Caratterizzazione funzionale di Carboxylesterases in casa resistente all'insetticida mosche, Musca Domestica

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per produrre casa volare carbossilesterasi proteine in vitro con un sistema di espressione di baculovirus mediata delle cellule di insetto e successivamente funzionalmente caratterizzano i loro ruoli in che metabolizza permetrina, quindi, che conferisce piretroidi resistenza conducendo basati su cellule MTT assay e in vitro gli studi metabolici.

Abstract

Il metabolismo mediato carbossilesterasi è pensato per svolgere un ruolo importante nella resistenza agli insetticidi in vari insetti. Diversi carbossilesterasi geni sono stati trovati up-regolato nel ceppo resistente casa volare, mentre loro ruoli che conferiscono resistenza agli insetticidi è rimasto per essere esplorato. Qui, abbiamo progettato un protocollo per la caratterizzazione funzionale di carboxylesterases. Vengono presentati tre esperimenti di esempio: (1) espressione e l'isolamento delle proteine carbossilesterasi attraverso un insetto baculovirus-mediata Spodoptera frugiperda (Sf9) sistema di espressione delle cellule; (2) un MTT basati su cellule (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-dimethylthiazolyl bromuro) analisi di citotossicità per misurare la tolleranza delle cellule di insetto a permetrina diversi trattamenti; e (3) in vitro gli studi metabolici per esplorare la capacità metabolica di carboxylesterases verso permetrina. Il gene carbossilesterasi MdαE7 è stato clonato da una casa resistente volare ceppo ALHF e utilizzato per costruire un baculovirus ricombinanti per l'infezione di cellule Sf9. La viabilità cellulare contro permetrina diversi trattamenti sono stati misurati con l'analisi di MTT. La tolleranza cellulare avanzata del gruppo sperimentale (cellule di baculovirus infettati MdαE7-ricombinante) rispetto a quelli dei gruppi di controllo (CAT-ricombinante baculovirus infettato cellule e le cellule di baculovirus infettati GFP-ricombinante) a permetrina trattamenti suggerito le funzionalità del MdαE7 nel metabolismo insetticidi, proteggendo le cellule dai danni chimici. Oltre a questo, carbossilesterasi proteine sono stati espressi in cellule di insetto Sf9 e isolati per condurre uno studio metabolico in vitro . I nostri risultati hanno indicato una significativa in vitro efficienza metabolica di MdαE7 verso permetrina, direttamente che indica il coinvolgimento di carboxylesterases nel metabolismo insetticidi e conferendo resistenza agli insetticidi in casa mosche.

Introduction

Resistenza agli insetticidi è attualmente un problema importante di casa controllo della Mosca in tutto il mondo^1,2. Gli sforzi per determinare il meccanismo della resistenza agli insetticidi facilita la comprensione di questo problema e quindi fornire nuove strategie per efficacemente prevenire o ridurre al minimo la diffusione di resistenza sviluppo³. Carboxylesterases, come uno degli enzimi più importanti di disintossicazione, hanno attirato molta attenzione per i loro ruoli in sequestranti e metabolizzare gli insetticidi in vari insetti^4,

Protocol

1. espressione e l'isolamento di proteine bersaglio con un sistema di espressione di Baculovirus-mediata delle cellule di insetto

1. Direzionalmente clonazione smussato-conclusa i prodotti PCR di proteine bersaglio da mosche domestiche.
   1. Progettazione degli iniettori PCR della proteina fluorescente verde (GFP) e il gene della MdαE7 di casa volo basato sulle loro sequenze e i requisiti speciali del vettore scelto (tabella 1).
   2. Utilizzare una DNA polimerasi termostabile, correzione di bozze e primer dal punto 1.1.1 per eseguire una reazione di PCR di 150 µ l (30 µ l di tampone di reazione, 3 µ l di 10 mM dNTPs, 1,5 µ l di DNA pol....

Results

L'attuabilità delle cellule verso permetrina diversi trattamenti (analisi di MTT)

La citotossicità di permetrina è stata esaminata in MdαE7-ricombinante baculovirus infettati Sf9 (gruppo sperimentale) e CAT-ricombinante baculovirus (fornito dal kit di baculovirus infettati) infettata cellule (gruppi di controllo). Le tolleranze di avanzata delle cellule a permetrina in MdαE7 che esprimono le cellule fortemente supportano i ruoli me.......

Discussion

Negli ultimi decenni, i sistemi di espressione eterologhi sono stati ampiamente usati per esprimere e isolare grandi quantità di proteine, permettendo la determinazione biochimica e funzionale e caratterizzazione di enzimi in vitro. Ad oggi, diversi sistemi di modello diverso tra cui Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaee Spodoptera frugiperda sono stati adattati per espressione recombinant della proteina e la scelta della sistema in vitro è cru.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà	New England Biolabs inc.	M0491L
Kit di estrazione del gel QIAquick Kit di clonazione	QIAGEN	28704
pENTR/D-TOPO, con One Shot TOP10 E. coli chimicamente competente	Invitrogen di life technology	K240020	il mezzo SOC e i primer universali della sequenza M13 sono stati inclusi in questo kit.
Kit Miniprep per plasmidi PureLink HiPure	Invitrogen by life technology	K210002
Gateway LR Clonase II Miscela di enzimi per kit BaculoDirectTM	Invitrogen by life technology	11791-023
Kit di trasfezione lineare del DNA BaculoDirect C-Term	Invitrogen by life technology	12562-019	Il reagente per trasfezione della cellfectina e il ganciclovir sono stati inclusi in questo kit
Plasmide pENTR-CAT	Invitrogen di life technology		Incluso nel kit di trasfezione lineare del DNA BaculoDirect C-Term, concentrazione: 0,5 ug/uL
Siero fetale bovino inattivato termicamente, certificato	Gibco da Life Technologies	10082-139
cellule Sf9 in Sf-900 III SFM	Gibco di Life Technologies	12659017
Insect Cell-PE LB Estrazione di proteine cellulari di insetti e Tampone di lisi	G Biosciences di A Geno Technology Inc	786-411
Sf-900 III SFM (1×) Terreno senza siero	Gibco completo di Life Technologies	12658-019
Terreno per insetti di Grace, non integrato	Gibco di Life Technologies	11595030
Standard analitico di permetrina (isomeri)	SUPELCO di Solutions WithinTM	>442748
Metanolo (classificato analiticamente)	Sigma-Aldrich	67-56-1
Acetonitrile (analitica)	Sigma-Aldrich	75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Filtri per siringhe con 0,45 μ m Membrana GHP (certificata HPLC)	Pall Life Sciences	21890388
Alliance Waters 2695 Sistema HPLC	Acque
T100 Ciclo termico	Bio-Rad Laboratories Inc.
Spettrofotometri Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher	ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Lettore multimodale	BioTek