Isolamento e identificazione di cellule immunitarie extravascolare del cuore

Summary

Questo protocollo presenta un metodo semplice ed efficace per isolare, identificare e quantificare le cellule immuni che risiedono nel miocardio dei topi durante stato stazionario o l'infiammazione. Il protocollo combina digestione enzimatica e meccanica per la generazione di una sospensione di singola cellula che può essere ulteriormente analizzata tramite flusso cytometry.

Abstract

Il sistema immunitario è una componente essenziale di un cuore sano. Il miocardio è sede di una popolazione ricca dei sottoinsiemi delle cellule immuni differenti con compartimentazione funzionale sia durante stato stazionario diverse forme di infiammazione. Fino a poco tempo, lo studio delle cellule immunitarie nel cuore ha richiesto l'uso di microscopia o protocolli di digestione poco sviluppati, che fornito di sensibilità sufficiente durante l'infiammazione severa, ma erano tranquillamente in grado di identificano piccoli — ma chiave — popolazioni di cellule durante lo stato stazionario. Discutiamo qui, un metodo semplice combinazione enzimatica (collagenasi, ialuronidasi e DNasi) e digestione meccanica del cuore murino preceduta da somministrazione intravascolare di anticorpi fluorescente etichettati per differenziare piccolo ma inevitabile contaminanti intravascolare delle cellule. Questo metodo genera una sospensione di cellule vitali isolate che può essere analizzato tramite flusso cytometry per fenotipizzazione di identificazione e quantificazione, o ulteriormente purificate con fluorescenza-attivato delle cellule l'ordinamento o la separazione di biglie magnetiche per studi di analisi o in vitro trascrizionali. Includiamo un esempio di una dettagliata analisi citofluorimetrica per differenziare la chiave del macrofago e popolazioni di cellule dendritiche del cuore. Per un esperimento di dimensione medio (10 cuori) il completamento della procedura richiede 2 – 3 h.

Introduction

Diverse forme di stress del miocardio o danno, inclusi ischemico (ischemia riperfusione o infarto del miocardio) e non-ischemica (ipertensione o miocardite), promuovere il reclutamento di cellule infiammatorie con riparatore e protettivo, ma anche Proprietà patogene. Già nel 1891, Romberg descritto in primo luogo la presenza di infiltrati cellulari nel miocardio dei pazienti infettati con il tifo e la scarlattina¹. Tuttavia, lo studio dettagliato delle cellule immuni cardiache richiesto lo sviluppo di tecniche più avanzate di immunofenotipizzazione. Di conseguenza, solo recentemente abbiamo iniziato a capire che una popolazione eterogenea di cellule del sistema immunitario con ruoli di manutenzione essenziali durante stato stazionario risiede all'interno del miocardio.

L'istologia è stato ed è tuttora, il metodo più comune per caratterizzare le cellule immuni cardiache durante l'infiammazione. Tuttavia, mentre l'istologia rappresenta un prezioso strumento diagnostico, suo utilizzo nello studio delle cellule immuni cardiache ha limitazioni importanti. Le cellule immunitarie che risiedono nel miocardio rappresentano una percentuale molto piccola delle cellule totali e sono più o meno uniformemente distribuite in uno spazio immenso proporzionalmente. Allo stesso modo, diverse forme di infiammazione cardiaca, quali miocardite virale, mostrano modelli focali di infiammazione. Questo significa che l'analisi accurata del sistema immunitario del cuore richiedono spesso più alti gradi di campionamento istologico, l'aumento del costo per ridurre i pregiudizi. Inoltre, l'istologia fornisce una quantità molto limitata di informazioni utilizzabili nell'identificazione delle cellule (ad es. numero di parametri). Con un numero sempre crescente di sottoinsiemi di cellule che richiedono l'utilizzo di più indicatori di espressione (compresi gli indicatori di superficie, fattori di trascrizione o molecole secrete), citometria a flusso si è affermata come il più potente strumento per immunophenotyping, a causa di alto-rendimento e basso costo.

