Isolamento e identificazione di cellule immunitarie extravascolare del cuore

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo semplice ed efficace per isolare, identificare e quantificare le cellule immuni che risiedono nel miocardio dei topi durante stato stazionario o l'infiammazione. Il protocollo combina digestione enzimatica e meccanica per la generazione di una sospensione di singola cellula che può essere ulteriormente analizzata tramite flusso cytometry.

Abstract

Il sistema immunitario è una componente essenziale di un cuore sano. Il miocardio è sede di una popolazione ricca dei sottoinsiemi delle cellule immuni differenti con compartimentazione funzionale sia durante stato stazionario diverse forme di infiammazione. Fino a poco tempo, lo studio delle cellule immunitarie nel cuore ha richiesto l'uso di microscopia o protocolli di digestione poco sviluppati, che fornito di sensibilità sufficiente durante l'infiammazione severa, ma erano tranquillamente in grado di identificano piccoli — ma chiave — popolazioni di cellule durante lo stato stazionario. Discutiamo qui, un metodo semplice combinazione enzimatica (collagenasi, ialuronidasi e DNasi) e digestione meccanica del cuore murino preceduta da somministrazione intravascolare di anticorpi fluorescente etichettati per differenziare piccolo ma inevitabile contaminanti intravascolare delle cellule. Questo metodo genera una sospensione di cellule vitali isolate che può essere analizzato tramite flusso cytometry per fenotipizzazione di identificazione e quantificazione, o ulteriormente purificate con fluorescenza-attivato delle cellule l'ordinamento o la separazione di biglie magnetiche per studi di analisi o in vitro trascrizionali. Includiamo un esempio di una dettagliata analisi citofluorimetrica per differenziare la chiave del macrofago e popolazioni di cellule dendritiche del cuore. Per un esperimento di dimensione medio (10 cuori) il completamento della procedura richiede 2 – 3 h.

Introduzione

Diverse forme di stress del miocardio o danno, inclusi ischemico (ischemia riperfusione o infarto del miocardio) e non-ischemica (ipertensione o miocardite), promuovere il reclutamento di cellule infiammatorie con riparatore e protettivo, ma anche Proprietà patogene. Già nel 1891, Romberg descritto in primo luogo la presenza di infiltrati cellulari nel miocardio dei pazienti infettati con il tifo e la scarlattina¹. Tuttavia, lo studio dettagliato delle cellule immuni cardiache richiesto lo sviluppo di tecniche più avanzate di immunofenotipizzazione. Di conseguenza, solo recentemente abbiamo iniziato a capire che una popolazione eterogenea di ce....

Protocollo

Dichiarazione etica: questo protocollo è stato esaminato e approvato dal comitato di cura degli animali alla rete di salute dell'Università (Toronto, Canada) ed è in conformità con il Consiglio canadese su Animal Care.

1. preparazione buffer

1. Preparare il tampone di HBB (di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS), siero bovino 2% calore inattivato, 0,2% di sieroalbumina bovina). Aggiungere 10 mL di calore inattivato siero bovino e 1 g di albumina di siero bovino a 500 mL di HBSS. Filtro sterilizzare attraverso un filtro di 0,2 µm e conservare a 4 ° C.
2. Preparare il tampone di FACS (tampone fosfato salino (PBS), inattivato co....

Risultati

Fin qui, nessun buon metodo è stato progettato per isolare le cellule immuni da altri componenti di cellula cardiaca, come cardiomiociti. Quindi, analisi della sospensione singola cellula cardiaca tramite flusso cytometry richiedono un pre-gating con CD45 per identificare le popolazioni delle cellule immuni, seguite dalla singola cella e piccola dimensione esclusione gating (Figura 1A). In alternativa, una vitalità colorazione possono essere .......

Discussione

Infiammazione del miocardio, o miocardite, è una caratteristica delle malattie cardiovascolari più. Tuttavia, il miocardio non è privo di propri componenti immuni negli Stati di non-malattia. Durante stato stazionario, molte cellule immunitarie risiedono nel miocardio e svolgono un ruolo essenziale di manutenzione e protezione. La caratterizzazione di queste diverse popolazioni di cellule non sarebbe stato possibile senza i metodi come quello presentato in questo protocollo.

Una combinazione d.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina tamponata con fosfato	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0,8 mm x 40 mm) Ago PrecisionGlide	BD	305167
Hank' s Soluzione salina bilanciata	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Siero bovino	Sigma	B9433
0,5 M Acido etilendiamminotetraacetico	BioShop	EDT111
Filtro sottovuoto, 0,2 &; m Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
Siringa da insulina 28 G 1/2 1 cc	BD	329424
Siringa da 60 ml	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium Wisent		319-005-CL	1x DMEM con 4,5 g/L di glucosio e L-Glutammina e Piruvato di Sodio
Collagenasi I	Sigma	C0130	da Clostridium histolyticum
Ialuronidasi tipo I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	da pancreas bovino
Filtro cellulare, 40 &; m Nylon	Falcon	352340
tampone di lisi Cloruro di Ammonio-Potassio (ACK)	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-topo/umano CD11b	Biolegend	101222	diluizione 1:250
APC/Cy7 anti-topo Ly-6c	Biolegend	128025	diluizione 1:250
APC anti-topo CD103	Biolegend	121414	diluizione 1:250
Brilliant Violet 605 anti-topo CD11c	Biolegend	117334	diluizione 1:250
PE anti-topo Ly-6G	Biolegend	127607	diluizione 1:250
Blue anti-topo I-Ab Biolegend		116422	diluizione 1:250
FITC anti-topo CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	diluizione 1:250
PE/Cy7 anti-topo CD45	Biolegend	103113	diluizione 1:250
PerCP/Cy5.5 anti-topo CD45	Biolegend	103132	diluizione 1:40
TruStain fcX (anti-topo CD16/32)	Biolegend	101320	diluizione 1:100
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	diluizione 1:20
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	Il laboratorio Jackson	JAX: 013755

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