Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea

Sommario

Il numero di nuovi biomateriali ingegnerizzati per la riparazione di lesioni dell'osso grande è in continua espansione con l'obiettivo di migliorare la guarigione ossea e superare le complicazioni connesse con trapianto osseo. Qui, presentiamo una strategia multidisciplinare per test di biocompatibilità pre-clinico di biomateriali per riparazione ossea.

Abstract

Grande pseudoartrosi fratture sono una sfida significativa nell'ambulatorio ortopedico. Anche se auto - e gli innesti dell'osso allogenico sono eccellenti per la guarigione di tali lesioni, esistono potenziali complicazioni con il loro uso. Così, scienziati dei materiali sono lo sviluppo di biomateriali sintetici, biocompatibili per superare questi problemi. In questo studio, presentiamo una piattaforma multidisciplinare per la valutazione di biomateriali per riparazione ossea. Abbiamo unito le competenze da biologia dell'osso e immunologia per sviluppare una piattaforma incluso in vitro degli osteoclasti (OC) e le analisi degli osteoblasti (OB) e in vivo modelli murini di riparazione ossea, immunogenicità e allergenicità. Dimostriamo come eseguire gli esperimenti, riepilogare i risultati e relazione sulla biocompatibilità di biomateriale. In particolare, abbiamo testato la vitalità di OB, differenziazione e mineralizzazione e redditività OC e differenziazione nel contesto dei dischi di β-tricalcio fosfato (β-TCP). Abbiamo provato anche una schiuma di β-TCP/collagene (β-TCP/C) che è un materiale commercialmente disponibile usato clinicamente per la riparazione dell'osso in un modello murino di difetto critico dimensioni osso calvarial per determinare gli effetti sulle prime fasi di guarigione ossea. In esperimenti paralleli, abbiamo valutato le risposte immunitarie e allergiche nei topi. Il nostro approccio genera un profilo di compatibilità biologica di un biomateriale osseo con una gamma di parametri necessari per la predizione della biocompatibilità dei biomateriali utilizzati per la guarigione dell'osso e riparazione nei pazienti.

Introduzione

Riparazione dell'osso è un processo complesso che inizia con la formazione dell'ematoma, infiammazione, callo formazione e rimodellamento quindi^1,2. Tuttavia, potenziale di rigenerazione dell'osso è limitata alla dimensione dell'osso frattura^1,3. Per esempio, grandi fratture causate da traumi, cancro o l'osteoporosi non possono guarire e sono denominate fratture ossee non sindacale. Queste lesioni ossee richiedono spesso il trattamento per promuovere la rigenerazione e riparazione dell'osso fisiologico sano. Attualmente, il trapianto di osso autologo e....

Protocollo

Le procedure sono state fatte con topi BALB/c seguendo tutte le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del Ministero austriaco dell'educazione, scienza e ricerca e sono state approvate dal Comitato per l'etica del Ministero austriaco dell'educazione, scienza e della ricerca.

1. principale del Mouse OB cultura

1. Isolamento di OB da calvaria neonatale del mouse tramite digestione enzimatica
   1. Eutanasia neonatale cuccioli di 1 – 2 giorno vecchio (60 in totale) per decapitazione e posizionate le testine in una capsula di Petri con sterile 1x tampone fosfato salino (PBS).
   2. Tenere la t....

Risultati

Per valutare la β-TCP per la sua efficacia come un biomateriale per riparazione ossea, abbiamo usato in vitro e in vivo i metodi di screening. In primo luogo, abbiamo misurato le risposte di OB per i dischi di β-TCP rispetto ai comandi da solo medio della linea di base. Nella figura 2 viene illustrato l'attuabilità di OB in risposta ai dischi di β-TCP alle 7 e 14 giorni di cultura. Attuabilità delle cellule misurata da cellule metabolicament.......