L'uso di tecniche di immunophenotyping dipende strettamente lo sviluppo di protocolli di digestione efficiente che ha permesso per l'analisi di singole cellule di un gran numero di cellule. Lo sviluppo di protocolli esaustivi di estrazione delle cellule ha aperto una nuova finestra di opportunità nello studio della immunologia cardiaco. Attraverso la combinazione di digestione, citometria a flusso e trascrittomica, le principali popolazioni di macrofagi e cellule dendritiche che risiedono nel cuore sono stati caratterizzati^2,3. La popolazione più abbondante di cellule immuni cardiache durante allo stato stazionario sono CD64⁺⁺ MerTK macrofagi, che possono essere ulteriormente suddivisi sulla base di loro espressione di CCR2 o CD11c². CCR2⁺ macrofagi hanno origine dal midollo osseo adulto ematopoiesi, considerando che la maggior parte di CCR2 macrofagi^– , che possono esprimere livelli elevati o bassi di MHC-II, sono principalmente di origine prenatale. I macrofagi hanno funzioni chiave come riparazione⁴ e la rimozione di detriti⁵ durante la ferita o sostenere connettività elettrica⁶ in regime stazionario. Durante diverse forme di infiammazione si verificano un importante afflusso di Ly6C^Ciao MHC-II^lo CD64^int monociti, che più successivamente differenziarsi in Ly6C^Ciao CCR2⁺ macrofagi^2,7 . Una popolazione significativamente più piccola, ma importante, di cellule che risiedono nel miocardio di individui in buona salute è composto di cellule dendritiche^8,9. I due sottoinsiemi principali di cardiaca convenzionale DCs (cDCs) sono stati recentemente caratterizzati: cDC1 (CD103⁺ DCs) e cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs svolgono un ruolo importante nella difesa contro l'infezione⁸ , ma può anche promuovere la auto-ferita durante l'infiammazione, in particolare durante l'infarto miocardico⁹.

Qui, descriviamo un metodo semplice per l'isolamento di cellule immuni cardiache vitali dal miocardio del mouse. Il metodo combina digestione enzimatica e meccanica con una filtrazione di cella-setaccio per ottenere una sospensione di singola cellula che può essere analizzata, o ulteriormente purificata, tramite flusso cytometry ordinamento o arricchimento di biglie magnetiche. Misurazioni accurate delle cellule del miocardio extravascular richiedono aspersione cardiaca al fine di rimuovere eventuali contaminanti dal flusso sanguigno del microvasculature cardiaco. Inoltre, vi presentiamo un passaggio facoltativo di etichettatura intravascolare delle cellule immuni che possono essere utilizzate per differenziare ulteriormente le cellule del miocardio da contaminanti intravascolare, basati sul Galkina et al protocollo¹⁰. Infine, presentiamo un'analisi di citometria a flusso di base per identificare le principali sottopopolazioni macrofago e cDC.

Protocol

Dichiarazione etica: questo protocollo è stato esaminato e approvato dal comitato di cura degli animali alla rete di salute dell'Università (Toronto, Canada) ed è in conformità con il Consiglio canadese su Animal Care.

1. preparazione buffer

1. Preparare il tampone di HBB (di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS), siero bovino 2% calore inattivato, 0,2% di sieroalbumina bovina). Aggiungere 10 mL di calore inattivato siero bovino e 1 g di albumina di siero bovino a 500 mL di HBSS. Filtro sterilizzare attraverso un filtro di 0,2 µm e conservare a 4 ° C.
2. Preparare il tampone di FACS (tampone fosfato salino (PBS), inattivato con calore 2% di siero bovino, 1 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, pH 8.0)). Aggiungere inattivato con calore 10 mL siero bovino e 1 mL di EDTA 0,5 M a 500 mL di PBS. Filtro sterilizzare attraverso un filtro di 0,2 µm e conservare a 4 ° C.
   Nota: Soluzioni possono essere memorizzati a 4 ° C per 1 mese.

