In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (THGM)

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per differenziare murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing linfociti T helper (T_HGM) da cellule T CD4 + ingenuo, incluso l'isolamento delle cellule T CD4 + Naive, differenziazione di T_HGM, e analisi delle cellule di T_HGM differenziate. Questo metodo può essere applicato agli studi del regolamento e la funzione delle cellule di T_HGM.

Abstract

Il fattore di stimolazione del granulocyte-macrofago-colonia (GM-CSF)-la produzione di cellule T helper (T_HGM) è un sottoinsieme di cellule helper T recentemente identificato che principalmente secerne GM-CSF senza produrre l'interferone (IFN) γ o interleuchina (IL) -17 e si trova a svolgono un ruolo essenziale nella neuroinfiammazione autoimmuni. Un metodo di isolamento di cellule T CD4 + ingenuo da una cella singola sospensione degli splenocytes e generazione di cellule T_HGM da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe una tecnica utile nello studio dell'immunità mediata da cellule T e malattie autoimmuni. Qui descriviamo un metodo che differenzia le cellule di T di CD4 + ingenuo di topo in cellule di T_HGM promosse da IL-7. L'esito della differenziazione è stata valutata tramite l'analisi dell'espressione di citochine utilizzando diverse tecniche, tra cui intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso, una reazione a catena quantitativa in tempo reale della polimerasi (PCR), e analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA). Utilizzando il protocollo di differenziazione T_HGM come descritto qui, circa il 55% delle cellule espresso GM-CSF con una minima espressione di IL2 o IL-17. L'espressione predominante di GM-CSF dalle cellule di T_HGM è stato ulteriormente confermato dall'analisi dell'espressione di GM-CSF, IL2 e IL-17 a livelli di mRNA e di proteina. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per differenziare le cellule CD4 + T naive a T_HGM cellule in vitro, che saranno utili nello studio della biologia delle cellule di T_HGM.

Introduzione

Linfociti CD4 + T helper (T_H) sono componenti essenziali del sistema immunitario, avendo un ruolo cruciale nella difesa ospite contro gli agenti patogeni microbici, nella sorveglianza del cancro e nell'autoimmunità^1,2,3. Al momento dell'attivazione del ricevitore (TCR) di cellule T, cellule T CD4 + ingenuo possono essere differenziate in T_H1, T_H2, T_H 17, o regolamentazione T (Treg) cellule sotto l'influenza di citochine differenti ambienti^{2,4, 5}. recentemente, un nuovo subset di cellule T_H , che produce principalmente GM-CSF, è stato identificato e denominato T_HGM⁶. La differenziazione delle cellule di T_HGM è guidata da IL-7 attraverso l'attivazione di un trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione 5 (STAT5). Queste cellule esprimono una grande quantità di GM-CSF pur avendo una bassa espressione di altri T_H-cell firma citochine quali IFNγ e IL-17⁶. GM-CSF è stato trovato per svolgere un ruolo critico nello sviluppo di CD4 + T cellulo-mediata neuroinflammation^7,8. Rispetto al IFNγ o IL-17-esprimendo le cellule T autoreattive, GM-CSF-esprimendo T cellule trasferito al selvaggio-tipo topi (WT) ha causati un inizio più iniziale di malattia e la maggiore severità di malattia. Inoltre, le cellule di T di QCS2- / - non riuscito ad indurre encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) dopo essere stato trasferito passivamente ai destinatari WT, mentre le cellule di T che mancano IFNγ o IL-17A mantenuto la capacità di mediare EAE⁷. Inoltre, un blocco di GM-CSF utilizzando anticorpi neutralizzanti ha migliorato EAE malattia gravità⁸. Inoltre, una carenza di STAT5 in cellule di T in topi ha provocato in una generazione di T_HGM diminuita e, quindi, in una resistenza dei topi a EAE sviluppo⁶. Questi risultati sottolineano l'importanza delle cellule di T di GM-CSF-esprimendo_H nella malattia autoimmune neuroinfiammatorie. Quindi, stabilire un metodo per differenziare le cellule di T di GM-CSF-esprimendo_H da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe importante nello studio della patogenesi autoimmune neuroinflammation e immunitaria mediata da cellule T. Tuttavia, un protocollo che efficientemente genera cellule T_HGM da murino ingenuo che CD4 + non è stata stabilita.

