecniche per lo studio dei meccanismi, in particolare nel cervello, l'alto tasso riproduttivo, il rapido sviluppo di imaging e facile allevamento e la manipolazione. Le principali sfide tecniche nell'esecuzione di interventi chirurgici CI nei topi sono le piccole dimensioni della coclea e la presenza di una grande arteria stapediali (SA). La SA di solito scomparirà durante lo sviluppo embrionale negli esseri umani ma persiste per tutta la vita in un certo numero di roditori, tra cui topi, ratti e gerbilli. La SA viene eseguito sotto la nicchia della finestra rotonda, che complica l'accesso alla coclea e aumenta il rischio chirurgico.

Studi precedenti hanno dimostrato la fattibilità dell'impianto CI in topi^5,6,7. Irving et al hanno dimostrato che la stimolazione elettrica cronica intracochlear può essere raggiunto fino ad un mese. Stimolo acuto inoltre è stata effettuata, ma le registrazioni non sono state presentate. Hanno mostrato che cauterizzante l'arteria stapediali ha avuto alcun effetto significativo sulla soglia uditiva o il numero dei neuroni del ganglio spirale e che l'applicazione topica dell'aminoglicoside neomicina, un farmaco ototoxic, era un'efficace procedura assordante in topi⁵. Soken et al descritto un approccio dorsale modificato alla coclea del mouse attraverso la finestra rotonda per preservare meglio udienza stato⁶. A seguito di inserimento di un filo di platino-iridio, udito residuo sostanza è stata osservata con una risposta aumentata uditive del tronco cerebrale soglia (ABR) di 28 dB. Emissioni otoacustiche (OAE) sono stati persi in animali con grande ABR soglia turni⁶. Mistry et al ha verificato gli effetti funzionali ed istopatologici dell'impianto in assenza di stimolazione elettrica⁷. Anche se l'udienza è stata conservata nei topi impiantati sia 3 e 6 mesi alle basse frequenze, l'impianto ha provocato fibrosi-come il tessuto intorno all'impianto e osteoneogenesis circa la bullostomy⁷.

In breve, fuori i tre studi su CIs in topi, unico dimostra funzionale registrazione di stimolazione di CI. Irving e colleghi effettuato entrambe le registrazioni eABR acuta e cronica ma solo ha mostrato dati da cronica CI stimolazione⁵. Tuttavia, il modello cronico con un dispositivo impiantabile completamente sviluppato da Irving et è tecnicamente impegnativo. Non è ancora noto se acuta CI stimolazione, sia meno impegnativa e più veloce, può raggiungere risultati simili.

CIs sono utilizzati da persone con perdite uditive severe e profonde che non beneficiano di apparecchi acustici. Modelli animali per utilizzatori di IC pertanto dovrebbero includere una procedura assordante quando normalmente sentire gli animali sono usati. Un altro motivo per assordare gli animali dell'udito è che la stimolazione elettrica di un sordi o udito coclea produce diverse risposte neurali^{4,8,9,10,11, 12}. stimolazione elettrica di una coclea sorda direttamente attiva le fibre del nervo uditivo e genera una risposta di electroneural (α). Esso è caratterizzato da breve latenza e una piccola gamma dinamica nella periferia^8,10. D'altra parte, la stimolazione elettrica di una coclea di udito eccita anche le cellule ciliate in una risposta di elettrofonico (β) che è caratterizzata da latenze più lungo e più grande gamma dinamica^4,11. La risposta di elettrofonico è attribuita al normale eccitazione delle fibre nervose di cellule ciliate interne, elettricamente indotta contrazione di cellule ciliate esterne e la generazione di un viaggio di onda⁴. Le risposte Electroneural ed elettrofonico anche tradursi in due modelli differenti attività nel sistema nervoso centrale⁹. Sato et al registrato i neuroni del midbrain di una cavia CI impiantato prima e dopo assordante con neomicina, che elimina il contributo di elettrofonico. Hanno mostrato che la pendenza della funzione tasso-livello era più ripida e tassi di infornamento superiore nello stato assordato rispetto all'udienza condizione⁹. Pertanto, in base alla domanda di ricerca ha dichiarata, è importante prendere in considerazione tra cui assordante elettrofonico separata e electroneural risposte su stimolazione elettrica del nervo uditivo.

