Articolo metodologico

Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea

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DOI:

10.3791/58077

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16 novembre 2018

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1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

In questo articolo

Sommario

Il numero di nuovi biomateriali ingegnerizzati per la riparazione di lesioni dell'osso grande è in continua espansione con l'obiettivo di migliorare la guarigione ossea e superare le complicazioni connesse con trapianto osseo. Qui, presentiamo una strategia multidisciplinare per test di biocompatibilità pre-clinico di biomateriali per riparazione ossea.

Abstract

Grande pseudoartrosi fratture sono una sfida significativa nell'ambulatorio ortopedico. Anche se auto - e gli innesti dell'osso allogenico sono eccellenti per la guarigione di tali lesioni, esistono potenziali complicazioni con il loro uso. Così, scienziati dei materiali sono lo sviluppo di biomateriali sintetici, biocompatibili per superare questi problemi. In questo studio, presentiamo una piattaforma multidisciplinare per la valutazione di biomateriali per riparazione ossea. Abbiamo unito le competenze da biologia dell'osso e immunologia per sviluppare una piattaforma incluso in vitro degli osteoclasti (OC) e le analisi degli osteoblasti (OB) e in vivo modelli murini di riparazione ossea, immunogenicità e allergenicità. Dimostriamo come eseguire gli esperimenti, riepilogare i risultati e relazione sulla biocompatibilità di biomateriale. In particolare, abbiamo testato la vitalità di OB, differenziazione e mineralizzazione e redditività OC e differenziazione nel contesto dei dischi di β-tricalcio fosfato (β-TCP). Abbiamo provato anche una schiuma di β-TCP/collagene (β-TCP/C) che è un materiale commercialmente disponibile usato clinicamente per la riparazione dell'osso in un modello murino di difetto critico dimensioni osso calvarial per determinare gli effetti sulle prime fasi di guarigione ossea. In esperimenti paralleli, abbiamo valutato le risposte immunitarie e allergiche nei topi. Il nostro approccio genera un profilo di compatibilità biologica di un biomateriale osseo con una gamma di parametri necessari per la predizione della biocompatibilità dei biomateriali utilizzati per la guarigione dell'osso e riparazione nei pazienti.

Introduzione

Riparazione dell'osso è un processo complesso che inizia con la formazione dell'ematoma, infiammazione, callo formazione e rimodellamento quindi1,2. Tuttavia, potenziale di rigenerazione dell'osso è limitata alla dimensione dell'osso frattura1,3. Per esempio, grandi fratture causate da traumi, cancro o l'osteoporosi non possono guarire e sono denominate fratture ossee non sindacale. Queste lesioni ossee richiedono spesso il trattamento per promuovere la rigenerazione e riparazione dell'osso fisiologico sano. Attualmente, il trapianto di osso autologo e allogenico è l'approccio di scelta4 con procedure di sostituzione ossea 2,2 milioni annualmente5. Se queste procedure hanno un alto tasso di successo, ci possono essere complicazioni, ad esempio, la disponibilità limitata di osso, infezione, morbilità del sito donatore e rifiuto4. Nuove alternative per l'ingegneria tissutale ossea vengono ricercate per affrontare queste sfide.

La progettazione di biomateriali basati su polimeri naturali o sintetici, bioceramics o metalli in combinazione con le cellule e molecole bioattive è il luogo6. Nostra attuale comprensione dell'osso fisiologica guarigione e guarigione nel contesto dei biomateriali dipende da molteplici fattori come proprietà meccaniche e molteplici fattori locali e sistematici, compreso le cellule dalla circolazione e luogo di frattura7 ,8,9. Biomateriali per la rigenerazione ossea mirano a promuovere osteogenicity e osteointegrazione10 e sono idealmente biocompatibile, biodegradabile e poroso (promuovere la migrazione cellulare, ossigeno e sostanze nutritive). Hanno anche bisogno di essere sufficientemente forte da sostenere il sito di frattura per alleviare il dolore. Inoltre, fattori infiammatori sono tenuti ad avviare il processo di guarigione. Tuttavia, se il biomateriale induce eccessiva infiammazione e risposte allergiche, questo potrebbe limitare o inibire11,12di guarigione ossea. Così, un approccio interdisciplinare è necessario valutare biomateriali sviluppati per riparazione ossea.

In questo studio, presentiamo una valutazione pre-clinica di materiali rappresentativi, 1) Orthovita Vitoss schiuma che è un sostituto di innesto di osso spongioso commercialmente disponibile composto da fosfato tricalcico composto di dimensioni nanometriche puro β-tricalcio particelle di fosfato (β-TCP) e collagene bovino di tipo 1 (C) (β-TCP/C schiuma) e 2) dischi di β-TCP. Qui illustriamo test di biocompatibilità di questi biomateriali utilizzando primario degli osteoblasti (OB) e dosaggi degli osteoclasti (OC), un modello in vivo di riparazione ossea, una valutazione immunologica che comprende in vitro la proliferazione dei linfociti T e produzione di citochine e in vivo l'immunogenicità e allergenicità, come precedentemente segnalato13.

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Protocollo

Le procedure sono state fatte con topi BALB/c seguendo tutte le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del Ministero austriaco dell'educazione, scienza e ricerca e sono state approvate dal Comitato per l'etica del Ministero austriaco dell'educazione, scienza e della ricerca.

