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Articolo metodologico

Dinamica proteomica e miRNA analisi di polisomi da Mouse cuore dopo Langendorff aspersione isolata

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DOI:

10.3791/58079

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29 agosto 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per eseguire polisoma profilatura sul cuore isolato e perfuso del mouse. Descriviamo i metodi per aspersione di cuore, polisoma profiling e l'analisi delle frazioni polisoma rispetto al mRNA, Mirna e il proteoma polisoma.

Abstract

Gli studi in cambiamenti dinamici nella traduzione della proteina richiedono metodi specializzati. Qui abbiamo esaminato i cambiamenti in proteine appena sintetizzate in risposta all'ischemia e riperfusione usando il cuore isolato e perfuso del mouse accoppiato con profilatura polisoma. Per capire meglio i cambiamenti dinamici nella traduzione della proteina, abbiamo caratterizzato i mRNAs che sono stati caricati con i ribosomi citosolici (poliribosomi o polisomi) e anche recuperato polisomi mitocondriale e rispetto distribuzione mRNA e proteina nella le frazioni ad alta efficienza (numerosi ribosomi attaccati al mRNA), basso-efficienza (meno ribosomi allegati) che comprendeva anche polisomi mitocondriale e le frazioni non tradurre. Mirna possono anche associare mRNAs che vengono tradotti, riducendo così l'efficienza della traduzione, abbiamo esaminato la distribuzione dei miRNA attraverso le frazioni. La distribuzione dei mRNAs, Mirna e proteine è stata esaminata in condizioni basali irrorate, alla fine di 30 min di ischemia globale no-flusso e dopo 30 min di riperfusione. Qui presentiamo i metodi utilizzati per realizzare questa analisi — in particolare, l'approccio all'ottimizzazione dell'estrazione di proteine dal gradiente di saccarosio, come questo non è stato descritto prima — e fornire alcuni risultati rappresentativi.

Introduzione

Il cuore risponde al pregiudizio di ischemia (I) e di riperfusione (R) in modo dinamico. Tuttavia, non esiste una visione poco in cambiamenti acuti nella sintesi delle proteine durante la risposta. Per risolvere questo problema, abbiamo approfittato del metodo consolidato di polisoma profilatura1 per identificare le modifiche in abbondanza di proteine che riflettono la ridistribuzione dei ribosomi e fattori di regolazione traduzionale dal citosol di polisomi, e la aumento di proteine recentemente sintetizzati (NSP). Nell'impostazione di I / R, l'aumento nella sintesi di nuove proteine avviene in un lasso di tempo che non è coerente con la trascrizione di mRNA nuovo2; Inoltre, discordanza tra i livelli di espressione di mRNA e proteina abbondanza è stato segnalato3. Per queste ragioni, abbiamo scelto di analizzare i cambiamenti nel proteoma dinamico come riflesso dalla traduzione della proteina. Per fare questo, abbiamo quantificare mRNA nelle frazioni polisoma e analizzare la composizione della proteina nelle frazioni polisoma. Infine, perché i microRNA (miRs) regolano la disponibilità dei mRNAs per traduzione e possono interferire con l'efficienza di proteina traduzione4,5, abbiamo esaminato la distribuzione di Mir nelle frazioni polisoma, concentrandosi sulla risposta a I / r.

Abbiamo scelto di utilizzare il modello di aspersione di isolato mouse Langendorff e tessuto raccolto in condizioni basali della perfusione continua, dopo ischemia globale di no--flusso 30 min e dopo 30 min di ischemia seguita da 30 min di riperfusione. Abbiamo poi solubilizzato il tessuto cardiaco e separato polisomi sopra un gradiente di saccarosio, seguita da analisi proteomica e rivelazione selettiva del mRNA e Mirna mediante PCR e microarray, rispettivamente. Questa combinazione di metodi rappresenta un approccio potente per comprendere il proteoma dinamico, consentendo la rilevazione simultanea di mRNA, miRNA e NSP, così come la ridistribuzione delle proteine regolatrici, miRNA e mRNA tra le frazioni di nontranslating, bassa efficienza polisomi e ad alta efficienza polisomi (Vedi Figura 1). Intuizioni la regolazione dinamica di questo processo saranno esteso da un'ulteriore analisi della fosforilazione di fattori regolatori chiave quali eIF2α o mTOR. Questi singoli passi ora sono descritti dettagliatamente.