Qui, descriviamo la procedura per assordante acuta e l'impianto cocleare di un array di elettrodi in un mouse nonché la registrazione funzionale di intracochlear stimolazione elettrica con risposta elettricamente evocate uditive del tronco cerebrale (eABR).

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite secondo l'Università di Basilea, Svizzera, cura degli animali e linee guida. Essi sono stati concessi in licenza dall'ufficio veterinario del Cantone di Basilea, in Svizzera.

Nota: C57BL/6 topi adulti, età compresa tra 8 – 12 settimane (20 – 30 g di peso), sono stati utilizzati in questo studio.
L'orecchio sinistro viene utilizzato come l'orecchio sperimentale. L'orecchio destro serve come controllo intra-animale e non viene alterato chirurgicamente.

1. preoperative procedure

1. Anestetizzare l'animale 30 min prima dell'intervento chirurgico tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) di chetamina/xilazina (80 mg/kg ketamina, xilazina 16mg/kg, i.p., volume iniettato al peso corporeo di 10 μL/g).
   1. Supplemento anestesia come necessario, come giudicato tramite un pedale positivo e palpebrale (toe-pizzico) reflex e movimento dei baffi, con una dose più bassa di ketamina (45 mg/kg, i.p., iniettato al peso corporeo di 10 μL/g). Agenti e regimi della dose possono essere sostituiti secondo le linee guida istituzionali.
      Note: In generale, l'animale sarà necessario un'iniezione ogni 45 – 60 minuti con questo regime di dose e agente. Il tempo medio dall'incisione iniziale alla chiusura intorno l'array di elettrodi impiantati in genere è 1-1,5 ore.
2. Verificare la completa sedazione dell'animale caratterizzato da un ritmo respiratorio regolare e una mancanza di riflessi di punta-pizzico. Mantenere questo livello di anestesia.
3. Mantenere la temperatura corporea dell'animale a 36,6 ° C con un rilievo di riscaldamento a circuito chiuso. Applicare l'unguento dell'occhio per evitare la disidratazione della cornea. Questo eliminerà anche riflesso di lampeggio dell'animale, che può aggiungere rumore per la ricodifica.
4. Amministrare un analgesico locale tramite iniezione sottocutanea (s.c.) di bupivacaina/lidocaina (0,1 mg/mL bupivacaina e lidocaina 0,4 mg/mL, 0,1 mL somministrato s.c.) lungo la linea di incisione previsto per ridurre al minimo qualsiasi disagio chirurgica. Agenti e regimi della dose possono essere sostituiti secondo le linee guida istituzionali.
5. Amministrare l'atropina antagonista muscarinico (atropinesulfate amminico, 0,1 mg/mL, 20 μL somministrato s.c., disciolto in PBS) nel collo per ridurre la secrezione di muco e facilitare la respirazione. Agenti e regimi della dose possono essere sostituiti secondo le linee guida istituzionali.

2. pre-assordante risposta di acustica uditivi del tronco cerebrale (ABR)

Nota: aABR viene utilizzato per misurare lo stato di udito prima e dopo l'assordante. Test viene eseguito sull'orecchio sinistro e in una cabina insonorizzata elettricamente schermata. Si consiglia di testare e successivamente impiantare l'orecchio sinistro per una persona di mano destra. Ulteriori dettagli su ABR in topi possono essere trovati in^13,14. Tecnologie di Davis di Tucker (TDT) hardware e software (BioSig) sono usati per registrare ABR ma altri sistemi possono essere utilizzati.