2. etichettatura dei leucociti circolanti

1. Asetticamente preparare l'iniezione di CD45 anti-topo con 1 µ g di anticorpo diluito in soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) per un volume finale di iniezione di 200 µ l/mouse. Volume di carico in una siringa di insulina 28,5 G e tenere lontano dalla luce.
   Nota: Utilizzare due diversi fluorocromo-labelled anti-CD45 anticorpi per differenziare l'intravascolare (macchiato attraverso somministrazione endovenosa) dalla macchiatura intracardiaco (macchiato dopo digestione; Vedi punto 4).
2. Pre-riscaldare i topi (8 – 12 settimane vecchie) esponendo la coda ad una lampada di calore rosso per 5 min.
   Attenzione: Non surriscaldare l'animale. Tenere la lampada a una distanza di sicurezza (> 30 cm).
   1. Trattenere l'animale in posizione sternale utilizzando un dispositivo appropriato. Esporre e stabilizzare la coda con la mano non-dominante di immobilizzare la base della coda con l'indice e il dito medio e la regione metà distale della coda con il pollice e il dito anulare.
      Attenzione: Non applicare troppa forza sulla punta della coda come la pelle può essere tirata fuori. Inserire l'ago con lo smusso rivolto verso l'alto nella vena. Tenere l'ago parallelo alla vena in ogni momento, come è facile da forare la vena.
      Nota: Sangue entrino nella siringa può verificarsi ed è un segno di una bella iniezione. Piegare l'ago con un angolo di 90° può facilitare la somministrazione endovenosa. Confermare con il vostro ufficio di sicurezza come piegatura aghi possono rappresentare un pericolo.
   2. Iniettare per via endovenosa 200 µ l nella vena caudale. Il fluido deve fluire facilmente e temporaneamente deselezionare la vena.
      Attenzione: Non forzare liquido in se si incontra resistenza. Questo è segno di smarrimento dell'ago.
   3. Consentire l'anticorpo di circolare per 5 min prima umanamente eutanasia del mouse.