1. principale del Mouse OB cultura

  1. Isolamento di OB da calvaria neonatale del mouse tramite digestione enzimatica
    1. Eutanasia neonatale cuccioli di 1 – 2 giorno vecchio (60 in totale) per decapitazione e posizionate le testine in una capsula di Petri con sterile 1x tampone fosfato salino (PBS).
    2. Tenere la testa per la nuca del collo e tagliare la pelle via con forbici sterili. Incise il calvarium forando esso (circa 0,1 – 0,3 mm) con un paio di forbici che vengono poi inseriti sotto la volta cranica alla nuca alla base del cranio e tagliare lungo il bordo calvarial lateralmente dalla parte posteriore a anteriore sopra le orecchie e quindi abov e il ponte nasale (Figura 1).
    3. Incubare la calvaria dissecata con 8 mL di soluzione di digestione filtro sterilizzato (300 unità/mL collagenasi tipo IV e 2.14 dispase unità/mL II disciolti in α-minimo indispensabile mezzo (α-MEM)) in una provetta conica da 50 mL a 37 ° C per 10 min in un incubatore d'agitazione a 200 scuote / min.
    4. Scartare il surnatante primo e ripetere la procedura di digestione tre volte con 8 mL di soluzione di digestione. Raccogliere il surnatante contenente le celle dopo ogni fase di digestione e aggiungerlo a una provetta conica da 50 mL. Conservare la provetta conica da 50 mL con le cellule in acqua e ghiaccio fino al completamento della procedura di digestione (circa 40 min).
    5. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante (con una pipetta di Pasteur attaccata ad una pompa di vuoto) e risospendere in 40 mL di mezzo di crescita ossea (BGM) contenente α-MEM con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e l'1% soluzione di penicillina-streptomicina. Quindi aggiungere 10 mL della sospensione delle cellule a 4 piastre di coltura tissutale (10 cm).
    6. Fino alla confluenza (2 – 3 giorni) della coltura le cellule a 37 ° C e 5% CO2 .
    7. Punto di confluenza, il vecchio mezzo di aspirare e lavare le piastre di coltura del tessuto una volta con PBS 1X (37 ° C). Poi aspirare il PBS e aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina 1x contenente 0,5% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per ciascuna piastra di coltura del tessuto di 10 cm.
    8. Incubare le piastre 4 coltura a 37 ° C e 5% di CO2 per 5 min e quindi controllare le piastre con un microscopio invertito luce per garantire che le cellule si staccano dalla plastica. Quindi è possibile trasferire tutte le sospensioni cellulari (Totale 8 mL) in una provetta conica 50 mL contenente 10 mL di BGM fresco. Lavare ogni piatto con 5 mL di fresco BGM e trasferimento alla stessa provetta conica 50 mL.
    9. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 16 mL di BGM fresco. Preparare 16 nuovi 10cm coltura tissutale piastre (divisione 1:4) contenente 9 mL di BGM. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare per ogni piatto.
    10. Ripetere i passaggi da 1.1.6. a 1.1.8.
    11. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere in 10 mL di BGM fresco. Contare le celle e calcolare la concentrazione cellulare.
      Nota: Questa procedura genera circa 7,5 – 8,3 x 105 cellule/pup.
    12. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere in congelamento medio contenente 10% dimetilsolfossido (DMSO), α-MEM di 40% e 50% FBS. Trasferire 1,5 mL di sospensione cellulare per cryovials mL 2 per un totale di 2 x 106 cellule per flaconcino.
    13. Flash congelare le fiale in azoto liquido per stoccaggio a lungo termine in un serbatoio di azoto liquido. Utilizzare le celle all'interno di un anno per garantire la piena funzionalità. Utilizzare questi OB primari per la valutazione di proliferazione (punto 1.2), differenziazione (saggi di ALP: passo 1.4., 1.5.) e la mineralizzazione (passo 1.6.) in presenza di biomateriali. Utilizzare queste cellule per la maturazione dei precursori OC osso-zucchino-derivate in co-coltura (punto 2.3).
  2. Analisi di proliferazione di OB
    1. Pre-Incubare dischi di β-TCP di diametro 14 mm in 1 mL di BGM in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h prima aggiunta di piastre di coltura del tessuto standard OBS. uso primari per i controlli e piastre di coltura di sospensione per gli esempi di biomateriali per evitare di adesione delle cellule alla plastica.
    2. Aspirare il mezzo di pre-incubazione e quindi risospendere primario del mouse OBs in BGM. Aggiungere 4.4 x 104 OBs/cm2 sui dischi pre-incubate β-TCP in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti e per il gruppo di controllo, in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti (1 mL/pozzetto). OBs attribuirà la piastra di coltura del tessuto o il biomateriale.
    3. Incubare per 14 giorni a 37 ° C e 5% CO2. Durante il periodo di incubazione, cambiare il mezzo ogni 2 – 3 giorni e aggiungere 1 mL di BGM fresco ad ogni pozzetto.
    4. Per valutare la proliferazione di OB, trasferire i dischi di β-TCP nei giorni 7 e 14 nuovi pozzi per escludere i segnali dalle cellule coltivate sulla piastra di coltura di sospensione.
    5. Aspirare il vecchio mezzo, aggiungere 0,5 mL di BGM (37 ° C) e incubare le piastre di coltura per 30 min a 37 ° C e 5% CO2. Quindi 55 µ l di reagente di proliferazione cellulare: 10x (01:10 diluizione) direttamente nella cultura ben. Per gli spazii in bianco, preparare tre pozzetti contenenti 0,5 mL di BGM e 55 µ l del reagente di proliferazione delle cellule di 10x. Incubare tutte le piastre per 30 min a 37 ° C e 5% CO2.
    6. Prelevare e trasferire 150 µ l del surnatante da pozzetti in una piastra 96 pozzetti nera e leggere fluorescenza con eccitazione a 560 nm ed emissione a 590 nm. Sottrarre le letture in bianco dalle letture del campione.
  3. Saggi di differenziazione e mineralizzazione di OB
    1. Pre-Incubare dischi di β-TCP di diametro 14 mm in 1 mL di BGM in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h prima di aggiungere le piastre di coltura del tessuto standard OBS. uso per controlli e piastre di coltura di sospensione per gli esempi di biomateriali per evitare adesione delle cellule alla plastica.
    2. Aspirare il mezzo di pre-incubazione e quindi risospendere primario del mouse OBs in BGM. Aggiungere 8,8 x 104 OBs/cm2 sui dischi pre-incubate β-TCP in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti e per il gruppo di controllo, in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti (1 mL/pozzetto). OBs attribuirà la piastra di coltura del tessuto o del campione di biomateriale.
    3. Sostituire il RGB con 1 mL di terreno di mineralizzazione osteogenica (MM) contenente BGM, 50 µ g/mL di acido ascorbico e β-glicerofosfato di 5 mM 24 h dopo l'aggiunta del ob di e incubare per 14 giorni a 37 ° C e 5% CO2. Modificare il mezzo ogni 2 – 3 giorni con 1 mL di MM preparata in ciascun pozzetto.