1. Bloccare l'orecchio controlaterale (a destra) con gomma piuma acustica per isolare la risposta ABR dall'orecchio ipsilateral (sinistra). Mettere la schiuma in una siringa da 1 mL e iniettarla nel canale dell'orecchio destro del mouse per coprire l'intero condotto uditivo con schiuma (0,1 – 0,2 mL di schiuma). Assicurarsi che le guarnizioni di siringa strettamente all'orecchio affinché la schiuma si ottiene tutto il senso nel condotto uditivo.
2. Posizionare l'altoparlante 10 cm dall'orecchio sinistro.
   Nota: L'altoparlante per il programma di installazione è stato calibrato utilizzando un microfono di PCB, come descritto in refefence¹⁵.
3. Pulire gli elettrodi ABR con soluzione di etanolo 70%. Posizionare gli elettrodi sotto la pelle: attivo (Ch1) sul vertice, (-) di riferimento sotto la pinna dell'orecchio ipsilateral e macinato nella gamba posteriore (Figura 1).
4. Collegare la testa-fase e pre-amplificatore al processore uditivo tramite il porto di fibra ottica.
5. Controllare l'impedenza del principio attivo e l'elettrodo di riferimento.
   1. Se l'impedenza è oltre 3 Ohm, ri-organizzare e ri-prendere la misura. Le registrazioni migliori si ottengono quando gli elettrodi hanno la stessa impedenza. Chiudere la cabina insonorizzata.
6. Presenti clicca stimolazione e registrare ABR in una condizione di campo libero con un processore uditivi complessi e software. Standardizzare lo stimolo di clic nel software: 0,1 ms monocanale monofasica clic vengono presentati alle 21 Hz; Fare clic su livelli diminuisce da 90 dB SPL a 10 dB SPL in passi di 10 dB; 10 ms finestra di registrazione. Media un totale di 512 risposte a ogni livello di dB.
7. Applicare un filtro passa-basso di 2.000 Hz e 300 Hz highpass offline per ridurre il rumore nella registrazione utilizzando uno script di Matlab su misura.
8. Determinare la soglia ABR come il più basso livello di dB con una risposta di onda ABR riconoscibile (Figura 2, Figura 3).

3. chirurgia

Nota: Tipici strumenti utilizzati includono una forbice, un bisturi, un paio di pinze metalliche con punte diritte o curve, uno strumento di riavvolgitore tessuto, zeppe di aspirazione diversi e punte di carta assorbibile. La chirurgia è eseguita sull'orecchio sinistro.

1. Mettere il mouse sul suo lato destro. Evitare eccessivo stress torsionale sulle vertebre cervicali. Assicurarsi di mantenere il corpo dritto per mantenere aperte le vie aeree.
2. Tagliare il pelo dietro l'orecchio sinistro con una forbice (o radersi con un rasoio) per esporre la pelle. Sterilizzare la pelle con soluzione di etanolo 70% e betadine (iodio di povidone).
3. Sotto ingrandimento microscopico (16x), praticare un'incisione di alberino-auricolare di 1 – 1,5 cm con il bisturi.
4. Passare a maggiore ingrandimento microscopico (25x).
5. Eseguire una dissezione smussa attraverso lo strato di grasso sottocutaneo, che può essere di spessore variabile, con il forcipe.
   Nota: Prestare attenzione quando dissezione come la vena giugulare esterna attraversa questa zona. Danno a questa struttura può causare sanguinamento eccessivo.
6. Ritrarre il muscolo sternocleidomastoideo per rivelare il periostio bulla timpanica. Utilizzare il nervo facciale come un punto di riferimento anatomico chiave per aiutare l'identificazione della bulla uditiva. Il nervo facciale avvolge intorno al bordo posteriore/dorsale del muscolo sternocleidomastoid e rostralmente corre lungo il condotto uditivo verso la pinna. Posizionare delicatamente lo strumento retrattore diconservazione nell'incisione per facilitare l'accesso a bulla (Figura 4).
7. Rimuovere il tessuto che ricopre l'area medio-dorsale della bulla per permettere la visualizzazione chiara del crinale tra bulla e il processo mastoideo.
8. Ruotare delicatamente un ago 30g per perforare la bulla ed effettuare un foro (bullostomy) sul lato posteriore-superiore della cresta (l'osso è più sottile su questo lato). In alternativa, utilizzare un trapano chirurgico dentale.
   Nota: Questa e le seguenti operazioni possono essere fatto con ancora più alto ingrandimento al microscopio (40x) se si preferisce. Se necessario, inoltre, di modificare la posizione del microscopio. È importante ottimizzare la visualizzazione chirurgica dello spazio dell'orecchio medio.
9. Allargare il bullostomy pizzicando pezzi di piccolo osso utilizzando una pinzetta punta per esporre le cavità dell'orecchio medio. Estendere la bullostomy dorsalmente verso il processo mastoideo finché la nicchia della finestra rotonda è chiara di sovrastante l'osso. L'arteria stapediali, un ramo dell'arteria carotica interna, corre ventrale per la nicchia della finestra rotonda.
   1. Fare attenzione a non danneggiare la nave come eccessivo sanguinamento può essere fatale. Piccole emorragie possono essere interrotto premendo un piccolo pezzo di spongostan nella cavità dell'orecchio interno.
   2. Estendere la bullostomy verso la direzione di anteriore-superiore per visualizzare la staffa, l'osso dell'orecchio centrale collegato alla finestra ovale.
10. Rimuovere la staffa con le pinzette per esporre la finestra ovale.