3. cuore isolando e digestione

1. Eutanasia topi usando CO₂ o di altra procedura istituzionalmente accettato l'eutanasia.
   1. Per CO₂ eutanasia, posizionare il mouse nella camera CO₂ e impostare la velocità di riempimento al 20% del volume camera al minuto (cioè, se la camera è 10 L, riempimento a 2 L/min). Eseguire per 2 min e monitor mouse fino a quando la respirazione è cessato.
   2. Spegnere la CO₂ e lasciare il mouse per un ulteriore 1-2 minuti verificare respirazione ha smesso prima di aprire la camera ed eseguire un pizzico di punta per confermare che il mouse è morto prima di procedere per elaborare il mouse.
2. Spruzzare il mouse con etanolo al 70%. Sollevare la pelle all'addome e sezionare il mouse tagliando lungo l'inizio della linea ventrale mediana a livello dei fianchi fino allo sterno. Aprire l'addome e spostare il fegato per esporre il diaframma.
3. Tagliare il diaframma, quindi le costole su entrambi i lati della linea mediana, facendo attenzione ad evitare di perforare i polmoni e il cuore.
   1. Esporre il cuore da peeling schiena le costole, quindi primo taglio gli atrii di sinistro seguiti da atri destro.
      Attenzione: Usare cautela quando si tagliano gli atrii, garantendo che arterie o vene non sono ferite, come questo può ridurre l'efficienza del lavaggio il sangue contenuto negli organi.
   2. Irrorare il cuore con 15 – 20 mL di PBS freddo utilizzando una siringa da 60 mL con ago 21 G e PBS freddo. Delicatamente afferrare la base del cuore con la pinzetta e inserire l'ago nel ventricolo di sinistra vicino all'apice. Ripetere la procedura nel ventricolo di destra. Un'iniezione corretta si traduce in bianchi polmoni e fegato pallido.
      Nota: Perfusione deve essere eseguita entro 5 minuti dopo l'eutanasia per evitare la coagulazione del sangue, che può contaminare gli organi di interesse con cellule circolanti.
4. Tenere la base del cuore con il forcipe e delicatamente tirare il cuore, quindi staccare il cuore dal taglio delle arterie polmonari principali e vene, aorta e il sacco pericardico.
   1. Pulire il cuore tenendo delicatamente il cuore tra il dito indice e il pollice in un tovagliolo di carta pulito privo di lanugine e tirare fuori gli atrii ed i resti delle principali arterie e vene e qualsiasi altri contaminanti con il forcipe.
      Nota: Garantire la totalità degli atrii è rimosso e non altri tessuti, quali il polmone o vasi sanguigni, sono presenti come questi tessuti hanno loro proprie cellule immunitarie residente. Il polmone, in particolare, ha una popolazione di grandi cellule immuni che possa mascherare le popolazioni più piccole di quelle all'interno del miocardio.
5. Mettere il cuore in un piatto di plastica di 5cm con 50 µ l di PBS freddo.
   1. Tritare il cuore utilizzando forbici per dissezione curve fino a quando non ci sono nessun pezzi visibili e ha una consistenza liscia.
      Nota: Provare a mantenere il cuore in una area contenuta del piatto durante il tagliere per minimizzare la perdita di tessuto.
   2. Trasferimento thetrituratedheart tessuto usando il forcipe curvo in provetta da 2 mL microcentrifuga con di 800 µ l freddo Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM).
6. Aggiungere 450 U/mL ofcollagenase io, 60 U/mL di ialuronidasi tipo S e 60 U/mL di dnasi-I per ogni campione.
   1. Incubare i campioni a 37 ° C in un agitatore oscillante a 50 giri/min per 45 – 60 min.
7. Dopo la digestione, brevemente campioni di vortice (20 s) e collocare immediatamente sul ghiaccio per mantenere i campioni a 4 ° C.
   1. Utilizzo di una pipetta da 1 mL, pipettare campioni su e giù fino a quando i campioni di tessuto sono omogenei e non intasare la punta della pipetta.
      Nota: Definizione di un determinato numero di volte per pipettare può aumentare riproducibilità. Se i cuori non sono digeriti in modo ottimale, pezzi del miocardio possono ostruire la pipetta. Macinazione delicatamente la punta della pipetta contro il tubo del microcentrifuge aiuterà a omogeneizzare i grandi pezzi di tessuto.
8. Pre-bagnato un colino di cella µm 40 collocato su una provetta conica da 50 mL con 1 mL di HBB freddo.
   1. Aggiungere il campione omogeneizzato al filtro e lavare attraverso versando lentamente 12 – 14 mL di HBB freddo.
   2. Trasferire campioni filtrati in una provetta conica di etichettati 15ml e conservare a 4 ° C.
9. Centrifugare i campioni a 400 x g per 5 min a 4 ° C. Aspirare il sovranatante.
   1. Lisare cellule rosse del sangue aggiungendo 1 mL di tampone di lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) per ogni campione. Risospendere i campioni nel vortex e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
   2. Una volta completata la lisi, aggiungere 5 – 8 mL di freddo di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) per interrompere il hemolysis.
10. Centrifugare i campioni a gper 400 x 5 min a 4 ° C. Aspirare il sovranatante.
11. Aggiungere 1 mL di tampone di FACS per ogni campione e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga etichettati 1,5 mL.
    Nota: Il protocollo può essere sospesa qui per fino a 2 h con campioni conservati a 4 ° C.