  4. Differenziazione di OB valutata dall'attività della fosfatasi alcalina (ALP) da lisati cellulari
    1. Per misurare l'attività del ALP il giorno 7 dopo l'aggiunta del MM, aspirare il terreno di coltura dai pozzi e poi lavare con 1 mL di PBS 1X sterile (37 ° C). Aspirare accuratamente il PBS per consentire le cellule allegate a rimanere sulla coltura del tessuto plastica o biomateriale e congelare le piastre a-80 ° C.
    2. Dopo 24 h (o fino a 2 settimane), scongelare la piastra di coltura del tessuto e piastra di coltura di sospensione di biomateriale a temperatura ambiente (TA) per preparare per la lisi di OB. Per gli esempi di biomateriali, trasferire i dischi di β-TCP in una nuova piastra di coltura sospensione per escludere le cellule fissate alla piastra. Aggiungere 75 µ l di 1x buffer di lisi delle cellule di entrambe le piastre. Agitare le piastre per 5 minuti su un agitatore a 400 frullati/min.
    3. Trasferire il lysate delle cellule in una microcentrifuga 0,5 mL e centrifugare a 300 x g per 6 min a RT per rimuovere i detriti. Aggiungere 50 µ l del surnatante lisato cellulare del campione ad una piastra 96 pozzetti nera e quindi aggiungere 50 µ l di una soluzione composta da 200 µM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl fosfato (DiFMUP) substrato fluorogenico disciolto in 2 x tampone ALP (pH 10) per pozzetto. Impostare due pozzetti del bianco con 100 µ l di una soluzione di 1:1 contenente 1 tampone di lisi delle cellule di x e 2 x ALP buffer.
    4. Preparare 8 norme di riferimento con 100 μL/pozzetto con la (DiFMU) 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin che vanno da 0,5 a 200 μM sciolto in soluzione di 1:1 contenente 1 tampone di lisi delle cellule di x e 2 x ALP buffer per generare una curva standard di riferimento.
    5. Incubare la piastra nera a 37 ° C per 15 min e poi leggere la fluorescenza con l'eccitazione a 358 nm ed emissione a 455 nm. Sottrarre le letture in bianco da standard di riferimento e letture campione.
    6. Normalizzare l'attività enzimatica ALP dai lisati cellulari alla quantità totale di proteina usando un'analisi colorimetrica per la concentrazione di proteina. Preparare albumina di siero bovino (BSA) tra gli standard con il proteina riferimento a un intervallo compreso tra 0,05 – 2,5 µ g / µ l disciolto in 1x tampone di lisi delle cellule per generare una curva standard.
    7. Preparare il campione lisati cellulari e gli standard di proteina di BSA in duplicati. Aggiungere 5 µ l di cella campione lisata o 5 µ l di proteina BSA standard in una piastra a 96 pozzetti e quindi aggiungere 25 µ l di reagente A' e 200 µ l di reagente B. Set up due pozzetti del bianco con 5 µ l di tampone di lisi delle cellule: 1x. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 15 min e poi leggere l'assorbanza a 690 nm. Sottrarre le letture in bianco da standard di riferimento e letture campione.
  5. Differenziazione di OB valutata dalla macchiatura ALP nella coltura delle cellule
    1. Macchia ALP in OBs coltivate il giorno 7 dopo l'aggiunta di MM su una piastra di coltura del tessuto di controllo e il biomateriale in una piastra di coltura di sospensione.
    2. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti e sostituirlo con 0,5 mL di PBS 1X (37 ° C). Aspirare il PBS e fissare le cellule di incubarle in 0,5 mL di formalina 10% tamponata a temperatura ambiente per 1 min.
    3. Aspirare la formalina 10% tamponata con una pipetta monouso e aggiungere 0,5 mL di tampone di lavaggio (0.05% Tween20 in PBS 1X).
    4. Sciogliere una tavoletta di substrato del (BCIP/NBT) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfato/nitro blu in 10 mL di acqua ultrapura e agitare fino a completa dissoluzione. La soluzione deve essere protetto dalla luce e utilizzata entro 2 h.
    5. Aspirare il tampone di lavaggio e sostituire con 0,5 mL di soluzione di substrato BCIP/NBT e incubare la piastra a temperatura ambiente al buio per 10 min. aspirare la soluzione colorante e con 0,5 mL di tampone di lavaggio.
    6. Trasferire i dischi macchiato β-TCP in un nuovo pozzo e le piastre di ALP-macchiato la scansione con uno scanner piano convenzionale alla macchiatura di ALP record.
  6. Mineralizzazione OB valutata mediante colorazione con Alizarin Red S (ARS)
    1. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti contenenti primario OBs 14 giorni dopo l'aggiunta di MM e lavare due volte con 0,5 mL di PBS 1X a RT. aspirato il PBS e fissare le cellule con l'aggiunta di 0,5 mL del 10% formalina soluzione tamponata a temperatura ambiente per 10 min.
    2. Formalina 10% tamponata con una pipetta monouso di aspirare e lavare due volte con 0,5 mL di acqua ultrapura.
    3. Per gli OB fissi, aggiungere 0,25 mL di soluzione colorante ARS di 40 mM (pH 4.2) dissolto in acqua ultrapura e incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti su un agitatore a frullati 100/min.
    4. Aspirare la soluzione colorante con una pipetta monouso e risciacquare con 1 mL di acqua ultrapura. Ripetere questo passo 5 – 10 volte per rimuovere aspecifici di colorazione.
      Nota: La soluzione di risciacquo deve essere senza colore.
    5. Aspirare l'acqua ultrapura e aggiungere 1 mL di PBS freddo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti su un agitatore a frullati 100/min.
    6. Aspirare il PBS, trasferire i dischi macchiato β-TCP per un nuovo pozzo e scansione le piastre con uno scanner piano per mineralizzazione record.
    7. Aggiungere 0,25 mL di soluzione di cloruro di cetylpyridinium 10% e incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti su un agitatore a 100 frullati/min per estrarre la tintura di ARS.
    8. Trasferire i surnatanti in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 17.000 x g per 5 minuti a TA.
    9. 10% cetilpiridinio cloruro soluzione agli estratti con un rapporto di diluizione di 01:10-01:20 ed aggiungere i campioni (300 µ l) in una piastra a 96 pozzetti inclusi due pozzi a vuoti contenente solo 10% cloruro di cetylpyridinium.
    10. Preparare 7 ARS norme di riferimento che vanno da 4 a 400 µM diluendo l'ARS 40 mM colorazione con soluzione di cloruro di cetylpyridinium 10% di soluzione (pH 4.2) per generare una curva standard.
    11. Aggiungere 300 µ l di standard di riferimento in duplicati per la piastra a 96 pozzetti.
    12. Leggere l'assorbanza dei campioni, gli spazii in bianco e fanno riferimento a norme a 520 nm.
    13. Sottrarre le letture in bianco da standard di riferimento e letture campione.