4. rotonda della finestra applicazione dell'agente ototossici

1. Delicatamente perforare le membrane di finestra e finestra ovale rotonde utilizzando un ago 30g smussata. Verifica che perilinfa si esaurisce.
2. Irrorare lentamente neomicina di 0.05% peso/volume dissolto in PBS (regolata a pH 7,4) attraverso la finestra ovale. Liquido dovrebbe sciacquare fuori la finestra rotonda. Ripetere la stessa procedura sulla finestra rotonda. Fare attenzione a non danneggiare le strutture ossee di finestra con l'ago usato per irrorare.
3. Posto un piccolo pezzo (1 mm²) di spongostan imbevuto di neomicina all'interno della nicchia finestra e finestra ovale rotonda.
4. Rimuovere lo strumento di riavvolgitore, chiudere l'incisione e aspettare 30 min.

5. post-assordante ABR acustica

1. Registrare aABR in un modo simile come prima assordante (passi 2,2-2,8) (Figura 2b, Figura 3).

6. inserimento dell'Array di elettrodi CI

Nota: L'array di elettrodi intracochlear è costituito da quattro bande platino (Ø0.2 mm) con filo di platino/iridum parylene isolato schermato in un tubo di silicone (Figura 5).

1. Posizionare l'utensile divaricatore nell'incisione di ri-accedere bulla.
2. Inserire la matrice di elettrodi nella finestra rotonda (tympani di scala) ad una profondità dove l'anello di^th platino 4 si trova appena dentro la finestra rotonda. Questo dà una profondità di inserimento di ~ 2 mm, corrispondente a una posizione di intracochlear a ~ 30 kHz¹⁶.
3. Bobina del filo di piombo all'interno la bulla e colla il filo al tessuto sopra la bulla. Il filo di avvolgimento aiuta a mantenere la matrice in posto in tutto l'esperimento.
4. Rimuovere il riavvolgitore con cautela e chiudere l'inserzione con la colla del tessuto.
5. Praticare una piccola incisione (0,5 mm) nel collo perpendicolare alla linea che separa dove l'attivo ed elettrodi di riferimento ABR utilizzerà una forbice di tessuto. Mettere la palla di terra platino in tasca sottocutanea e chiudere la piccola incisione con la colla del tessuto (Figura 6).
6. Collegare la scheda di matrice elettrodo per la piattaforma di stimolatore di animale.

7. electric uditivi del tronco cerebrale risposta (eABR)

Nota: Una piattaforma di stimolatore animale (ASP) è usato per stimolare elettricamente l'array di elettrodi. Altre sorgenti di corrente e sistemi software possono essere utilizzati.

