Descriviamo i metodi per isolare canini neutrofili dal sangue intero e visualizzare formazione netta nei neutrofili dal vivo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Sono anche descritti protocolli per quantificare la formazione netta e citrullinato istone H3 (citH3) espressione usando la microscopia di immunofluorescenza.
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Articolo metodologico
In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
In risposta ad agenti patogeni d'invasione, neutrofili rilasciare trappole extracellulari del neutrofilo (reti), che sono reti extracellulare del DNA decorato con gli istoni e proteine antimicrobiche. Eccessiva formazione netta (NETosis) e citH3 rilascio durante la sepsi è associato con più disfunzione dell'organo e la mortalità nei topi e nell'uomo ma le sue implicazioni nei cani sono sconosciuti. Qui, descriviamo una tecnica per isolare canini neutrofili dal sangue intero per l'osservazione e la quantificazione dei NETosis. Plasma leucocita-ricco, generato dalla sedimentazione del dextrano, è separato dai mezzi di comunicazione di commercialmente disponibile densità gradiente separazione e granulociti raccolti per conteggio e test di vitalità delle cellule. Per osservare in tempo reale NETosis dal vivo dei neutrofili, cellule permeante e macchie fluorescenti impermeant dell'acido nucleico cellulare vengono aggiunti ai neutrofili attivati da lipopolisaccaride (LPS) o phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA). Cambiamenti nella morfologia nucleare e formazione netta sono osservati nel corso del tempo da microscopia di fluorescenza. In vitro NETosis è ulteriormente caratterizzata da co-colocalizzazione di DNA libero (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) e citrullinato istone H3 (citH3) utilizzando un protocollo modificato di doppio-immunolabelling. Per quantificare oggettivamente formazione netta e citH3 espressione utilizzando la microscopia a fluorescenza, reti e cellule citH3-positive sono quantificate in un modo accecato utilizzando il software disponibile. Questa tecnica è un dosaggio specifico per valutare la capacità in vitro dei neutrofili canini di subire NETosis.
Introduzione
I neutrofili sono di breve durati granulociti responsabili della iniziale difesa contro agenti patogeni d'invasione. Neutrofili, reclutati nel sito di infezione, eliminano microrganismi di fagocitosi, la degranulazione e la generazione di ossigeno reattivo (ROS) specie1. In presenza di batteri o endotossine, neutrofili rilascio dei neutrofili extracellulare trappole (reti), composto di cromatina extracellulare decorato con gli istoni e proteine granulari come elastasi e mieloperossidasi (MPO)2. Anche se le reti sono indispensabili proprietà antimicrobiche, crescenti evidenze sperimentali e cliniche suggerisce che troppo ....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la University of California, Davis e istituzionali cura degli animali (numero di protocollo: 18338).
1. prelievo sangue
- Disegnare 10 mL di sangue da una vena cefalica o giugulare utilizzando un ago 21G dall'aspirazione di siringa.
- Per evitare un'eccessiva sollecitazione di taglio, rimuovere l'ago dalla siringa prima di trasferire il sangue in provette contenenti eparina sodica (75 USP). Capovolgere delicatamente le provette un paio di volte a garantire un'adeguata miscelazione di anticoagulante e sangue. Verifica l'evidenza di coaguli o agg....
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Risultati
Usando questo protocollo dell'imaging di cellule vive, gli investigatori possono osservare la morfologia nucleare, l'integrità della membrana del plasma e la presenza di cfDNA vivente dei neutrofili. Un colorante nucleare impermeant cella macchie acidi nuclei rosso in cellule con membrane cellulari danneggiate. Un altro colorante cellulare-permeante, etichette sugli acidi nucleici intracellulare in cellule vive con le membrane intatte di plasma. Tutti i neutrofili intatti, indipendentemen.......
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Discussione
Presentiamo qui un protocollo per osservare i cambiamenti nella conformazione e cfDNA i nuclei dei neutrofili canini vivente utilizzando un colorante permeante cella sia un colorante impermeant cella. Il vantaggio principale di questo test è che permette per il rilevamento in tempo reale di formazione netta di microscopia ad alta risoluzione nei neutrofili dal vivo senza fissazione delle cellule, di conseguenza, fornendo uno strumento semplice e prezioso per l'osservazione in vitro formazione netta. Poiché quest.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
L'autore corrispondente è stato finanziato dalla Fondazione di animale Morris (D15CA-907). Lo studio è stato sostenuto dall'Università di California, Davis, centro per la salute equina e centro per la salute animale compagno (2016-24-F). Gli autori desidera ringraziare Geena Ng per la sua assistenza con le figure e Nghi Nguyen per la sua assistenza con il video.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Destrano da Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Peso molecolare 450.000 - 650.000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato | ThermoFisher Scientific | A1285801 | con cationi bivalenti |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Senza cationi bivalenti |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Colorazione fluorescente arancione dell'acido nucleico | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; colorazione in cellule con membrane permeabili |
| SYTO Green 16 Colorazione fluorescente dell'acido nucleico | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; colorazioni in cellule con membrane intatte |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Vetrini coprioggetti rivestiti di poli-D-lisina | neuVitro | H-12-pdl | diametro 12 mm |
| Anticorpo H3 istone anti-citrullinato | Abcam Abcam | Ab5103 | |
| Frammenti di capra non coniugati anti-coniglio | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificità: IgG (H+L) |
| Anticorpo anti-mieloperossidasi | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-fenilina (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
Riferimenti
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 ....
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Ristampe e permessi