2. Mouse OB-OC co-coltura per derivare maturo OCs

  1. Preparazione e sterilizzazione delle fette di osso corticale bovino
    1. Segmenti dell'osso dal tessuto circostante di pulire e rimuovere il trabecular dell'osso e del midollo osseo.
    2. Asciugare l'osso a 50 ° C per 24 h.
    3. Tagliare l'osso in blocchi più piccoli e tagliatelo a fette (circa 300 – 350 µm di spessore) utilizzando una bassa velocità sega con una lama di diamante.
    4. Tagliare le fette di 300 – 350 µm in dischi quadratici (1 cm2).
    5. Per pulire i dischi di osso (1 cm2), metterle in un flaconcino di vetro chiudibili a chiave e riempire con acqua distillata. Trasferire il flaconcino di vetro riempito in un bagno ad ultrasuoni e Sonicare per 5 min. Ripetere questa operazione tre volte.
    6. Versare l'acqua distillata, aggiungere etanolo al 70% e Sonicare per 5 min.
    7. Versare fuori l'etanolo al 70% e sostituire con etanolo al 100%.
      Nota: Conservare le fette di osso in etanolo al 100% a 4 ° C fino a 4 settimane.
    8. Irradiare le fette di osso con luce UV per 15 minuti su ogni lato in condizioni sterili. Conservare le fette di osso sterilizzato in una piastra di coltura sterile a temperatura ambiente fino all'ulteriore utilizzo.
  2. Isolamento dei precursori del midollo osseo OC
    1. Eutanasia ingenuo topi BALB/c di 8 – 12 settimane vecchio usando un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
    2. Isolare i precursori OC del midollo osseo da mouse femori e le tibie.
    3. Rimuovere le gambe con forbici sterili dal punto più vicino al corpo all'articolazione dell'anca, tagliare le membra alle articolazioni del ginocchio e della caviglia e rimuovere i tessuti molli con bisturi sterile ed il forcipe. Tagliare l'epifisi. Scovare e sospendere il midollo con 1mL BGM in un piatto di Petri sterili cm 6 utilizzando un ago 27G attaccato ad una siringa da 1mL per ottenere una sospensione cellulare.
    4. Aggiungere la sospensione cellulare in una provetta conica 50 mL, lavare i 6 cm di Petri con 5 mL di BGM e trasferimento alla stessa provetta conica 50 mL. Centrifuga a 350 x g a 4 ° C per 5 min. Risospendere le cellule in mezzo di differenziazione di OC (DM) contenente BGM, 1 nanometro 1,252-vitamina D3 e 1 µM della prostaglandina E2 (1 mL/pozzetto).
      Nota: Un mouse BALB/c fornisce un numero sufficiente di precursori OC per una piastra di coltura 24 pozzetti.
  3. Preparazione di co-coltura del mouse OB-OC con biomateriale
    1. Pre-Incubare 14 mm diametro β-TCP dischi o fette di osso bovino (1 cm2) in 1 mL di BGM in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h prima di aggiungere le celle.
      Nota: Fette di osso bovino sono un gruppo di controllo di substrato fisiologico per studiare la differenziazione di OC in presenza di biomateriali.
    2. Aggiungere 8,8 x 104 cellule/cm2 di primaria OBs sospesa in BGM su biomateriali o l'osso di controllo in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti o ad una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti. Incubare a 37 ° C e 5% CO2 per 24 h.
      Nota: OBs allegare per la plastica o l'osso di biomateriale o bovina.
    3. Aggiungere appena isolato precursori OC del midollo osseo per la 24h in coltura primaria OBs e coltura a 37 ° C e 5% CO2 per 5 giorni. Sostituire il mezzo con preparati OC DM ogni altro giorno. Quindi macchiare OCs per fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP) per valutare la differenziazione di OC.
  4. Valutato da trappola che macchia la differenziazione OC
    1. Per caratterizzare maturo OCs multinucleated, ottenuta dal punto 2.3.3, aspirare il terreno di coltura dalla piastra di coltura del tessuto e la piastra di coltura di sospensione biomateriale e aggiungere 1 mL di PBS 1X (37 ° C). Aspirare il PBS e fissare le cellule di incubarle in 1 mL di soluzione di formalina 10% tamponata a temperatura ambiente per 10 min.
    2. Aspirare la soluzione di formalina 10% tamponata con una pipetta monouso e aggiungere 1 mL di PBS 1X a RT. Ripetere questo passaggio tre volte, quindi aspirare il PBS, sostituire con 1 mL di tampone TRAP (pH 5) e incubare le piastre a 37 ° C per 30 min.
    3. Aspirare il buffer di trappola e aggiungere 1 mL di 1:1 di acetone e 100% di etanolo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 s. rapidamente aspirato l'acetone-etanolo soluzione con una pipetta monouso e asciugare completamente le piastre a TA.
    4. Per la trappola soluzione di colorazione, preparare un 10 mg/mL soluzione di riserva di fosfato naftolo-AS-MX in dissolvenza di N, N-dimetilformammide, 0,6 mg/mL di viola rosso veloce sale nel buffer di trappola e aggiungere 0,1 mL di soluzione di riserva di fosfato naftolo-AS-MX a 10 mL di sale veloce rosso viola nel buffer di trappola.
    5. Aggiungere 1 mL di trappola macchiatura soluzione Incubare la piastra a 37 ° C per 10 min, poi aspirare la trappola macchiatura soluzione e aggiungere 1 mL di acqua ultrapura per arrestare la reazione.
    6. Trasferire i dischi di β-TCP e fette di osso bovino dopo colorazione in un nuovo pozzo, osservare OCs macchiato rosso utilizzando un microscopio ottico (ingrandimento: 10x) ed enumerare TRAP + maturo OCs con tre o più nuclei.