1. Posizionare gli elettrodi ABR come prima (passaggi 2,3-2,5) (Figura 6).
2. Aprire il software ASP e definire il paradigma di stimolazione impulso elettrico. Usiamo un impulsi bifasici carica bilanciato con 50 μs/fase e 10 μs interfase divario presentato a 23,3 impulsi al secondo (pps). La stimolazione elettrica viene fornita in configurazione di elettrodi monopolari con aumento dei livelli attuali. Un totale di 400 risposte sono in media ogni livello corrente.
3. Presentiamo i treni di impulsi elettrici e registrare la risposta di evocati eABR continuamente tramite l'headstage TDT, processore pre-amplificatore e uditivo.
4. Tracciare e analizzare i dati di eABR tramite uno script di matlab su misura (Figura 7). Lo script e un esempio di una registrazione sono forniti nell'integrativa.

8. fine dell'esperimento

1. Alla fine dell'esperimento, eutanasia animale secondo le linee guida istituzionali.
2. Aprire l'incisione con cautela e rimuovere l'impianto.
3. Ultra-Sonicare l'array di elettrodi in acqua distillata per 10 min rimuovere i residui di tessuto.
   Nota: L'impianto può essere riutilizzato più volte, se gli elettrodi sono intatte e correttamente lo svolgimento. A questo scopo, è possibile misurare l'impedenza degli elettrodi con un multimetro quando la matrice è asciutta.
4. Memorizzare la matrice di elettrodi in un luogo asciutto.

Results

Lo scopo di questo studio era di descrivere un modello affidabile per stimolo acuto CI nel topo assordato. Le soglie uditive pre- e post-chirurgica servito come una lettura funzionale della procedura assordante. L'applicazione topica di neomicina 0.05% nella finestra ovale e rotonda ha aumentato significativamente le soglie uditive scattare-evocate da 46 dB ± 6 (post-neomicina pre-vs: 30,0 dB ± 3.8 vs 75,7 dB ± 3,7, p = 0,0003, t-prova accoppiata, n = 7) (Figura 3). L'array di elettrodi del mouse di dimensioni medie è stato in seguito inserito nella finestra rotonda (Figura 4, Figura 5). Simulazione elettrica di un elettrodo di intracochlear potrebbe generare attendibilmente eABR attività. (Figura 7). In alcuni casi, CI stimolazione attivata del nervo facciale e produsse un'ondata di alta ampiezza con latenza sia breve o lungo (Figura 8A e 8B figura, rispettivamente). La risposta breve latenza è stata caratterizzata da una rapida amplificazione dell'onda IV circa 3 ms e rischia di essere una risposta diretta del nervo facciale. La risposta lunga latenza è comparso circa 5 – 6 ms e rischia di essere una risposta muscolare non uditivo (miogenico) indirettamente evocata dal nervo facciale. Risposte del nervo facciale sono segnalate raramente negli studi sugli animali nella letteratura, ma sono una complicazione ben nota in umana CI utenti^17,18,19. In Figura 8, la stimolazione del nervo facciale è apparso ai livelli attuali relativamente medi (150 – 200 μA) e in due diversi animali. In altri casi, entrambe le risposte potrebbero apparire nello stesso animale a livelli molto elevati di correnti (non mostrato). Si consiglia di limitare il livello di corrente ai livelli sotto l'aspetto di stimolazione del nervo facciale.

