Articolo metodologico

Caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in Necroptosis

DOI:

10.3791/58088

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7 agosto 2018

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1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

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In questo articolo

Sommario

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Segnaliamo i metodi per la caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in necroptosis compreso formazione immagine convenzionale e confocale microscopia di cellule vive, microscopia elettronica, e associazione basata su NMR del lipido.

Abstract

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Necroptosis è una via di morte programmata delle cellule innescata dall'attivazione del recettore interacting protein chinasi 3 (RIPK3), che fosforila e attiva la pseudochinasi dominio chinasi-come stirpe misto, MLKL, rottura o permeabilize la membrana plasmatica . Necroptosis è un percorso infiammatorio associato con patologie multiple, tra cui il cancro, le malattie infettive e cardiovascolari, ictus, neurodegenerazione e autoimmunità. Qui, descriviamo i protocolli che possono essere utilizzati per caratterizzare il MLKL come il boia di rottura della membrana del plasma in necroptosis. Visualizziamo il processo di necroptosis in cellule usando la formazione immagine della vivere-cella con microscopia di fluorescenza confocale e convenzionale e in cellule fissate mediante microscopia elettronica, che insieme hanno rivelato la ridistribuzione dei MLKL dal cytosol al plasma membrana prima di induzione di grandi fori nella membrana plasmatica. Vi presentiamo in vitro analisi di risonanza magnetica nucleare (NMR) utilizzando i lipidi per identificare putativi modulatori di necroptosis MLKL-mediata. Basato su questo metodo, abbiamo identificato quantitativa del lipido-associazione preferenze e fosfatidil-inositolo fosfato (PIPs) come leganti critici di MLKL che sono necessari per il targeting di membrana plasmatica e permeabilizzazione in necroptosis.

Introduzione

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Identificazione dei componenti genetiche di necroptosis ha facilitato l'uso di modelli animali per testare l'implicazione di necroptosis in fisiologia e malattia1,2,3,4,5. Ko di RIPK3 o MLKL in topi aveva minima implicazione nell'omeostasi sviluppo e adulto, suggerendo che necroptosis non è essenziale per vita3

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Protocollo

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1. clonazione e cella linea generazione

  1. PCR amplificano la regione NBB, corrispondono ai residui dell'amminoacido 1-140 (NBB140), da cDNA umano MLKL per telaio standard basati su enzimi di limitazione clonazione con la proteina legante di oligomerizzazione dominio 2 x FK506 (2xFKBP o 2xFV) e Venus fluorescente proteine nella doxiciclina (Dox) - vettore retrovirale inducibile pRetroX-TRE3G per ottenere NBB140- 2xFV-Venus (tabella 1, figure 1A-B).
  2. Immortalare primario mlkl- / - o ripk3- / - mlkl- / - fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) ottenuti dai rispetti....

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Risultati

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Visualizzare l'esecuzione di necroptosis regolamentati in cellule vive è stato possibile attraverso l'espressione inducibile di un costrutto MLKL troncato minimal, NBB140-2xFV-Venus. Questo costrutto mantiene la capacità di indurre la permeabilizzazione della membrana del plasma e viene attivato tramite oligomerizzazione Dim-indotta della cassetta FKBP (2xFV). Osserviamo e quantificare necroptosis da microscopia di cellule vive di imaging, monitoraggio cineticamente (ogni 5 min.......

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Discussione

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Forniamo i protocolli per le tecniche che abbiamo combinato implicati MLKL come il presunto boia di membrana plasmatica rottura24. Oltre a decifrare la rete di regolamentazione che regola necroptosis MLKL-mediata, queste tecniche possono essere utilizzate in modo indipendente per caratterizzare altri sistemi biologici adatti. In pratica, queste tecniche sono strumenti di rilevamento medio-basso rendimento.

Abbiamo usato ordinariamente imaging di cellule vive di NBB.......

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Clonaggio e generazione di linee cellulari
pRetroX-TRE3GClontech631188
Tet-On transattivatore plasmideLlambi et al., 2016
Fibroblasti embrionali di topo (MEFs) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Blasticidina S cloridratoThermo Fisher ScientificBP2647100 CAS#3513-03-9
Quantificazione della morte cellulare e microscopia su cellule vive
DoxiciclinaClontech 631311CAS# 24390-14-5
B/B Omomodizzatore AP20187Takara635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX VerdeThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
NMR
15 N Cloruro di ammonioCambridge Isotope LaboratoriesNLM-467-10 CAS# 12125-02-9
DTT deuteratoCambridge Isotope LaboratoriesDLM-2622-1
Ossido di deuterioSigma Aldrich617385-1 CAS# 7789-20-0
n-dodecil-β-D-maltopiranosideAnatraceD310 CAS# 69227-93-6
L-&alfa;-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (cervello, suino) (sale di ammonio)Avanti Polar Lipids840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoinositolo (sale di ammonio) (18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositolo) (sale di ammonio) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR o ZOOMEssen BioScience, Inc.Imaging per microscopia su cellule vive
Helios NanoLab 660 DualBeam Thermo Fisher Scientific Microscopioelettronico
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comAnalisi di imaging
FEI MAPSThermo Fisher Scientific,analisi https://www.fei.com/software/maps/ EM
TopSpin v3.2Bruker, BioSpinhttp://www.bruker.comNMR, raccolta dati
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ Analisi dei dati NMR
Slidebook3i (Intelligent Imaging Innovations)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookMicroscopia confocale
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Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nat....

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MLKL NecroptosisPlasma Membrane RuptureLive cell ImagingNuclear Magnetic ResonanceLipid Binding AnalysisConfocal MicroscopyElectron MicroscopyNecroptosis InductionMLKL TranslocationPhosphatidyl inositol Phosphates

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