Discussione

Qui, ci mostrano un approccio multidisciplinare per la valutazione preclinica di biocompatibilità per biomateriali rappresentante sviluppato per la riparazione e rigenerazione ossea. Abbiamo testato le risposte di OBs, OCs, e la risposta di guarigione in vivo in un difetto critico dell'osso modello in topi come pure in vitro e in vivo le risposte immunitarie. Abbiamo mirato a dimostrare come le analisi lavoro e riepilogare i dati e le conclusioni derivate dall'esame dei biomateriali. Mostriamo .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Biomaterials
β-dischi di fosfato tricalcico (β-TCP, 14 mm)			I dischi sono stati sinterizzati in un forno a muffola alla temperatura di 1150 °C. Una descrizione dettagliata della produzione può essere trovata in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). I campioni sono stati irradiati con raggi UV (15 minuti per lato) prima di essere utilizzati in colture cellulari.
Orthovita Vitoss schiuma (β-TCP/C schiuma)	Orthovita	2102-1405
Coltura di osteoblasti di topo
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich	A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4			Sciogliere 200 mM di glicina, 2 mM di cloruro di magnesio, 2 mM di cloruro di zinco in acqua ultrapura e regolare a pH 10.
Terreno di crescita ossea (BGM)			α-MEM + 10% FBS inattivato termicamente + 1% penicillina/streptomicina
Tampone di lisi cellulare: CyQuant tampone di lisi cellulare 20x concentrato	Thermo Scientific	C7027	Diluire il tampone concentrato di lisi cellulare 20 volte in acqua ultrapura.
Reagente per la vitalità cellulare: Reagente per la vitalità cellulare Presto Blue	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A13261
Collagenasi di tipo IV da clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138
Kit per il dosaggio delle proteine DC II	Bio Rad	5000112	Il kit per il dosaggio delle proteine DC contiene il reagente A, il reagente B, il reagente S e BSA per lo standard di riferimento. Per il reagente A', aggiungere 20 µ L reagente S a 1000 µ L. reagente A.
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Steril-filtro DMSO prima dell'uso.
Dispase II (proteasi neutra, grado II)	Kit	4942078001
EnzCheck per l'attività della fosfatasi alcalina	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	E12020	Il kit per il dosaggio della fosfatasi EnzCheck contiene 6,8-difluoro-4-metilumbelliferil fosfato (DiFMUP), N,N-dimetilformammide e 6,8-difluoro-7-idrossi-4-metilcumarina (DiFMU).
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Soluzione di formalina tamponata neutra 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898
Cloruro di esadecilpirdinio (cetilpiridinio) monoidrato	Sigma-Aldrich	C9002
Acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idrato	Sigma-Aldrich	A8960
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	M2670
MEM alfa medio (&alfa;-MEM)	Gibco Life Technologies	11900-073
Terreno di mineralizzazione osteogenico (MM)			&alfa;-MEM + 10% FBS inattivato a caldo + 1% penicillina-streptomicina + 50 &; g/mL di acido ascorbico + 5 mM di β-glicerofosfato
Penicillina-streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific
Sigmafast BCIP/NBT	Sigma-Aldrich	B5655
Tripsina-EDTA (0,5%), senza rosso fenolo (10x)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15400054	Diluire la soluzione madre concentrata 10 volte in 1x PBS.
Tween20	Sigma-Aldrich	P1379
Acqua ultrapura: Acqua per colture cellulari apirogena VWR		L0970-500
Tampone			Aggiungere  0,05% Tween20 a 1x PBS.
Cloruro di zinco	Sigma-Aldrich	1.08816
β-Glicerofosfato sale disodico idrato	Sigma-Aldrich	G5422
Piastra per coltura in sospensione a 24 pozzetti	Greiner bio-one	662102
Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti	Greiner bio-one	662160
Provetta conica da 50 mL	Greiner bio-one	227261
Piastra nera a 96 pozzetti	Greiner bio-one	655076
Piastra trasparente a 96 pozzetti	Greiner bio-one	655001
Centrifuga: VWR Mega Star 600R	VWR
CO2-Incubatore: HeraCell 240	Thermo Scientific
Cryovial 2 mL	Greiner bio-one	122263
Unità filtrante monouso FP30/0.2 CA-S	GE Healthcare Life Sciences Whatman	10462200	Per la filtrazione sterile di soluzioni enzimatiche.
Scanner piano: Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Infinite M200 Pro lettore di micropiastre	Tecan