Figura 1: installazione di risposta del tronco cerebrale uditivo (ABR). Subdermal elettrodi sono posti al vertice (attivo/canale 1 [Ch1]), dietro l'orecchio ipsilateral (riferimento [Ref]) e presso la gamba posteriore (massa [Gnd]) del mouse anestetizzato. Elettrodo segnali vengono amplificati e quindi registrati da un sistema TDT. Stimolazione acustica ed elettrica sono presentati tramite un microfono e una piattaforma di stimolatore di animale, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: rappresentante aABR onde per fare clic su stimolazione da un selvaggio-tipo mouse prima e dopo l'assordante con neomicina 0.05%. (A) la normale-udienza aABR modello è caratterizzato da onde etichettate-V e una soglia di udito basso, qui 30 dB SPL (freccia). (B) il aABR assordato modello mostra una soglia uditiva maggiore, qui 70 dB SPL (freccia). Le onde hanno una latenza più lunga e più jitter temporale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: soglia aABR prima e dopo l'assordante. Applicazione di neomicina notevolmente aumentato aABR soglie 46 dB ± 6. Post-neomicina pre-vs: 30,0 dB ± 3.8 vs 75,7 dB ± 3,7, p = 0,0003, t-prova accoppiata, n = 7. Gli errori sono errori standard dei mezzi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: l'intervento chirurgico. (A) l'esposizione a bulla uditiva. il bullostomy è eseguita (bianco cerchio tratteggiato) lungo la cresta sulla bulla timpanica (linea tratteggiata nera). (B) il bullostomy permette la visualizzazione della finestra rotonda, arteria stapediali e finestra ovale. Neomicina è delicatamente spurgato prima la finestra ovale, poi la finestra rotonda. Matrice (C), l'elettrodo viene inserito fino a quando l'elettrodo^th 4 si trova appena dentro la nicchia della finestra rotonda. L'elettrodo è a spirale all'interno del bulla per mantenere la matrice sul posto prima che l'incisione viene chiusa. VII CN = nervo cranico (nervo facciale), VII OW = finestra ovale, RW = finestra rotonda, SA = arteria stapediali, SCM = muscolo sternocleidomastoid, TB = bulla timpanica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: l'impianto cocleare mouse. (A), l'array di elettrodi intracochlear è costituito da quattro bande platino distanziate a intervalli 0.4 mm con un diametro d: 0 [Suggerimento] (d = 0,21), 1 (d = 0,23), 2 (d = 0.25), 3 (d = 0,27). La larghezza di ciascun elettrodo è di 0,2 mm. I quattro fili di platino/iridio (90/10) parylene isolati sono schermati in un tubo di silicone. (B) ingrandimento di punta di matrice dell'elettrodo (rosso quadrato tratteggiato). L'array di elettrodi e una sfera di riferimento platino sono collegati ad una scheda di stampa. Barra della scala = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: installazione elettricamente evocati ABR (eABR). La palla di terra CI platino (Gnd, rosso) è posizionata in una tasca sottocutanea nel collo del mouse. La linea tra active (Ch1(+) al vertice) e gli elettrodi di riferimento (Ref (-) sull'orecchio ipsilateral) ABR è perpendicolare alla linea che separa l'array di elettrodi e la terra al fine di ottenere la migliore risposta di eABR. L'elettrodo di terra eABR (Gnd, nero) si trova nella gamba posteriore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: eABR rappresentante onde alla stimolazione di CI in un mouse assordato. Un treno di impulsi bifasici è presentato all'elettrodo #1 in configurazione monopolare a 23,3 impulsi al secondo (pps) con 400 ripetizioni. Stimoli livello 0-175 μA è mostrato nei 25 μA passaggi (Vedi dettagli di stimolazione al punto 7.2). Numeri romani indicano il numero d'onda eABR. Le ampiezze d'onda e la latenza aumenta e diminuisce, rispettivamente, con l'aumento del livello corrente. In questo esempio, wave II è comparso circa 1 ms, onda III circa 2 ms, onda IV intorno 3 ms, dell'onda V circa 4 ms. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: esempio di stimolazione del nervo facciale. In alcuni casi, CI stimolazione può attivare il nervo facciale ed evocano una risposta diretta a breve latenza (A) (freccia) o indiretta risposta con latenza più lunga (B) (freccia). Gli esempi riportati sono da due CI-impiantati animali stimolati con un treno di impulsi bifasici utilizzando 0 – 300 μA in 50 μA passi (Vedi dettagli di stimolazione al punto 7.2). Numeri romani denotano numeri onda eABR. * denota il residuo della potatura meccanica dell'onda eABR a causa della saturazione dell'amplificatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo manoscritto descrive l'approccio chirurgico per assordante acuta e l'impianto cocleare in mouse, come pure la valutazione funzionale di stimolazione di CI con risposta uditiva del tronco cerebrale. Anche se la coclea del mouse è piccola e l'intervento chirurgico impegnativo, il modello del mouse CI è fattibile e serve come uno strumento prezioso nella ricerca uditiva.