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Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati effettuati in conformità alle linee guida istituzionali e approvati dalla istituzionale Animal Care e utilizzare Comitato del Cedars-Sinai Medical Center.

1. Langendorff aspersione del Mouse cuore

  1. Aspersione di Langendorff del cuore del topo con ischemia e riperfusione
    1. Amministrare intraperitoneale sodio pentobarbital 70 mg/kg per il topo adulto (8-settimana-vecchio, Maschio, C57BL6/j). Confermare l'anestesia profonda mancanza di recesso alla punta pizzico.
    2. Anticoagulate con eparina intraperitoneale 500 U/kg.
    3. Aprire lo scrigno via incisione sternale. Aprire il diaframma e tagliare lungo il bordo costiero all'asse ascellare anteriore. Quindi, tagliare l'asse ascellare anteriore fino alla zampa anteriore di aprire completamente la gabbia toracica. Dopo, visualizzando il cuore, morsetto dell'aorta ascendente con il forcipe e asportare rapidamente il cuore. La morte è a causa del dissanguamento. Mettere il cuore in freddo Krebs (NaCl, KCl, 6,9 g/L 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, glucosio 2G/L e CaCl2 0,373 g/L).
    4. Incannulare l'aorta con un ago smussato-punta e irrorare il cuore retrogradely con soluzione di Krebs in modalità pressione costante.
    5. Dopo un periodo di stabilizzazione di 15 min, sottoporre il cuore a una ischemia globale no-flusso per 30 min seguita da riperfusione per 30 min.
    6. Raccogliere cuori dopo perfusione basale 15 min, dopo 30 min di ischemia o dopo 30 min di riperfusione. Tagliare gli atri e il tessuto snap-congelamento in azoto liquido.
    7. Conservare a-80 ° C fino all'utilizzo

2. tessuto omogeneizzazione, solubilizzazione e saccarosio densità gradiente sedimentazione

  1. Preparazione di gradiente
    1. Preparare 2 soluzioni (15% e 50%) di saccarosio 100ml, miscelazione 4 mL di NaCl 2.5 M;
      0,8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL di Tris-HCl 1 M, pH 7.5; 15 g o 50 g di saccarosio (15% e 50%, rispettivamente); acqua ultrapura per raggiungere 100 mL; e xilene cianolo (0,02 mg/mL) di soluzione al 15% di colore
    2. Filtrare ogni soluzione (0,22 µm filtri)
    3. Il giorno che il gradiente deve essere utilizzato, preparare 40 mL di ciascuna soluzione di saccarosio e aggiungere cicloesimmide a ogni soluzione per ottenere la concentrazione finale di 100 µ g/mL
      1. Utilizzare un creatore di gradiente per preparare un mix tra le soluzioni di saccarosio 15% e 50%
      2. Riempire il vano sinistro con 5 mL del gradiente di saccarosio 15%
      3. Riempire il vano destro con il gradiente di saccarosio al 50%
      4. Aprire il rubinetto e accendere la pompa per mescolare i due piccoli vani con agitatore magnetico
      5. Uso un tubo collegato al rubinetto secondo per consentire la soluzione di saccarosio misto a fluire in un ultra-centrifugazione tubo con pareti sottili. Volume finale sarà circa 10 mL.
    4. Conservare le pendenze a 4 ° C (durante la notte se necessario, ma non di più)
  2. Omogeneizzazione del tessuto del cuore
    1. Omogeneizzare il cuore fresco o congelato con un polytron in tampone di lisi filtrata (modificato per il frazionamento di gradiente di saccarosio) contenente 100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4% NP-40. Sono cicloesimmide 100 µ g/mL per mantenere la struttura polisoma, 0.1 U RNasi inibitore e inibitore della proteasi cocktail (1 compressa per 50 mL).
    2. Incubare il lisato di ghiaccio in 15 min.
    3. Centrifugare a 18.000 x g per 15 min a 4 ° C per rimuovere il materiale insolubile e raccogliere il surnatante.
    4. Riserva 50 µ l per la determinazione della proteina, isolamento del RNA e analisi di integrità di RNA (Vedi Figura 2).
    5. Il surnatante (500 – 100 µ l) di strato in cima le pendenze e bilanciare i tubi con tampone di lisi.
  3. Sedimentazione e raccolta delle frazioni
    1. Eseguire ultracentrifugazione per 120 min a 37.000 giri/min a 4 ° C in un rotore oscillante. Secondo il costruttore, corrisponde a 228.000 x g a raggio massimo.
    2. Raccogliere ogni sfumatura come 17 frazioni (frazione di circa 600 µ l ciascuna) in microcentrifuga con monitoraggio continuo dell'assorbanza a 254 nm (OD254).
    3. Programma il collettore di frazione come segue:
      1. Scartare i primi 3 min della collezione (corrispondente al liquido contenuto nelle provette prima il gradiente)
      2. Da 4 a 19 min, raccogliere le frazioni alla velocità di 1 mL/min in 17 frazioni.
    4. Mettere le frazioni sul ghiaccio appena ognuno è raccolto. Congelare i campioni a-80 ° C, se non vengono elaborati immediatamente. Una tipica analisi densitometrica UV della sfumatura come sono stati raccolti è illustrato nella Figura 1.