Qui presentiamo un metodo che differenzia cellule murine T_HGM da cellule T CD4 + ingenuo. Questo protocollo descrive l'intera procedura, compreso l'estrazione della milza dal mouse, la preparazione di una sospensione unicellulare, la selezione positiva CD4, la cella di fluorescenza-attivato ordinano (FACS) e la cellula di T_H differenziazione e analisi. Il differenziato cellule T helper vengono analizzate da intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso per determinare l'espressione di citochine a livello di singola cellula, mediante una PCR quantitativa in tempo reale per determinare l'espressione di citochine a livello di mRNA, e da ELISA per valutare l'espressione di citochine a livello di proteina. Questo metodo può essere applicato agli studi di biologia cellulare T_HGM in varie condizioni, come ad esempio EAE, dove GM-CSF svolge un ruolo importante nella patogenesi.

Protocollo

Tutti i topi usati in questo protocollo sono stati il background genetico C57BL/6 e alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche presso la National University of Singapore. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando protocolli approvati dal comitato di uso della Università nazionale di Singapore e istituzionali Animal Care.

1. reagenti e preparazione del materiale

1. Preparare 500 mL di tampone fosfato salino (PBS) contenente 2% siero bovino fetale (FBS) e 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
   Nota: Mantenere il buffer sul ghiaccio durante l'intera procedura per ottenere risultati ottimali.
2. Preparare 50 mL di completo supporto RPMI contenente RPMI 1640, 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina. Utilizzare supporti RPMI completi contenente 50 µM β-mercaptoetanolo per la differenziazione delle cellule di T_HGM. Aggiungere il β-mercaptoetanolo in una cappa aspirante.
3. Preparare 7,5 mL di una miscela di anticorpi anti-CD3e diluendo stock anti-CD3e concentrato a 3 μg/mL in PBS. Cappotto 48 pozzetti aggiungendo 150 µ l della miscela dell'anticorpo ad ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 ° C per almeno 1 h, o a 4 ° C durante la notte.
4. Sterilizzare un paio di forbici e pinze e tenerli in etanolo al 70% tra le dissezioni.

2. preparazione degli Splenocytes murini

1. Eutanasia del mouse (di 6 – 8 settimane vecchie) utilizzando un istituzionalmente approvato CO₂ asfissia o dislocazione cervicale. Spruzzare il mouse con etanolo al 70% e montarlo su un blocco di polistirolo sulla sua schiena. Trasferire il mouse a una sicurezza microbiologica per procedere con i passaggi seguenti.
2. Tenere la pelle usando un paio di pinze e tagliare la pelle sotto la gabbia toracica sul lato sinistro per circa 4 cm, utilizzando un paio di forbici. Aprire il sac peritoneale per esporre la milza e utilizzare pinze sterili per estrarre la milza.
3. Collocare un filtro cella 70 μm su un tubo da 50 mL e pre-bagnare con 2 mL di tampone. Posizionare le milze sul filtro cella (2 – 3 milze per filtro di una cella) e macerare li usando l'estremità di un pistone della siringa 5 mL.
4. Risciacquare il filtro e il tubo parecchie volte con 1 – 2 mL di buffer di isolamento cella fino a quando tutte le celle vengono scaricate nel tubo. Eliminare il filtro cella e centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
5. Risospendere il pellet cellulare con 5 mL di freddo (4 ° C) ammonio-cloruro-potassio (ACK) Lisi buffer (150mm NH₄Cl, 10mm KHCO₃, 0.1 mM Na₂EDTA; pH 7,2-7,4) e mescolare delicatamente per 2 minuti aggiungere 10 mL di multimediale RPMI completo per neutralizzare l'ACK buffer e centrifugare immediatamente le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante dopo la centrifugazione.

3. isolamento di CD4 + T Cells utilizzando microsfere magnetiche CD4 e una colonna di separazione cellulare

1. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di buffer di isolamento delle cellule. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro di pre-separazione (30 μm) in una nuova provetta da 15mL per rimuovere eventuali detriti.
2. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e fare una diluizione di 10 x aggiungendo 90 μL di tampone. Prendere 10 μL della sospensione delle cellule diluito e mescolare con 10 μL di trypan blu per il conteggio delle cellule. Contare le celle in un emocitometro per determinare il rendimento di cellule vitali.
3. Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
4. Risospendere le cellule in 90 μL di tampone per 10⁷ cellule. Aggiungere 10 μL di microperle magnetiche CD4 per 10⁷ cellule. Incubare le cellule per 15 min a 4 ° C. Per risultati ottimali, miscelare la sospensione cellulare delicatamente ogni 5 minuti durante l'incubazione.
5. Mentre sono incubando le cellule, è possibile posizionare una colonna di separazione sul supporto magnetico. Pre-bagnato la colonna con 2 mL di tampone.
6. Alla fine dell'incubazione delle cellule/tallone, lavare le cellule con 5 mL di tampone e li Centrifugare a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
7. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone, caricare il campione nella colonna di separazione cellulare e lasciarlo fluire attraverso. Utilizzare una provetta per centrifuga 15 mL per raccogliere la frazione di cellule CD4. Aggiungere 1 mL di tampone per lavare il serbatoio prima che sia asciutto. Ripetere la fase di lavaggio 2 x.
8. Rimuovere la colonna di separazione delle cellule dal supporto magnetico e posizionarlo su una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento delle cellule nella colonna di separazione cellulare e applicare lo stantuffo saldamente per forzare le celle dalla colonna.
9. Centrifugare la frazione a 350 x g per 5 min a 4 ° C per ottenere cellule CD4 +. Scartare il surnatante.