L'arteria stapediali è presente nell'orecchio medio del mouse. L'arteria entra la bulla posterior-medialmente e corre inferiormente alla nicchia della finestra rotonda e poi superiormente per la nicchia della finestra ovale. Nello sviluppo iniziale del modello del topo, abbiamo sperimentato il trauma seguente sanguinamento intra-operatorio mortale all'arteria stapediali, principalmente durante l'accesso a bulla. Di conseguenza, abbiamo adattato un approccio più limitato e letta la bulla nei passaggi da una dissezione più piccolo e raffinato. Da allora in poi sono stati osservati senza ulteriori complicazioni a causa di sanguinamento. Nonostante il fatto che tale cauterizzazione stapediali arteria non ha alcun effetto significativo sulla soglia uditiva o il numero dei neuroni del ganglio spirale in topi⁵, a nostro parere, non è necessario fino a quando la grande cura e attenzione sono presi durante l'intervento chirurgico. Vi consigliamo di prendere il tempo necessario per sviluppare le capacità psicomotorie e raggiungere la competenza tecnica. Il tempo medio dall'incisione iniziale alla chiusura intorno l'array di elettrodi impiantati in genere è 1-1,5 h.

L'intervento chirurgico descritto acuta nei topi CI è simile alla procedura "ventrale" e inserimento di finestra rotonda utilizzati in altri roditori, tra cui ratti e dei gerbilli^20,21,22. Altri studi del roditore hanno utilizzato l'approccio"dorsale" con un cochleostomy giro basale invece di un inserimento della finestra rotonda, evitando la SA interamente e inserendo la matrice più profondamente^6,23,24. L'impianto di un assembly di stimolazione cronica nei topi segue la stessa procedura come descritto in questo protocollo con l'aggiunta di una maglia di Dacron per fissare l'impianto e cura postoperatoria⁵.

Le principali sfide tecniche quando si eseguono interventi chirurgici CI nei topi sono le piccole dimensioni della coclea rispetto alla coclea dei ratti e dei gerbilli e la presenza di un grande SA. La SA è inoltre presente nei ratti ma non in gerbilli. Inoltre, poiché i topi sono più piccoli di ratti e dei gerbilli, sono più vulnerabili alle procedure chirurgiche.

Per eliminare le risposte elettrofonico nelle registrazioni eABR e imitare la perdita della cellula ciliata trovata nella maggior parte degli utenti CI, abbiamo assordato gli animali prima dell'inserimento di CI. Topi sono difficili da assordare ototoxically in vivo²⁵ perché le concentrazioni sistemiche di aminoglicosidi necessari per causare ototossicità ha una finestra stretta dose: abbassare le dosi date sopra parecchi giorni porta senza perdita della cellula ciliata, considerando che una singola iniezione di una dose più alta può essere letale²⁶. Inoltre, la suscettibilità agli aminoglicosidi è ceppo dipendente²⁶. Tuttavia, è stato dimostrato che una singola dose di aminoglicosidi in combinazione con un diuretico di ciclo può produrre perdita eccessiva esterna della cellula ciliata in topi CBA/CaJ senza conseguenze fatali²⁷. Morte della cellula ciliata interna in ritardo è stata segnalata a metà di tutte le coclee esaminati²⁷.