3. isolamento ed analisi di mRNA da polisoma e frazioni Nontranslating

  1. Estrazione del mRNA
    1. Scongelare le frazioni sul ghiaccio, se fossero flash-congelato dopo la raccolta
    2. 200 µ l di ciascuna frazione di trasferimento in una nuova provetta
      Nota: A questo punto, due o più frazioni consecutive possono essere riunite insieme. Dovrebbe essere fatto con attenzione dopo aver analizzato il grafico di254 OD in modo che non si mescolano frazioni polisoma e non-polisoma.
    3. Aggiungere 10 ng di luciferasi RNA come controllo interno per ogni campione per scopo di normalizzazione.
      Nota: Gli iniettori Luciferase dovrebbero essere utilizzati come controllo interno per normalizzare i risultati.
    4. Aggiungere 700 µ l di reagente di estrazione RNA (monofasica soluzione di fenolo e guanidina isotiocianato; Vedi Tabella materiali) in ogni provetta. Mescolare bene e incubare le provette per 5 min a RT (temperatura ambiente).
    5. Aggiungere 140 µ l cloroformio e vortex per 15 s. Incubare per 2-3 minuti a TA.
    6. Centrifugare i campioni per 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    7. Trasferire con cautela la fase acquosa superiore ad un nuovo tubo.
    8. Poiché il contenuto di RNA delle frazioni non è elevato, è possibile aggiungere 10 µ g di glicogeno come elemento portante ad ogni provetta.
    9. Aggiungere 350 µ l isopropanolo in ogni provetta. Mescolare bene e incubare a-20 ° C per 1 h aumentare il rendimento.
    10. Centrifuga per 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    11. Scartare il surnatante ed aggiungere 700 µ l di etanolo 75% per lavare la pallina del RNA.
    12. Centrifugare per 5 min a 7.500 x g a 4 ° C.
    13. Eliminare l'etanolo e lasciare asciugare per 10 – 15 min l'aria di pellet.
      Nota: Sovra il pellet di RNA impedirà la sua completa solubilizzazione in acqua.
    14. Risospendere il pellet di RNA in 50 μL di RNAsi-libera ultrapura H2O.
    15. Incubare i campioni per 10 min a 55 ° C.
    16. Utilizzare 2 µ l di ogni campione per misurare la qualità e la quantità di RNA estratto e memorizzare il resto a-80 ° C.
  2. QPCR e trascrizione d'inversione
    1. Utilizzare 4 μL di sintesi del cDNA di trascrizione inversa kit (Vedi Tabella materiali) per una reazione di 20 μL. Preparare il supermix secondo il numero di campioni. Trasferire il volume richiesto in ogni provetta e aggiungere 5 μL di input RNA in ogni provetta. Questo volume può essere corretto per essere rilevanti per la gamma delle condizioni di lavoro della polimerasi di Taq.
    2. Incubare le provette in un termociclatore con il seguente programma consigliato dal fabbricante: 5 min a 25 ° C, 20 min trascrizione inversa per 20 min a 46 ° C e l'inattivazione della trascrittasi inversa per 1 min a 95 ° C.
    3. Eseguire qPCR con il programma ottimizzato per ogni coppia di primers.
      Nota: Per rilevare la presenza di alcuni mRNA in frazioni, volume uguale da ogni frazione (del RNA isolato) dovrebbe essere usato per trascrizione inversa.
  3. Analisi dei risultati
    1. Utilizzare il valore di Ct del gene interessato e la luciferasi per calcolare i valori di Ct di delta
    2. Esprimere ogni delta frazione valore Ct in percentuale del valore totale mRNA contenuta in tutte le frazioni per visualizzare la distribuzione del mRNA attraverso le diverse frazioni (tabella 1)