Provetta per microcentrifuga: Eppendorf provetta safe-lock 0,5 mL	VWR	20901-505
Provetta per microcentrifuga: Eppendorf tube safe-lock 1,5 mL	VWR	21008-959
Shaker Swip (orbitale e orizzontale)	Edmund Buehler
Incubatore a scuotimento GFL3032	GFL	3032
Pipetta monouso: pipetta per siero	Greiner bio-one	612301
Strumenti sterili (forbici, pinzette, pinze curve)
Piastra per coltura tissutale (10 cm)	Greiner bio-one	664960
Co-coltura di osteoblasti-osteoclasti di topo
1α,25- Diidrossivitamina D3	Sigma-Aldrich	17936	1000x stock concentrato (10 µ M in etanolo 100%)
Acetone	VWR Chemicals	22065.327
Terreno di crescita ossea (BGM)			α-MEM + 10% FBS inattivato a caldo + 1% penicillina-streptomicina
Acqua distillata	Carl Roth	3478.4
Etanolo (100% vol/vol)	VWR Chemicals	20821.365
Etanolo (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Sale LB rosso viola veloce	Sigma-Aldrich	F3381
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Soluzione di formalina tamponata neutra 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM)	Gibco Life Technologies	11900-073
N,N-Dimetilformammide	Sigma-Aldrich	D4551
Naftolo AS-MX fosfato	Sigma-Aldrich	N4875
Terreno di differenziazione degli osteoclasti (DM)			&alfa;-MEM + 10% FBS inattivato a caldo + 1% penicillina-streptomicina + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 + 1 &; M prostaglandina E2
Penicillina-streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific
Prostaglandine E2 (PGE2)	Cayman Chemical Company	9003016	1000x stock concentrato (1 mM in etanolo 100%)
Acetato di sodio triidrato	Sigma-Aldrich	S7670
Tartrato di sodio bibasico diidrato	Sigma-Aldrich	S8640
Strumenti sterili (forbici, pinze, bisturi)
TRAP tampone pH 5,0			Sciogliere 40 mM di acetato di sodio, 10 mM di tartrato di sodio in acqua ultrapura e regolare a pH 5.
Acqua ultrapura: Acqua per colture cellulari apirogena	VWR	L0970-500
Piastra per coltura in sospensione a 24 pozzetti	Greiner bio-one	662102
Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti	Greiner bio-one	662160
Provetta conica da 50 mL	Greiner bio-one
Centrifuga: VWR Mega Star 600R	VWR
Incubatore a CO2: HeraCell 240	Thermo Scientific
Lama per wafer diamantata (10,2 cm x 0,3 cm)	Sega a bassa velocità Buehler
Isomet
(6 cm)	Greiner bio-one	628.161
Tappo a vite Flacone in vetro 20 mL	Carl Roth	EXY4.1
Siringa sterile monouso 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Pipetta monouso: pipetta per siero	Greiner bio-one	612301
Ago sterile: Ago ipodermico RW 27 G x 3/4''	Henry Schein Animal Health	9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq)	Richter Pharma AG
Anestesia: Ketamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Sterilizzante a freddo: SafeSept Max	Henry Schein Animal Health	9882765
Etanolo (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Unguento per gli occhi: VitA POS 5 g	Ursapharm
Soluzione salina normale (soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%)	Fresenius Kabi
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific
Soluzione di iodio povidone: Braunol 1000 mL	B. Braun	3864154
Roti-Histofix 4,5% formalina tamponata	Carl Roth	2213.6
Adesivo tissutale: Histoacryl 5 x 0,5 mL	B. Braun Surgical	1050060
Dispositivi di protezione individuale: guanti chirurgici, berretto e maschera, camice	Henry Schein Animal Health	1045073, 1026614, 9009062, 370406
Strumenti sterili (bisturi, forbici, pinze, porta aghi)
Aghi sterili: aghi ipodermici RW 27 G x 3/4'' e 30 G x 1/2''	Henry Schein Animal Health	9003340, 9003630
Siringa sterile monouso 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Piastra riscaldante: Physitemp	Rothacher Medical	TCAT-2LV
Tamponi di garza sterili	Henry Schein Animal Health	220192
Bisturi monouso sterile (Figur 20)	Henry Schein Animal Health	9008957
Trapano chirurgico/dentale: Implantmed SI-923	W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH	16929000
Manipolo tipo S-II	W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH	30056000
Trephine, diametro 4 mm	Hager& Meisinger GmbH	229040
Set di tubi per irrigazione 2,2 m	W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH	4363600
Elevatore periostale 2 mm / 3 mm	Henry Schein Animal Health	472683
Sutura non riassorbibile: Poliestere verde, DS19, met. 1,5, USP 4/0 75 cm	Henry Schein Animal Health	300715
In vitro risposte immunitarie