In questo manoscritto, abbiamo usato l'applicazione topica della neomicina aminoglicosidi ispirato dal protocollo recentemente stabilito per di topi C57BL/6⁵. Applicazione acuta di neomicina ha aumentato significativamente la soglia uditiva di scattare-evocate da 46 dB ± 6.1. Anche se questo aumento è maggiore l'aumento di 35 dB segnalato da Irving et al. (post-chirurgia pre-vs: 41,6 dB ± 3.3 vs 76,6 dB ± 4.4, p = 0.02, n = 3) ⁵, abbiamo raggiunto la stessa soglia post-assordante (75,7 dB ± 3,7 vs 76,6 dB ± 4.4). 0.05% neomicina è pensato per causare una perdita parziale dell'udito, principalmente dalla morte rapida esterna della cellula ciliata, come perdita della cellula ciliata interna richiede più tempo per verificarsi²⁷. È quindi possibile che la risposta elettrofonico, che è generato sia da interno e cellule ciliate esterne^{4,8,9,10,11,12}, è solo parzialmente eliminati negli animali assordati con udito residuo. Anche se 0,05% (peso/volume) neomicina non diminuisce il numero dei neuroni del ganglio spirale 4 settimane post-assordante⁵, è ancora sconosciuto se neomicina nel nostro setup acuta colpisce le fibre del nervo uditivo o promuove synaptopathy (perdita di sinapsi tra cellule ciliate interne e tipo ho uditiva del nervo fibre). Un'altra incertezza è che il trattamento topico neomicina non può produrre una distribuzione uniforme di perdita della cellula ciliata lungo la lunghezza della coclea. Gli studi futuri sono tenuti a rispondere a queste domande.

In sintesi, il numero crescente di modelli genetici per sordità umana e gli strumenti biochimici disponibili rendono il mouse un attraente modello animale per ricerca uditiva, compreso il campo di CIs.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hardware
Cabina insonorizzata	IAC Acoustics, Winchester, Regno Unito	Custodia Mac-2 RF Scatola schermata RF 2A
Altoparlante MF1 Tucker	Davis Technologies (TDT), FL, USA
Microfono PCB	PCB Piezotronics, Inc, NY, USA	Modello 378C01
Headstage a bassa impedenza	TDT, FL, USA	RA4LI
Medusa preamplificatore	TDT, FL, USA	RA4PA
RZ6 processore uditivo	TDT, FL, USA
Piattaforma stimolatore animale	ASP, Oticon Medical, Nizza, Francia
Multimetro	Fluks	#115
Surgical equipment
Termoforo a circuito chiuso	FHC, Inc. ME, USA
Unguento per gli occhi	Alcon, CH	Lacrinorm Augengel
Schiuma acustica	Otoform Ak, Dreve Otoplastik GmbH	#464
Elettrodi ad ago sottocutaneo monouso	Horizon, Rochester Electro-Medical Inc.	S83018-R9, 27G
Strumento di divaricamento autobloccante (Mini Divaricatore Colliri)	Strumenti per le scienze fini	#17000-01
Cunei di aspirazione	Agnthos, SE#	42-886-460
Punto di carta assorbibile (medio)	WPI, FL, USA	#504182
Array di elettrodi intracocleari	Bionics Institute, Melbourne, Australia	Dispositivi
		#MS0002
colla tissutale. Loctite 4161 Superbond	Henkel	Codice 19743
Piattaforma stimolatore animale (ASP)	Oticon Medical, Nizza, Francia
Farmaci/prodotti chimici
Ketamina (Narketan)	Provet AG, CH	100mg/mL, #VQ_320265
Xilazina (Rompun)	Provet AG, CH	Inj Diss 2%, # 1315
Bupivacaina	Compendio, CH	Bupivacain Sintetica inj Diss 0,5%
Atropina (Atropinesulfat Amino)	Amino AG, CH	1 mg/mL
Betadine (Povidone/iodio)	Provedic, CH
Neomicina (sale di neomicina trisolfato)	Sigma	N1876-25G, Lot#WXBB7516V
Software
BioSigRZ	TDT, FL, USA
Matlab	MathWorks, MA, USA
software ASP	Oticon Medical, Nizza, Francia