4. isolamento ed analisi di Mirna da polisoma frazioni e frazioni Nontranslating

  1. Estrazione del mRNA e miRNA
    Nota: Questo protocollo segue le istruzioni del produttore, con poche modifiche.
    1. Scongelare il glicogeno e il controllo di spike. Tenere il ghiaccio.
    2. Aggiungere 700 µ l di reagente di estrazione di miRNA a 200 µ l di campione.
    3. Aggiungere 1 µ g / µ l di glicogeno e omogeneizzare utilizzando la pipetta. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
    4. Aggiungere 3,5 µ l di 1,6 x 108 spike-in controllo e mescolare.
    5. Aggiungere 200 µ l di cloroformio e vortex per almeno 15 sec.
    6. Incubare per 3 min a temperatura ambiente.
    7. Centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C.
    8. Utilizzando una pipetta, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL. Scartare le fasi medio e inferiore.
    9. Aggiungere 1,5 x volume di etanolo al 100% il surnatante e mescolare.
    10. Trasferire 700 µ l di questa miscela la colonna di estrazione di miRNA e centrifugare esso a tutta velocità per 15 s a RT e scartare il flusso continuo; Ripetere questo passaggio con qualsiasi campione rimanente.
    11. Aggiungere 700 µ l di tampone 1 nella colonna ed e centrifugare a piena velocità per 15 s a RT; scartare il flusso continuo.
    12. Aggiungere 500 µ l di tampone di 2 nella colonna ed e centrifugare a piena velocità per 15 s a RT; scartare il flusso continuo.
    13. Aggiungere 500 µ l di etanolo di 80% nella colonna ed e centrifugare a piena velocità per 2 min a RT; scartare il flusso continuo.
    14. Trasferire la colonna per tubo un nuovo mL 2 scoperchiata, aprire il coperchio ed e centrifugare a RT per 5 min a pieno regime; scartare il flusso continuo.
    15. Aggiungere 16 µ l di acqua RNAsi-libera per la colonna e la centrifuga e a piena velocità per 1 minuto al RT. tenere l'eluato sul ghiaccio o conservare a-80 ° C per le analisi future.
      Nota: Due microlitri di ogni campione possono essere utilizzati per l'analisi di OD.
  2. Trascrizione inversa
    1. Preparare il ghiaccio. Per ogni reazione di RT-PCR di 20 µ l, aggiungere 4 µ l di buffer di RT di miRNA, 2 µ l di acidi nucleici, 9 µ l di RNA totale, 2 µ l di enzima e 3 µ l di acqua RNAsi-libera; mescolare e rallentare brevemente.
    2. Impostare il termociclatore come segue:
      37 ° C per 60 min;
      95 ° C per 5 min;
      Tenere premuto 4 ° C.
    3. Togliere le provette dal termociclatore e aggiungere 200 µ l di acqua RNAsi-libera. Conservare a-20 ° C o procedere per la PCR in tempo reale.
  3. PCR in tempo reale
    Nota: Questo protocollo segue 96 piastra ben formato. Preparare la miscela di reazione sul ghiaccio.
    1. Preparare la miscela di reazione PCR e aggiungere cDNA (da Mirna sopra) secondo l'intervallo accettato dal protocollo. Le reazioni multiple possono essere preparate in batch.
    2. Aggiunta di un totale di 25 µ l di miscela di PCR + cDNA in ciascun pozzetto.
    3. Sigillare la piastra con un sigillo di piatto ottico.
    4. Centrifugare la piastra per 1 min a 1.000 x g a temperatura ambiente.
    5. Programma il ciclatore in tempo reale come segue:
      Gradino di attivazione iniziale a 95 ° C per 15 min;
      3-passo ciclismo: denaturazione a 94 ° C per 15 s; ricottura a 55 ° C per 30 s; estensione a 70 ° C per 30 s (eseguire la raccolta di dati di fluorescenza); aggiungere 40 cicli;
      Curva di fusione secondo predefinito cycler.
  4. Analisi comparativa
    1. Esempio di normalizzazione (Vedi tabella 2):
      1. Trovare il valore minimo di SCM.
      2. Normalizzare tutti i valori SCM per questo minimo.
      3. Sottrarre questo valore dai valori Ct di Mirna di interesse (MOI) e gene di riferimento (REF).
      4. Analizzare i dati utilizzando la formula di 2-ΔCt .