3. dimensioni critiche Mouse difetto Calvarial modello

  1. Iniettare la buprenorfina 0,1 mg/kg per via sottocutanea (s.c.) in topi BALB/c 8 - settimana-vecchi per analgesia.
  2. Anestetizzare i topi con una miscela di 100 mg/kg ketamina e 5 mg/kg i.p. xilazina, aggiungere un gel o pomata per gli occhi per tenerli umidi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a 37 ° C durante l'intera procedura per prevenire l'ipotermia. Valutare la profondità di anestesia di pizzico di punta e coda.
  3. Radere il pelo sulla sommità della testa tra le orecchie e pulire la superficie con 7,5% povidone iodio soluzione e 70% di etanolo.
  4. Fare un'incisione sagittale mediana sulla parte superiore del cranio tra le orecchie con un bisturi sterile per esporre il calvarium e rimuovere il tessuto connettivo pericranium sopra l'osso parietale destra raschiando con un bisturi.
  5. Creare un difetto critico dimensioni nell'osso parietale destra utilizzando un trapano dentale sterile con un diametro di 4 mm (2000rpm) sotto costante irrigazione con soluzione salina normale per intaccare l'osso parietale destro e tagliare attraverso il ectocortex e qualche endocortex.
  6. Per evitare danni al mater di dura, è necessario utilizzare un piccolo ascensore periosteal per sfondare il rimanente endocortex, sollevare l'osso calvarial delicatamente e rimuovere con il forcipe. Il difetto risultante deve essere circolare e circa 3,5 mm di diametro.
  7. Riempire il difetto calvarial con pre-impregnati (sterile in 1X PBS a TA) β-TCP/C schiuma usando il forcipe.
  8. Preparare il numero appropriato di pari età, sham controlli negativi con un difetto vuoto.
  9. Per mantenere il biomateriale in luogo, mettere 0,5 µ l di adesivo del tessuto al bordo del difetto in due punti opposti.
  10. Chiudere la pelle con una sutura non assorbibile.
  11. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con freddo sterilizzante per mantenere condizioni di sterilità prima di eseguire il prossimo intervento chirurgico su un mouse anestetizzato.
  12. Per il trattamento post-chirurgico, collocare gli animali su un piatto di riscaldamento pulito e asciutto a 37 ° C nella zona di chirurgia per monitoraggio appropriato durante il periodo di recupero. Monitorare la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e il colore delle mucose e occhi ogni 10 min fino a quando si svegliano.
  13. Trasferire i topi coscienti operati in una gabbia con cibo e acqua separati dagli altri animali fino al completo recupero. Iniettare la buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. per terapia analgesica post-chirurgica due volte al giorno per 72 h. ritorno completamente recuperato topi nelle loro gabbie.
  14. Per determinare l'efficacia del biomateriale, eutanasia il i.p. di topi con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
  15. Presso post-l'impianto di 8 – 12 settimane, decapitare il mouse eutanasizzato con forbici affilate.
  16. Correzione la testa decapitata del mouse in 30 mL di 4,5% formalina tamponata per 1-2 settimane garantire piena penetrazione del fissativo nel tessuto.
  17. Trasferire le teste in etanolo al 70% per l'archiviazione a lungo termine a 4 ° C fino ad un anno.
  18. Uso micro la tomografia computerizzata (microCT) o tecniche istologiche undecalcified standardizzati per valutare la rigenerazione ossea. È possibile utilizzare microCT scansione su campioni post mortem ad alta risoluzione (90 kV, 4 min) in 2D e 3D sagittale e frontale aerei.
  19. Per istologia undecalcified, disidratare le teste in crescente gradi di etanolo e incorporare in metacrilato di metile glicole.
  20. Tagliare i blocchi di metacrilato di metile-incastonato di glicole con una sega di diamante e macinare le sezioni ad uno spessore di circa 80 – 100 µm.
  21. Valutare Levai Laczko macchiato le sezioni dell'osso per identificare per la formazione di osso nuovo14.

4. in Vitro le risposte immunitarie

  1. Eutanasia ingenuo 8 - settimana-vecchio i.p. di topi BALB/c con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
  2. Posizionare il mouse sul suo lato destro, radere il pelo sul lato sinistro e pulire la pelle sopra la parte sinistra dell'addome con etanolo al 70%.
  3. Fare un 10 mm lunga e profonda incisione 1 mm nella pelle del mouse sul lato sinistro, posteriormente seguendo le costole sopra lo stomaco usando forbici sterili.
  4. Aprire la pelle e quindi esporre il peritoneo. Fare un 10 mm di lunghezza e meno di 1 mm di profondità incisione nel peritoneo con forbici in condizioni sterili.
  5. Spingere lo stomaco prossimale per esporre la milza.
  6. Tenere la milza delicatamente con pinze sterili e rimuoverlo dal taglio tessuti e vasi attaccati di sotto di esso.
  7. Posizionare la milza intatta in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di freddo 1X PBS sterile.
  8. Preparare una sospensione unicellulare di sminuzzare la milza usando 2 pinze sterili o 2 lastre di vetro sterile.
  9. Rimuovere i detriti passandolo attraverso un colino di cella 40 µm sterile con PBS 1X freddo utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 mL.
  10. Centrifugare la sospensione unicellulare a 300 x g per 10 min a 4 ° C in una provetta conica da 50 mL, aspirare e scartare il surnatante. Quindi risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi di globuli rossi (RBC).
  11. Incubare la sospensione cellulare per 14 min a RT e interrompere la reazione aggiungendo 45 mL di terreno di Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
  12. Centrifugare le cellule dopo la lisi cellulare a 300 x g per 10 min a 4 ° C e quindi scartare il surnatante.
  13. Risospendere splenocytes in medium RPMI contenente 10% calore-inattivati FBS, soluzione di penicillina-streptomicina 1%, 0,1% gentamicina, 0,2% ß-mercaptoetanolo e gli amminoacidi non essenziali di 1%.
  14. Pre-Incubare β-TCP/C schiuma in una piastra di coltura sterile 96 pozzetti contenenti medium RPMI per 24 h a 37 ° C e 5% CO2 prima della semina delle cellule.
  15. Aggiungere splenocytes titolato numeri, ad es., 1,25 x 105, 2.5 x 105 e 5 x 105/well per pozzetti in una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti contenenti medium RPMI e additivi, con o senza la schiuma di β-TCP/C pre-incubata.
  16. Aggiungere 10 µ g/mL concanavalina A (raggiro A) disciolti in mezzo per un totale di 100 µ l/pozzetto di appositi pozzetti e poi incubazione a 37 ° C e 5% di CO2 per 72 h.
  17. Misurare la proliferazione delle cellule con un saggio di bromodeossiuridina (BrdU). Aggiungere 10 µ l/pozzetto di soluzione di etichettatura di BrdU a 48 h della coltura delle cellule e quindi incubare la piastra per altre 24 h.
  18. A 72 h, raccogliere il surnatante e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
  19. Aggiungere 200 µ l/pozzetto di soluzione di fissazione ad ogni pozzetto e incubare per 30 min a RT. aspirare la soluzione di fissaggio. Aggiungere 100 µ l/pozzetto della soluzione di lavoro di anticorpo anti-BrdU e incubare per 90 min.
  20. Aspirare la soluzione di anticorpo, lavare i pozzetti tre volte con 200 – 300 µ l/pozzetto di soluzione di lavaggio e rimuovere la soluzione di lavaggio.
  21. Aggiungere 100 µ l di soluzione substrato e incubare per 3 – 10 min a RT, quindi misurare l'assorbanza a 450 nm.
  22. Misura dell'interleuchina-1 β (IL-1 β), l'interleuchina 2 (il-2), interleuchina-4 (IL-4) e l'interferone-γ (IFN-γ) nei surnatanti raccolti usando una ELISA standard.