4. flusso Cytometry macchiatura e analisi

1. Centrifugare i campioni a 400 x g per 5 min a 4 ° C.
   1. Per ridurre il legame non specifico anticorpo, diluire 1: 100 anti-CD16/CD32 e monocito Blocker (01:20) (vedere Tabella materiali) contabilizzazione per 50 µ l FACS per campione. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
   2. Preparare la contabilità di diluizione (1: 250 per ogni anticorpo) anticorpo 50 µ l di FACS per campione.
      Nota: Un colorante di redditività può essere incluso nell'anticorpo cocktail al fine di escludere le cellule morte. In alternativa, l'esclusione di piccole dimensioni di analisi del flusso può essere usato (Figura 1C e D).
   3. Senza lavaggio, aggiungere 50 µ l di mix master anticorpo per ogni campione e mescolare.
   4. Incubare i campioni a 4 ° C per 30 min al buio.
2. Aggiungere 600 µ l FACS per ciascun campione per lavare e centrifugare i campioni a 400 x g per 5 min a 4 ° C.
3. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 300 µ l FACS. Mantenere i campioni a 4 ° C al buio.
   Nota: Alcuni coloranti di vitalità, come DAPI, richiedono la macchiatura entro 10 min prima dell'esecuzione di citometria a flusso.
4. Analizzare mediante citometria a flusso (Vedi figure 1 e 2) all'interno dei seguenti 3 h. Se un tempo più lungo è richiesto, a breve termine fissazione utilizzando un paraformaldeide bassa concentrazione (0,5 – 1% in PBS) è consigliato per preservare la macchiatura.
   Nota: Si consiglia di filtrare campioni attraverso un colino di cella di 40 µm prima dell'analisi di citometria a flusso avviare al fine di prevenire l'ostruzione della fluidica del citofluorimetro.

Results

Fin qui, nessun buon metodo è stato progettato per isolare le cellule immuni da altri componenti di cellula cardiaca, come cardiomiociti. Quindi, analisi della sospensione singola cellula cardiaca tramite flusso cytometry richiedono un pre-gating con CD45 per identificare le popolazioni delle cellule immuni, seguite dalla singola cella e piccola dimensione esclusione gating (Figura 1A). In alternativa, una vitalità colorazione possono essere ...

Discussion

Infiammazione del miocardio, o miocardite, è una caratteristica delle malattie cardiovascolari più. Tuttavia, il miocardio non è privo di propri componenti immuni negli Stati di non-malattia. Durante stato stazionario, molte cellule immunitarie risiedono nel miocardio e svolgono un ruolo essenziale di manutenzione e protezione. La caratterizzazione di queste diverse popolazioni di cellule non sarebbe stato possibile senza i metodi come quello presentato in questo protocollo.

Una combinazione d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione salina tamponata con fosfato	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0,8 mm x 40 mm) Ago PrecisionGlide	BD	305167
Hank' s Soluzione salina bilanciata	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Siero bovino	Sigma	B9433
0,5 M Acido etilendiamminotetraacetico	BioShop	EDT111
Filtro sottovuoto, 0,2 &; m Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
Siringa da insulina 28 G 1/2 1 cc	BD	329424
Siringa da 60 ml	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium Wisent		319-005-CL	1x DMEM con 4,5 g/L di glucosio e L-Glutammina e Piruvato di Sodio
Collagenasi I	Sigma	C0130	da Clostridium histolyticum
Ialuronidasi tipo I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	da pancreas bovino
Filtro cellulare, 40 &; m Nylon	Falcon	352340
tampone di lisi Cloruro di Ammonio-Potassio (ACK)	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-topo/umano CD11b	Biolegend	101222	diluizione 1:250
APC/Cy7 anti-topo Ly-6c	Biolegend	128025	diluizione 1:250
APC anti-topo CD103	Biolegend	121414	diluizione 1:250
Brilliant Violet 605 anti-topo CD11c	Biolegend	117334	diluizione 1:250
PE anti-topo Ly-6G	Biolegend	127607	diluizione 1:250
Blue anti-topo I-Ab Biolegend		116422	diluizione 1:250
FITC anti-topo CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	diluizione 1:250
PE/Cy7 anti-topo CD45	Biolegend	103113	diluizione 1:250
PerCP/Cy5.5 anti-topo CD45	Biolegend	103132	diluizione 1:40
TruStain fcX (anti-topo CD16/32)	Biolegend	101320	diluizione 1:100
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	diluizione 1:20
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	Il laboratorio Jackson	JAX: 013755