5. analisi proteomica

  1. Estrazione di proteine da frazioni polisoma
    1. Combinare le frazioni di saccarosio raccolti in tre frazioni finale. Contrassegnare le frazioni pesanti (polisomi ad alta efficienza in frazioni raccolte, 4, 5, 6 e 7 con la più alta concentrazione di saccarosio; fondo della provetta del gradiente), luce (polisomi bassa efficienza in frazione Pool 8, 9, 10 e 11; metà della tubo di gradiente) e non-tradurre (frazioni raccolte 12, 13, 14 e 15 con la più bassa concentrazione di saccarosio; superiore del tubo gradiente). Eseguire analisi della proteina di frazioni raccolte.
    2. Stock di 100% di acido tricloroacetico (TCA) di preparare e conservare a 4 ° C nel buio. Mescolare 0,5 mL di campione con 60 µ l di 100% TCA e incubare a-20 ° C durante la notte al buio.
      Nota: Utilizzare tubi di ritenzione proteica basso 1.5 mL (Vedi Tabella materiali).
    3. Dopo l'incubazione overnight, scongelare il campione sul ghiaccio e centrifugare a 15.000 x g, 4 ° C per 30 min. Discard surnatante.
      Nota: 100 µ g di proteina totale nel campione dà a pellet proteina visibile nella parte inferiore del tubo.
    4. Pre-chill acetone nel congelatore a-20 ° C. Aggiungere 0,5 mL di acetone freddo al pellet di proteina e centrifugare a 15.000 x g, 4 ° C per 15 min. Discard surnatante. Ripetere questo passaggio due volte.
    5. Asciugare all'aria il pellet. Risospendere il pellet in 360 µ l di tampone di 50 mM Tris-HCl (pH 8).
      Nota: Se necessario, utilizzare un sonicatore impulso per risospendere il pellet.
    6. Aggiungere 40 µ l di ditiotreitolo 0,1 M (concentrazione finale 10 mM) e incubare a 55 ° C su agitatore per 45 min. aggiungere 50 µ l di 0.15 M iodoacetamide (concentrazione finale 17 mM) e incubare a temperatura ambiente su agitatore per 30 min nel buio.
    7. Preparare la soluzione di tripsina: risospendere 20 µ g di tripsina in 100 µ l di bicarbonato di ammonio di 50 mM. Aggiungere il corrispondente volume di soluzione di tripsina al campione alle 01:50 (w/w) rapporto di tripsina: proteine, assicurarsi che il pH è 8 e incubare su agitatore a 37 ° C durante la notte.
      Nota: Aggiungere il bicarbonato di ammonio 1 M per portare il pH a 8.
    8. Dopo digestione della tripsina, raffreddare il campione, centrifugare brevemente nella centrifuga panca, aggiungere 10% acido formico a pH 2 – 3 per placare l'attività della tripsina e procedere con il campione di desalificazione.
      Nota: Utilizzare µ-eluizione piastra per esempio desalificazione.
    9. Condizione l'assorbente nei pozzetti della piastra ben 96 con 200 µ l di metanolo utilizzando vuoto tre volte seguito da condizionata da 200 µ l di acido formico 0.1% tre volte. Esempio di caricare ed eseguire un lavaggio di esempio utilizzando 200 µ l di acido formico 0.1% tre volte. Eluire il campione con 100 µ l di acido formico al 50% acetonitrile/0.1% due volte in provetta di 0,5 mL di proteina bassa ritenzione.
      Nota: Eluire il campione lentamente in un primo momento utilizzando gravitazione seguita da basso vuoto.
    10. Evaporare l'eluato campione utilizzando concentratore e sia direttamente svolgere analisi di spettrometria di massa o negozio a-80 ° C fino all'utilizzo.
  2. Analisi di spettrometria di massa
    1. Ricostituire ogni pastiglia (costituito da peptidi triptici) a 50 – 100 µ l e iniettare 1 µ l in spettrometro di massa.