5. high Throughput intraperitoneale modello

  1. Anestetizzare femmina 6-8 settimane vecchi topi BALB/c con una miscela di 100 mg/kg ketamina e 5 mg/kg i.p. xilazina e aggiungere un gel o pomata per gli occhi per tenerli umidi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a 37 ° C durante l'intera procedura per prevenire l'ipotermia. Valutare la profondità di anestesia di pizzico di punta e coda.
  2. Radere il pelo addominale e pulire con 7,5% povidone iodio soluzione e 70% di etanolo.
  3. Fare un'incisione del midline lungo 8 mm attraverso la pelle lungo la linea alba. Praticare una piccola incisione nel peritoneo usando un bisturi.
  4. PBS sterile luogo intriso di innesti di β-TCP/C schiuma (2 x 2 x 2 mm3) nella cavità peritoneale o senza aggiunto materiali per i topi di controllo di pari età sham.
  5. Sutura del peritoneo e della pelle con il suturare assorbibili e non assorbibili, rispettivamente.
  6. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con freddo sterilizzante per mantenere condizioni di sterilità prima di eseguire il prossimo intervento chirurgico su un mouse anestetizzato.
  7. Per il trattamento post-chirurgico, collocare gli animali su un piatto di riscaldamento pulito e asciutto a 37 ° C nella zona di chirurgia per monitoraggio appropriato durante il periodo di recupero. Monitorare la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e il colore delle mucose e occhi ogni 10 min fino a quando si svegliano.
  8. Trasferire i topi coscienti operati in una gabbia con cibo e acqua separati dagli altri animali fino al completo recupero. Tornare topi completamente recuperati alla loro gabbie.
    Nota: Questa procedura induce dolore minimo. Terapia analgesica post-chirurgica non è solitamente necessaria. Se l'azionamento animali mostrano segni di dolore, inietta buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. o un altro farmaco analgesico appropriato per alleviare il dolore.
  9. post-L'impianto 7 giorni di topi, con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg i.p. xilazina di eutanasia
  10. Presso post-l'impianto di 7 giorni, il lavaggio della cavità peritoneale con un 1 mL siringa con un ago da 25 G per un totale di 3 mL di PBS freddo tenendo premuto il mouse testa e inserire l'ago nel quadrante addominale inferiore sinistro e mirare prossimalmente.
    Nota: Il liquido peritoneale deve essere libero di RBCs.
  11. Centrifugare il liquido di lavaggio peritoneale a 300 x g per 5 min a 4 ° C e raccogliere il liquido peritoneale per conservare a-20 ° C per misure in ELISA di citochine IL-1 β, il-2 e IL-4.
  12. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS contare le cellule peritoneali utilizzando trypan blu su un emocitometro.
  13. Citocentrifuga sospensione delle cellule alle cellule5 5 x 10 a vetrini, lasciare i vetrini asciugare e macchia per un conteggio differenziale delle cellule.
  14. Utilizzando un microscopio ottico, contare un minimo di 300 celle in totale e distinguere tra macrofagi, eosinofili, neutrofili e linfociti.

6. subcronica modello sottocutaneo

  1. Anestetizzare topi BALB/c femmina 6 – 8 settimane vecchio con una miscela di 100 mg/kg ketamina e 5 mg/kg i.p. xilazina, aggiungere gel o pomata per gli occhi per tenerli umidi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a 37 ° C durante l'intera procedura per prevenire l'ipotermia. Valutare la profondità di anestesia di pizzico di punta e coda.
  2. Posizionare il mouse sul dorso, radere il pelo addominale e pulire la superficie rasata con 7,5% povidone iodio soluzione e 70% di etanolo.
  3. Fare un'incisione del midline lungo 8 mm attraverso la pelle lungo la linea alba dell'addome usando un bisturi e poi impianto PBS imbevuto biomateriale (2 x 2 x 2 mm3) sotto la pelle o non aggiungere nessun materiali per i topi di controllo di pari età sham.
  4. Suturare la pelle con una sutura non assorbibile.
  5. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con freddo sterilizzante per mantenere condizioni di sterilità prima di eseguire il prossimo intervento chirurgico su un mouse anestetizzato.
  6. Per il trattamento post-chirurgico, collocare gli animali su un piatto di riscaldamento pulito e asciutto a 37 ° C nella zona di chirurgia per monitoraggio appropriato durante il periodo di recupero. Monitorare la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e il colore delle mucose e occhi ogni 10 min fino a quando si svegliano.
  7. Trasferire i topi coscienti operati in una gabbia con cibo e acqua separati dagli altri animali fino al completo recupero. Tornare topi completamente recuperati alla loro gabbie.
    Nota: Questa procedura induce dolore minimo. Terapia analgesica post-chirurgica non è solitamente necessaria. Se l'azionamento animali mostrano segni di dolore, inietta buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. o un altro analgesico appropriato.
  8. Al momento di esaminare il sito di impianto, eutanasia il i.p. di topi con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
  9. post-L'impianto otto settimane, asportare il sito di impianto con circostante tessuto (1 cm2).
  10. Fissare il tessuto nella soluzione di formalina al 4,5% tamponato durante la notte, incorporare in paraffina e tagliati in 4 sezioni di µm.
  11. Macchia di 4 sezioni di tessuto paraffina-incastonato µm con ematossilina ed eosina (H & E) per infiammazione o di Masson tricromica per fibrosi e deposizione di collagene.