4. purificazione delle cellule T CD4 + Naive (CD4⁺CD25^–CD44^loCD62L^Ciao) di differenziazione di ordinamento delle cellule e T_HGM fluorescenza-attivato

1. Risospendere il pellet di cellule CD4 + ottenuto in 500 µ l di tampone. Mescolare le cellule con una miscela di anticorpi coniugati fluorescenti contenenti CD4-PerCp (2,8 µ g/mL), CD44-APC (2,4 µ g/mL), CD25-PE (2 µ g/mL) e CD62L-FITC (10 µ g/mL) (tabella 1). Incubare le cellule in ghiaccio per 20 – 30 minuti, mentre li protegge dalla luce.
   Nota: Le concentrazioni degli anticorpi sono state ottimizzate in precedenza in laboratorio. Il numero di anticorpi elencati è per celle da 1 – 2 topi.
2. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 5 mL di tampone e centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C.
3. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 500 µ l di tampone. Filtrare le celle utilizzando una rete di nylon.
4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta di FACS per l'ordinamento delle cellule. Precoat i tubi di raccolta FACS con 500 µ l di tampone.
5. Ottenere un CD4⁺CD25^–CD44^loCD62L^Ciao popolazione (di ingenuo CD4⁺ T cellule) ordinando FACS. Cancello il CD4⁺CD25^– prime e quindi selezionare CD44^loCD62L^Ciao cellule da questa popolazione.
6. Raccogliere l'ingenuo CD4⁺ T cell frazioni in una nuova provetta da centrifuga 15 mL. Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
7. Risospendere le cellule di T di CD4 + ingenuo ad una concentrazione di 10⁶ cellule/mL in completo supporto RPMI contenente 50 µM β-mercaptoetanolo.
8. Aspirare gli anticorpi di anti-CD3e utilizzati per spre-spalmatura in lastra 48 pozzetti. Le cellule di seme 0,25 milioni (250 µ l) in ciascun pozzetto con IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µ g/mL) e anti-IFNγ (10 µ g/mL) (tabella 1).
   Nota: Le concentrazioni di citochine e gli anticorpi sono state ottimizzate in precedenza in laboratorio per una differenziazione delle cellule di T_HGM.
9. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO₂ per 3 giorni. Non modificare il mezzo durante l'incubazione.

5. analisi delle cellule di GM del Mouse T_Hgenerato In Vitro

1. Utilizzando un microscopio, controllare la differenziazione cellulare 3 d dopo la differenziazione. Raccogliere le cellule e loro Centrifugare a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Lavare le cellule 2 x con completo supporto di RPMI.
   Nota: Le cellule differenziate sono più ampie rispetto alle cellule di T di CD4 + ingenuo.
2. Risospendere le cellule in 1 mL di multimediale completo RPMI. Prendere 10 µ l di sospensione cellulare e mescolare bene con 10 μL di trypan blu per determinare il numero di cellulare con un emocitometro. Dividere le cellule differenziate in tre pozioni per una restimolazione e analisi.
   Nota: Intracellulari di cytokine colorazione e saggi ELISA richiedono ≥0.5 milione cellule e analisi qPCR richiedono ≥ 1 milione cellule.
3. Per la colorazione intracellulare cytokine, stimolare le cellule con forbolo miristato 12 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) e ionomicina (1 μg/mL) in presenza di un inibitore del trasporto di proteine (1 µ l/mL) per 4-6 h.
   1. Raccogliere le cellule e li macchia con l'anticorpo anti-CD4 (PerCP-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100; o coniugato FITC, 0,5 mg/mL, diluizione 1: 100) per 30 min.
   2. Fissare le cellule con 200 μL di tampone di fissazione per 20 – 60 min. Dopo la fissazione, lavare le cellule 2 x con 1 mL di tampone di permeabilizzazione.
   3. Eseguire la colorazione intracellulare con gli anticorpi contro il GM-CSF (PE-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100), IL-17A (FITC-coniugato, 0,5 mg/mL, diluizione 1: 100; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100), IL-4 (APC-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100) e IFNγ (APC-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100) per 30 min al buio.
4. Per un'analisi qPCR dell'espressione genica citochina da cellule differenziate, attivare le cellule con piastra-associazione anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating la piastra come descritto al punto 1.3). A 3 h dopo la stimolazione, raccogliere le cellule per isolare RNA totale usando un reagente di estrazione del fenolo RNA per prepararsi la qPCR di cDNA. I primer e il programma utilizzato per la qPCR sono riportati nelle tabelle 2 e 3, rispettivamente.
5. Per l'analisi della secrezione della proteina citochina da cellule differenziate, stimolare le cellule con piastra-associazione anti-CD3e (3 μg/mL) per 24 h (precoating la piastra come descritto al punto 1.3). Raccogliere il surnatante per IL-17 e GM-CSF ELISA per determinare le loro concentrazioni di coltura cellulare.