      Nota: Ottimizzare la ricostituzione e l'iniezione di volumi per ottenere la massima intensità di segnale LC/MS/MS. Nel nostro caso, il segnale massimo (totale corrente di ioni; TIC) nel cuore della scansione era nella gamma di 1E8 a 2E9.
    2. Utilizzare una trappola colonna C18 (300 µm i.d. x 5 mm, 5 µm, 100Å) seguita dalla separazione del peptide utilizzando colonna C18 (75 µm i.d. x 250 mm, 2 µm, 100Å) con una regolazione della portata a 300 nL/min impostare la temperatura capillare di nano-fonte a 275 ° C e la tensione di spruzzo a 2 kV.
    3. Applicare una sfumatura lineare B 5 – 35% per 90 min, 35 – 95% B per 3 min, tenendo al 95% B per 7 min e l'equilibratura a 5% B per 25 min (r: 0,1% acido formico/acqua e b: 0,1% acido formico in acetonitrile). Acquisire spettri di MS2 per gli ioni di intensità massimi 15 da ogni scansione MS1 utilizzando modalità di CID. Spettrometria di massa di uso 3 replica per ogni campione analizzato.
      Nota: Ottimizzare e utilizzare le condizioni sperimentali e i parametri che sono adatti per i vostri campioni sullo strumento particolare spettrometria di massa. Le condizioni o i parametri menzionati nella sezione 5.2. sono stati utilizzati e ottimizzati nel nostro laboratorio.
  3. Proteina identificazione/quantificazione
    1. Dopo l'analisi di spettrometria di massa, è possibile convertire i file raw spettri in mzXML compatibile file utilizzando software di MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. Invia i file convertiti in motore di ricerca SEQUEST con i criteri di ricerca, ad esempio, i database del mouse UniProtKB/Swiss-Prot (più aggiornato recensione canonico); digest di semi-enzima utilizzando tripsina (dopo KR /-); fino a 2 perso fenditure; intervallo di massa precursore: 400 a 4.500 amu; modifica statica: carbamidomethyl (C) 57,021465 amu; tolleranza di massa del peptide: 50 ppm; frammento di massa tipo: monoisotopic.
      Nota: Altre condutture di proteina database ricerca motori e dati possono essere utilizzati. Se utilizza database per es. ratto, che è meno completo rispetto ai database per mouse e umani, potrebbe essere necessario cercare contro mouse (e/o umani) database per aumentare la copertura del proteoma. In questo caso, ridondanza nei nomi di proteine dovrà essere rimosso.
    3. Eseguire un'analisi post-ricerca. Impostare i filtri per visualizzare i dati. Ad esempio, impostare una probabilità di proteine minimo (soglia di proteina) come 95% o 99%, vale a dire, verranno visualizzate solo le proteine per cui un'analisi statistica implica 95% o 99% di probabilità di essere presenti nel campione. Impostare il filtro per la soglia del peptide (ad es., 95%), vale a dire, una probabilità minima che verrà utilizzato nella determinazione se un spettro identifica un peptide. Seleziona il numero minimo di peptidi che determinerà se una proteina è presente (2 peptidi come minimo per l'identificazione delle proteine è consigliato).
    4. Valutare le proteine identificate per quantità e qualità. Assicurarsi che proteotypic peptidi vengono utilizzati per la quantificazione. Se viene identificata la isoforma garantire che si basi sull'osservazione di un peptide triptico composto da una sequenza di amminoacido univoco per l'isoforma specifica. Qualsiasi "simile a" o ipotetiche proteine devono essere sottoposti a confronto per vedere se l'osservato peptidi corrispondono ad una proteina conosciuta.