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Risultati

Per valutare la β-TCP per la sua efficacia come un biomateriale per riparazione ossea, abbiamo usato in vitro e in vivo i metodi di screening. In primo luogo, abbiamo misurato le risposte di OB per i dischi di β-TCP rispetto ai comandi da solo medio della linea di base. Nella figura 2 viene illustrato l'attuabilità di OB in risposta ai dischi di β-TCP alle 7 e 14 giorni di cultura. Attuabilità delle cellule misurata da cellule metabolicament...

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Discussione

Qui, ci mostrano un approccio multidisciplinare per la valutazione preclinica di biocompatibilità per biomateriali rappresentante sviluppato per la riparazione e rigenerazione ossea. Abbiamo testato le risposte di OBs, OCs, e la risposta di guarigione in vivo in un difetto critico dell'osso modello in topi come pure in vitro e in vivo le risposte immunitarie. Abbiamo mirato a dimostrare come le analisi lavoro e riepilogare i dati e le conclusioni derivate dall'esame dei biomateriali. Mostriamo ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo progetto di ricerca ha ricevuto finanziamenti settimo programma dell'Unione europea quadro (FP7/2007-2013) sotto la concessione contratto n. 263363.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Biomaterials
β-dischi di fosfato tricalcico (β-TCP, 14 mm)I dischi sono stati sinterizzati in un forno a muffola alla temperatura di 1150 °C. Una descrizione dettagliata della produzione può essere trovata in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). I campioni sono stati irradiati con raggi UV (15 minuti per lato) prima di essere utilizzati in colture cellulari.
Orthovita Vitoss schiuma (β-TCP/C schiuma)Orthovita2102-1405
Coltura di osteoblasti di topo
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4Sciogliere 200 mM di glicina, 2 mM di cloruro di magnesio, 2 mM di cloruro di zinco in acqua ultrapura e regolare a pH 10.
Terreno di crescita ossea (BGM)α-MEM + 10% FBS inattivato termicamente + 1% penicillina/streptomicina
Tampone di lisi cellulare: CyQuant tampone di lisi cellulare 20x concentratoThermo ScientificC7027Diluire il tampone concentrato di lisi cellulare 20 volte in acqua ultrapura. 
Reagente per la vitalità cellulare: Reagente per la vitalità cellulare Presto BlueInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
Collagenasi di tipo IV da clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
Kit per il dosaggio delle proteine DC IIBio Rad5000112Il kit per il dosaggio delle proteine DC contiene il reagente A, il reagente B, il reagente S e BSA per lo standard di riferimento. Per il reagente A', aggiungere 20 µ L reagente S a 1000 µ L. reagente A. 
Dimetilsolfossido (DMSO)Sigma-AldrichD8418Steril-filtro DMSO prima dell'uso.
Dispase II (proteasi neutra, grado II)Kit4942078001
EnzCheck per l'attività della fosfatasi alcalina Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020Il kit per il dosaggio della fosfatasi EnzCheck contiene 6,8-difluoro-4-metilumbelliferil fosfato (DiFMUP), N,N-dimetilformammide e 6,8-difluoro-7-idrossi-4-metilcumarina (DiFMU). 
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-AldrichF7524
Soluzione di formalina tamponata neutra 10%Sigma-AldrichHT501128
GlicinaSigma-AldrichG8898
Cloruro di esadecilpirdinio (cetilpiridinio) monoidratoSigma-AldrichC9002
Acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idratoSigma-AldrichA8960
Cloruro di magnesio esaidratoSigma-AldrichM2670
MEM alfa medio (&alfa;-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
Terreno di mineralizzazione osteogenico (MM)&alfa;-MEM + 10% FBS inattivato a caldo + 1% penicillina-streptomicina + 50 &; g/mL di acido ascorbico + 5 mM di β-glicerofosfato
Penicillina-streptomicina   Sigma-AldrichP4333
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
Tripsina-EDTA (0,5%), senza rosso fenolo (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054Diluire la soluzione madre concentrata 10 volte in 1x PBS.
Tween20Sigma-AldrichP1379
Acqua ultrapura: Acqua per colture cellulari apirogena VWRL0970-500
TamponeAggiungere  0,05% Tween20 a 1x PBS.
Cloruro di zincoSigma-Aldrich1.08816
β-Glicerofosfato sale disodico idratoSigma-AldrichG5422
Piastra per coltura in sospensione a 24 pozzettiGreiner bio-one662102
Piastra per coltura tissutale a 24 pozzettiGreiner bio-one662160
Provetta conica da 50 mLGreiner bio-one227261
Piastra nera a 96 pozzettiGreiner bio-one655076
Piastra trasparente a 96 pozzettiGreiner bio-one655001
Centrifuga: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-Incubatore: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
Unità filtrante monouso FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200Per la filtrazione sterile di soluzioni enzimatiche.
Scanner piano: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro lettore di micropiastreTecan
Provetta per microcentrifuga: Eppendorf provetta safe-lock 0,5 mLVWR20901-505
Provetta per microcentrifuga: Eppendorf tube safe-lock 1,5 mLVWR21008-959
Shaker Swip (orbitale e orizzontale) Edmund Buehler 
Incubatore a scuotimento GFL3032GFL 3032
Pipetta monouso: pipetta per sieroGreiner bio-one612301
Strumenti sterili (forbici, pinzette, pinze curve)
Piastra per coltura tissutale (10 cm)Greiner bio-one664960
Co-coltura di osteoblasti-osteoclasti di topo
1α,25- Diidrossivitamina D3Sigma-Aldrich179361000x stock concentrato (10 µ M in etanolo 100%)
AcetoneVWR Chemicals22065.327
Terreno di crescita ossea (BGM)α-MEM + 10% FBS inattivato a caldo + 1% penicillina-streptomicina
Acqua distillataCarl Roth3478.4
Etanolo (100% vol/vol)VWR Chemicals20821.365
Etanolo (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Sale LB rosso viola veloceSigma-AldrichF3381
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-AldrichF7524
Soluzione di formalina tamponata neutra 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM alpha Medium (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N,N-DimetilformammideSigma-AldrichD4551
Naftolo AS-MX fosfatoSigma-AldrichN4875
Terreno di differenziazione degli osteoclasti (DM)&alfa;-MEM + 10% FBS inattivato a caldo + 1% penicillina-streptomicina + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 + 1 &; M prostaglandina E2 
Penicillina-streptomicina Sigma-AldrichP4333
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Prostaglandine E2 (PGE2)Cayman Chemical Company90030161000x stock concentrato (1 mM in etanolo 100%)
Acetato di sodio triidratoSigma-AldrichS7670
Tartrato di sodio bibasico diidratoSigma-AldrichS8640
Strumenti sterili (forbici, pinze, bisturi)
TRAP tampone pH 5,0Sciogliere 40 mM di acetato di sodio, 10 mM di tartrato di sodio in acqua ultrapura e regolare a pH 5.
Acqua ultrapura: Acqua per colture cellulari apirogenaVWRL0970-500