Risultati

Cellule T CD4 + Naive isolate da due 8-settimana-vecchio maschio C57BL/6 topi sono stati divisi in tre porzioni. Una porzione delle cellule è stata differenziata in cellule di T_HGM seguendo il protocollo descritto. Un'altra porzione è stata coltivata in una condizione di T_HGM in presenza dell'anticorpo anti-IL-4 (10 µ g/mL) per testare l'influenza di un blocco di IL-4 nella differenziazione delle T_HGM. L'ultima parte è stata coltivata in una condizione di ...

Discussione

Qui abbiamo descritto un protocollo di una differenziazione in vitro T_HGM da ingenuo CD4 + cellule di topo, seguita da un'analisi delle cellule differenziate per convalidare il metodo. Della nota, linfonodi e milza può essere utilizzati per ingenuo purificazione di cellule T CD4 + e T_HGM differenziazione. L'espressione di citochine determinato macchiando intracellulari di cytokine combinato con citometria a flusso ha mostrato che circa il 55% delle cellule sono state indotte a diventare GM-...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI 1640	Biowest	L0500-500
FBS Capricorno inattivato a caldo		FBS-HI-12A
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122
10x PBS	1a base	BUF-2040-10	Diluito a 1x PBS in acqua sterile
EDTA	1a base	BUF-1053-100ml-pH8.0
10x tampone	ACKBiolegend	420301	diluito in acqua sterile
Filtro cellulare	SPL Life Sciences	93070
CD4 microsfere	Miltenyi Biotec	130-049-201
2-Mercaptoetanolo	Sigma	M7522
LS colonna	Miltenyi Biotec	130-042-401
supporto magnetico	Miltenyi Biotec	130-042-303
Siringa da 1 mL	Terumo	SS+01T
Centrifuga	Eppendorf Eppendorf	5810R
Selezionatrice cellulare Sony SY3200	Selezionatrice		cellulare Sony Sony SY3200
Provetta da centrifuga conica da 50 mL Provetta da centrifuga conica	Greiner Bio-One	210261
15 mL
	Corning	352054
piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti	Greiner Bio-One	662160
anti-topo CD4 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0041-82
PE coniugato anti-topo CD25 (IL-2Ra, p55)	eBioscience	12-0251-82
anti-umano/topo CD44 APC	eBioscience	17-0441-82
anti-topo CD62L FITC	eBioscience	11-0621-85
Neubauer-camera di conteggio migliorata	Marienfeld	640010
Hyclone Trypan Blue Solution	GE healthcare Life Sciences	SV30084.01
microscopio	Nikon	Nikon Elipse TS100
Purified  anti-topo CD3e  anticorpo	Biolegend	100314
Criceto purificato anti-topo CD28	BD Biosciences	553295
Ratto purificato anti-topo IFNγ	eBioscience	16-7312-85
Anticorpo IL-4 anti-topo purificato	Biolegend	504102
Proteina IL-7 ricombinante di topo	R& Sistema D	407-ML
ricombinante umano TGF-beta	R& Sistema D	240-B-010
PMA	Merck Millipore	19-144
Ionomicina	Sigma	I0634
Inibitore del trasporto della proteina GolgiPlug	BD Biosciences	51-2301KZ
Fissazione intracellulare & Set di tamponi per permeabilizzazione	eBioscience	88-8824-00
anti-topo GM-CSF PE	eBioscience	12-7331-82
FITC anti-topo IL-17A	Biolegend	506908
APC anti-topo IFN-gamma	Biolegend	505810
GO Taq qPCR master mix	Promega	A6002
topo GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!	invitrogen	88-7334-88
Topo IL-17A ELISA non couted	invitrogen	88-7371-22

Provetta FACS da 188271 Greiner