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Risultati

analisi del mRNA
risultati di mRNA possono essere espressa come una distribuzione di un particolare mRNA in ogni frazione (Figura 3A); per la quantificazione, combinare polyribosomal traduzione frazioni e confrontarlo con la frazione non-tradurre (Figura 3B), che presentano un rapporto di abbondanza del mRNA nella traduzione al nontranslating frazioni. Ulteriori informazioni sono maturate esaminando le frazioni di alt...

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Discussione

Analisi del profilo polisoma consente lo studio della traduzione della proteina analizzando lo stato traduzionale di un mRNA specifico o l'intero trascrittoma6,7. Inoltre è di grande aiuto quando traduzione locale deve essere studiato come sinaptosomi8. Tradizionalmente, questo metodo comporta la separazione di mono - e poliribosomi e i mRNAs associati su un gradiente di saccarosio che potrebbe essere accoppiato con genomica o tecniche di ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

HL112730 NIH P01 (straccio, JVE), NIH R01 HL132075 (straccio, JVE), centro Barbra Streisand femminile del cuore (straccio, JVE), Dorothy ed E. Phillip Lione sedia in cardiologia molecolare (RAG), Erika Glazer dotato sedia in salute del cuore della donna (JVE) e Accademia Ceca delle scienze Sostegno istituzionale RVO: 68081715 (MS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PentobarbitalVortech Phamaceuticals9373per l'eutanasia
EparinaSagent103424utilizzato nelle pinze per la preparazione di Langendorff
Fine Science Tools91110-10utilizzato per appendere il cuore
Sistema LangendorffRadnoti + fatto in casan/aUn sistema a "quattro cuori" composto da vetro soffiato personalizzato, tubi e bagni d'acqua
NaClSigmaS7653-5KGTampone Krebs e gradiente di saccarosio
KClSigmaP5405Tampone Krebs e tampone di lisi
KH2PO42SigmaP-5504Tampone Krebs
MgSO4SigmaM7774-500GTampone Krebs
GlucosioSigmaG5767Buffer di Krebs
CaCl2SigmaC1016-500GTampone Krebs
Polvere di saccarosioSigmaS0389-1KGGradiente di saccarosio
MgCl2Sigma208337Gradiente di saccarosio e tampone di lisi
Tris-baseSigmaT1503-1KGGradiente di saccarosio e tampone di lisi
Xilene CianoleSigmaX-4126Gradiente di saccarosio
CicloesimideSigma-aldrich239763Gradiente di saccarosio e tampone di lisi
RNaseOUTLife TechnologiesC00019Inibitore dell'RNAsi per tampone di lisi
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021Tampone di lisi
Inibitore della proteasi Compresse cocktail, senza EDTARoche5056489001
Provetta, a parete sottile, ultra trasparente, 13,2 mL, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
UltracentrifugaBeckmanLE-80KUltracentrifugazione dei gradienti
RotoreBeckmanSW41Ultracentrifugazione dei gradienti Biologic
LP (pompa)Biorad731-8300Frazionamento dei gradienti
BioFracBiorad741-0002Frazionamento dei gradienti
Provette per microcentrifuga Eppendorf RNA/DNA LoBind, provetta da 2 mLSigmaZ666513-100EAFrazione di gradiente ed estrazione dell'RNA
Reagente TRIzol Tecnologiedi vitaAM9738Estrazione dell'RNA
Luciferasi Controllo RNAPromegaL4561Estrazione del
cloroformioFisher ScientificC606-4RNA estrazione
Glicogeno, grado RNAThermo Fisher ScientificR0551Estrazione RNA
IsopropanoloSigmaI9516Estrazione RNA
EtanoloSigmaE7023-1LEstrazione RNA
iScript Kit di sintesi cDNABioRad170-8891Trascrizione inversa