Piastra per coltura in sospensione a 24 pozzettiGreiner bio-one662102
Piastra per coltura tissutale a 24 pozzettiGreiner bio-one662160
Provetta conica da 50 mLGreiner bio-one
Centrifuga: VWR Mega Star 600RVWR
Incubatore a CO2: HeraCell 240Thermo Scientific
Lama per wafer diamantata (10,2 cm x 0,3 cm)Sega a bassa velocità Buehler
Isomet
(6 cm)Greiner bio-one628.161
Tappo a vite Flacone in vetro 20 mLCarl RothEXY4.1
Siringa sterile monouso 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Pipetta monouso: pipetta per sieroGreiner bio-one612301
Ago sterile: Ago ipodermico RW 27 G x 3/4''Henry Schein Animal Health9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq)Richter Pharma AG
Anestesia: Ketamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Sterilizzante a freddo: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Etanolo (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Unguento per gli occhi: VitA POS 5 gUrsapharm
Soluzione salina normale (soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%)Fresenius Kabi
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Soluzione di iodio povidone: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5% formalina tamponataCarl Roth2213.6
Adesivo tissutale: Histoacryl 5 x 0,5 mL B. Braun Surgical1050060
Dispositivi di protezione individuale: guanti chirurgici, berretto e maschera, camiceHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Strumenti sterili (bisturi, forbici, pinze, porta aghi)
Aghi sterili: aghi ipodermici RW 27 G x 3/4'' e 30 G x 1/2''Henry Schein Animal Health9003340, 9003630
Siringa sterile monouso 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Piastra riscaldante: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Tamponi di garza steriliHenry Schein Animal Health220192
Bisturi monouso sterile (Figur 20)Henry Schein Animal Health9008957
Trapano chirurgico/dentale: Implantmed SI-923W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
Manipolo tipo S-IIW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
Trephine, diametro 4 mmHager& Meisinger GmbH229040
Set di tubi per irrigazione 2,2 mW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
Elevatore periostale 2 mm / 3 mmHenry Schein Animal Health472683
Sutura non riassorbibile: Poliestere verde, DS19, met. 1,5, USP 4/0 75 cmHenry Schein Animal Health300715
In vitro risposte immunitarie
Anestesia per l'eutanasia: Ketamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Proliferazione cellulare ELISA, BrdU (colorimetrico) Kit di dosaggioSigma-Aldrich11647229001Il kit contiene la soluzione di marcatura BrdU, la soluzione di fissazione (FixDenat), la soluzione anticorpale Anti-BrdU, il tampone di lavaggio e la soluzione di substrato.
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
Terreno di coltura splenocitiRPMI medium + 10% FBS inattivato a caldo + 1% soluzione di penicillina-streptomicina + 0,1% gentamicina + 0,2% ß-mercaptoetanolo + 1% aminoacidi non essenziali
Etanolo (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Siero fetale bovino (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp;
GentamicinaGibco, Thermo Fisher Scientific 
Mouse IL-1β ELISA pronto-PARTENZA-via!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Mouse IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Mouse INF-γ ELISA MAX StandardBioLegend430801
Soluzione di aminoacidi non essenzialiGibco, Thermo Fisher Scientific 
Penicillina-streptomicinaGibco, Thermo Fisher Scientific 
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
tampone per la lisi dei globuli rossi (RBC): BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 medium, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
β-MercaptoetanoloGibco, Thermo Fisher Scientific 
provetta conica da 50 mLGreiner bio-one227261
piastra per coltura tissutale a 96 pozzettiGreiner bio-one655180
Centrifuga: VWR Mega Star 600RVWR
Cell strainer 40 &; mBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro Lettore di micropiastreSiringa
1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Strumenti chirurgici sterili (pinze, vetrini)
Modello intraperitoneale ad alta produttività
Anestesia: Ketamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Sterilizzante a freddo: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Etanolo (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Unguento per gli occhi: VitA POS 5 gUrsapharm
Mouse IL-1β ELISA pronto-PARTENZA-via!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Mouse IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Soluzione di iodio povidone: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining KitThermo Scientific9990700Per la conta cellulare differenziale.
Piastra riscaldante: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Emocitometro: Camera NeubauerCarl RothPC72.1
Sutura non riassorbibile: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Sutura riassorbibile: PolysorbCovidienSL-5628
Centrifuga Shandon per citopsinaThermo Scientific
Siringa sterile monouso 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Tamponi di garza steriliHenry Schein Animal Health220192
Aghi sterili: Aghi ipodermici RW 27 G x 3/4'' e 25 GHenry Schein Animal Health9003340, 420939
Strumenti chirurgici sterili (bisturi, forbici, pinze, porta aghi)
Soluzione di tripano blu 0,4%Gibco, Thermo Fisher Scientific 15250061
Modello sottocutaneo subcronico
Anestesia: Ketamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Sterilizzante a freddo: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Ethanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Unguento per gli occhi: VitA POS 5 gUrsapharm
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Soluzione di iodio povidone: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5% formalina tamponataCarl Roth2213.6
Piastra riscaldante: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Sutura non riassorbibile: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Dispositivi di protezione individuale: chirurgici guanti, berretto e maschera, camiceHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Siringa sterile monouso 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Tamponi di garza steriliHenry Schein Animal Health220192
Strumenti sterili (bisturi, forbici, pinze, porta aghi)
Ago sterile: Aghi ipodermici RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Salute degli animali9003340, 420939
per il dosaggio della fosfatasi Roche 10010023 di lavaggio 10010023 227261 Piastra di Petri Buehler 10010023105000641575003711140050151401221001002331350010 sterile monouso Tecan 1001002310010023

Riferimenti

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076(2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585(2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

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