Anestesia per l'eutanasia: Ketamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Proliferazione cellulare ELISA, BrdU (colorimetrico) Kit di dosaggio	Sigma-Aldrich	11647229001	Il kit contiene la soluzione di marcatura BrdU, la soluzione di fissazione (FixDenat), la soluzione anticorpale Anti-BrdU, il tampone di lavaggio e la soluzione di substrato.
Concanavalin A (ConA)	MP Biomedicals	150710
Terreno di coltura splenociti			RPMI medium + 10% FBS inattivato a caldo + 1% soluzione di penicillina-streptomicina + 0,1% gentamicina + 0,2% ß-mercaptoetanolo + 1% aminoacidi non essenziali
Etanolo (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp;
Gentamicina	Gibco, Thermo Fisher Scientific
Mouse IL-1β ELISA pronto-PARTENZA-via!	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard	BioLegend	431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard	BioLegend	431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard	BioLegend	430801
Soluzione di aminoacidi non essenziali	Gibco, Thermo Fisher Scientific
Penicillina-streptomicina	Gibco, Thermo Fisher Scientific
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific
tampone per la lisi dei globuli rossi (RBC): BD Pharm Lyse	BD Bioscience	555899
RPMI 1640 medium, HEPES	Gibco, Thermo Fisher Scientific	52400025
β-Mercaptoetanolo	Gibco, Thermo Fisher Scientific
provetta conica da 50 mL	Greiner bio-one	227261
piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti	Greiner bio-one	655180
Centrifuga: VWR Mega Star 600R	VWR
Cell strainer 40 &; m	BD Bioscience	352340
Infinite M200 Pro Lettore di micropiastre	Siringa
1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Strumenti chirurgici sterili (pinze, vetrini)
Modello intraperitoneale ad alta produttività
Anestesia: Ketamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Sterilizzante a freddo: SafeSept Max	Henry Schein Animal Health	9882765
Etanolo (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Unguento per gli occhi: VitA POS 5 g	Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA pronto-PARTENZA-via!	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard	BioLegend	431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard	BioLegend	431101
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Thermo Fisher Scientific
Soluzione di iodio povidone: Braunol 1000 mL	B. Braun	3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit	Thermo Scientific	9990700	Per la conta cellulare differenziale.
Piastra riscaldante: Physitemp	Rothacher Medical	TCAT-2LV
Emocitometro: Camera Neubauer	Carl Roth	PC72.1
Sutura non riassorbibile: Ethibond Excel 4-0	Ethicon	6683H
Sutura riassorbibile: Polysorb	Covidien	SL-5628
Centrifuga Shandon per citopsina	Thermo Scientific
Siringa sterile monouso 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Tamponi di garza sterili	Henry Schein Animal Health	220192
Aghi sterili: Aghi ipodermici RW 27 G x 3/4'' e 25 G	Henry Schein Animal Health	9003340, 420939
Strumenti chirurgici sterili (bisturi, forbici, pinze, porta aghi)
Soluzione di tripano blu 0,4%	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061
Modello sottocutaneo subcronico
Anestesia: Ketamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)	Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Sterilizzante a freddo: SafeSept Max	Henry Schein Animal Health	9882765
Ethanol (70% vol/vol)	VWR Chemicals	93003.1006
Unguento per gli occhi: VitA POS 5 g	Ursapharm
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific
Soluzione di iodio povidone: Braunol 1000 mL	B. Braun	3864154
Roti-Histofix 4,5% formalina tamponata	Carl Roth	2213.6
Piastra riscaldante: Physitemp	Rothacher Medical	TCAT-2LV
Sutura non riassorbibile: Ethibond Excel 4-0	Ethicon	6683H
Dispositivi di protezione individuale: chirurgici guanti, berretto e maschera, camice	Henry Schein Animal Health	1045073, 1026614, 9009062, 370406
Siringa sterile monouso 1 mL	Henry Schein Animal Health	9003016
Tamponi di garza sterili	Henry Schein Animal Health	220192
Strumenti sterili (bisturi, forbici, pinze, porta aghi)
Ago sterile: Aghi ipodermici RW 27 G x 3/4''	Henry Schein Salute degli animali	9003340, 420939

per il dosaggio della fosfatasi Roche 10010023 di lavaggio 10010023 227261 Piastra di Petri Buehler 10010023105000641575003711140050151401221001002331350010 sterile monouso Tecan 1001002310010023