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122PCR quantitativa
miRNeasy Micro Kit (50)QiagenKit per l'isolamento totale dell'RNA
miScript II RT Kit (50)Qiagen218161Kit per la trascrizione inversa
dei miRNA miScript Sybr Green PCR Kit (200)QiagenKit per l'analisi dell'espressione PCR in tempo reale dei miRNA
Centrifuga 5424REppendorfPer la centrifugazione di provette da 1,5 mL o 2,0 mL a diverse temperature. Velocità massima - 21130 x g
Centrifuga 5810REppendorfPer la centrifugazione di piastre PCR in tempo reale a diverse temperature. Velocità massima - 2039 x g
My Cycler TermociclatoreBio-RadPer la trascrizione inversa
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal CyclerBio-RadPer l'analisi PCR in tempo reale
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610Per il controllo di qualità dell'isolamento dell'RNA
Piastre PCR a 96 pozzetti rigide, a basso profilo, a parete sottile, bordate, verdi/trasparentiBio-RadHSP9641Per analisi PCR in tempo reale
Pellicola sigillante per piastre PCR Microseal 'B', adesiva, otticaBio-RadMSB1001Per la sigillatura di piastre PCR in tempo reale
Research plus Pipetta monocanale, grigia; 0,5-10 &; LEppendorfUX-24505-02Per il pipettaggio
delle pipette PIPETMAN Classic, P20GilsonF123600GPer il pipettaggio
delle pipette PIPETMAN Classic, P200GilsonF144565Per il pipettaggio
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipetta 100-1000 &; LGilson17011782Per il pipettaggio
del glicogeno, grado RNAThermo Fisher ScientificR0551Migliora l'efficienza totale dell'isolamento dell'RNA
Provette Posi-Click da 1,7 mL, colore naturaleDenvilleC2170Isolamento e conservazione dell'RNA; miscela di reagenti
Provette per cicli termici -0,2 mL Tappi singoli, provette standard da 0,2 mL con DenvilleC18098-4 ottico (1000910)Reazione di trascrizione inversa
Sharp 10 Puntali barriera di precisioneDenvilleP1096-FRPer il pipettaggio
Puntali barriera di precisione Sharp 20DenvilleP1121Per pipettaggio
Puntali barriera di precisione Sharp 200DenvilleP1122Per puntali di pipettaggio
Filtro LTS 1 mLRaininRT-L1000FPer pipettaggio
miScript Primer Assay ( 200)Qiagen(cambia in base al miRNA)Per l'analisi PCR in tempo reale
Gradient Master ver 5.3 Modello 108Strumenti BioCompPer la preparazione di gradienti di saccarosio
acido tricloroaceticoSigma AldrichT6399
acetoneSigma Aldrich650501
Tris cloridratoAmrescoM108
ditiotreitoloFisher ScientificBP172
iodoacetammideGbiosciencesRC-150
tripsina modificata di grado di sequenziamento, suinoPromegaV5111
bicarbonato di ammonioBDHBDH9206
acido formico, Optima LC/MSFisher ChemicalA117
metanolo, Optima LC/MSFisher ChemicalA454
acetonitrile, Optima LC/MSFisher ChemicalA996
Provette Protein LoBind 0,5 mLEppendorf AG22431064
Provette Protein LoBind 1,5 mLEppendorf AG22431081
HLB µ Piastra di eluizione 30 & micro; mOasis186001828BA
Concentratore SpeedVacThermo ScientificSonicatore SPD2010
Savant QsonicaOasis180
centrifugaThermo ScientificSorvall Legend micro 21R
LC trappola PepMap 100 C18Thermo Scientific160454
LC colonna di separazione PepMap RSLC C18Spettrometro di massa Thermo Scientific164536
Thermo Scientificdi massa a trappola ionica Elite
MSConvert SoftwareProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUESTSoftware Sage-N Research, Inc.
217084 218073 Spettrometro Software

Riferimenti

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