Articolo metodologico

Derivazione e differenziazione delle cellule mesenchimali ovarico canini

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DOI:

10.3791/58163

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16 dicembre 2018

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1The School of Agricultural and Veterinary Studies (FCAV), Jaboticabal, São Paulo State University (UNESP), 2CRRF, Université de Montréal, 3FZEA, University of São Paulo, 4FMVZ, University of São Paulo

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento, espansione e differenziazione delle cellule staminali mesenchimali da tessuto ovarico canino.

Abstract

Interesse in cellule staminali mesenchimali (MSCs) è aumentato nell'ultimo decennio grazie alla loro facilità di isolamento, espansione e cultura. Recentemente, gli studi hanno dimostrato la capacità di vasta differenziazione che queste cellule possiedono. Ovaia rappresenta un candidato di promessa per le terapie basate sulle cellule dovuto al fatto che è ricco di MSCs e che viene spesso ignorata dopo interventi chirurgici ovariectomia come rifiuti biologici. Questo articolo vengono descritte le procedure per l'isolamento, espansione e differenziazione di cellule staminali mesenchimali derivate dall'ovaia canino, senza la necessità di ordinamento delle cellule tecniche. Questo protocollo rappresenta un importante strumento per la medicina rigenerativa a causa l'ampia applicabilità di queste cellule altamente differenziabile in studi clinici e usi terapeutici.

Introduzione

Il numero degli studi pubblicati che lo stato attivo sulle cellule staminali è aumentato notevolmente nell'ultimo decennio, uno sforzo di ricerca che è stato alimentato dall'obiettivo collettivo di scoprire terapie potente medicina rigenerativa. Le cellule staminali hanno due marcatori definizione primari: auto - rinnovamento e differenziazione. Cellule staminali mesenchimali sono responsabili del suo fatturato regolare del tessuto e hanno una più limitata capacità di differenziazione rispetto alle cellule staminali embrionali1. Recentemente, molti studi hanno dimostrato una vasta gamma di differenziazione di cellule staminali mesenchimali, e un argomento in discussione è se esistono differenze tra cellule staminali embrionali ed adulte a tutti2.

L'epitelio di superficie ovarium è un commit strato di cellule, relativamente meno differenziato, che esprime entrambi marcatori epiteliali e mesenchimali3, mantenendo la capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule in risposta a segnali ambientali4. La posizione esatta delle cellule staminali nell'ovaia non è ben nota; Tuttavia, è stato proposto che bipotential progenitori in tunica albuginea dare origine a cellule germinali5. Gli studi immunologici hanno ipotizzato che queste cellule hanno un origine stromal6 o si trovano in o prossimale alla superficie dell'ovaia7. Poiché le cellule staminali mesenchimali esprimono numerosi recettori che svolgono un ruolo importante nella cellula adesione8, un esperimento è stato progettato per verificare l'ipotesi che la selezione di una popolazione di cellule con adesione rapida isolerebbero chiaramente una popolazione di cellule caratterizzabili come mesenchymal in natura. Recentemente, il nostro gruppo ha riferito la derivazione di cellule staminali mesenchimali da tessuto ovarico basata sulla loro capacità di aderenza alla superficie plastica del piatto cultura dei primi 3 h di cultura, al fine di ottenere una popolazione purificata delle cellule che esibiscono adesione rapida9. Qui, descriviamo il metodo sviluppato per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto ovarico.

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Protocollo

Questo esperimento è stato effettuato con le ovaie di quattro cani femminili ibridi ha donati dopo chirurgia elettiva in un programma di sterilizzazione canini. Questo esperimento è stato approvato dal comitato etico sull'uso degli animali di UNESP-FCAV (protocollo n. 026991/13).

1. preparazione sperimentale

  1. Preparare o acquistare 500 mL di soluzione tampone fosfato sterile di Dulbecco (DPBS) senza calcio o magnesio.
  2. Preparare una collagenasi stock soluzione mescolando 40 µ g di enzima in 1 mL di DPBS. Filtrare usando un filtro di siringa 0,2 µm e conservare le 2 mL aliquote a-20 ° C.
  3. Preparare i terreni di coltura da glucosio basso di medium (DMEM) dell'Aquila di Dulbecco modificato con 10% siero fetale e l'1% degli antibiotici.
  4. Raccogliere materiali sterili: forbici e pinze, una boccetta di coltura del tessuto, piatti, tubi e pipette da 10 mL e 5 mL.
  5. Utilizzare attrezzature di laboratorio di cultura cella standard: una cappa di sicurezza biologica (BSC), un'incubatrice di coltura cellulare impostata in una centrifuga e 38 ° C e 5% CO2 .
  6. Pulire il BSC: con le mani guantate, sterilizzarlo con 70% EtOH, utilizzando luci UV.

2. isolamento di cellule staminali mesenchimali da ovaio

  1. Dopo l'intervento chirurgico, mantenere le ovaie in PBS sul ghiaccio in un tubo conico, fino al loro arrivo al laboratorio.
  2. Riempire due capsule di Petri 100 mm con 10 mL di PBS.
  3. Rimuovere le ovaie dal tubo e trasferirli il primo piatto di Petri con PBS. Lavarli con movimenti di miscelazione.
  4. Delicatamente recuperare l'ovaio e inserirlo in un altro piatto. Con forbici e pinzette sterili, tritare il tessuto in pezzi molto piccoli, circa 1 mm di dimensione.
  5. Trasferire il tessuto ovarico a un 35 mm di Petri e aggiungere 2 mL di collagenasi. Tritare il tessuto un po' di più.
  6. Posizionare la piastra di Petri nell'incubatore a 38 ° C per 3 h e agitare delicatamente la capsula di Petri con movimenti circolari ogni 20 min.
  7. Dopo 3 h, è necessario rimuovere la capsula di Petri dall'incubatrice.
  8. Trasferire il contenuto del piatto per un tubo da 15 mL. Aggiungere 5 mL di media espansione.
  9. Capovolgere delicatamente la provetta prima centrifugazione. Centrifugare la provetta a 2100 x g per 7 minuti rimuovere il surnatante e risospendere il sedimento con 3 mL di media espansione.
  10. Trasferire il pellet per una bottiglia di T25. Posizionare la bottiglia nell'incubatore con 5% CO2 a 38 ° C per 3 h.
    Nota: La parte più importante della procedura è quello di cambiare il supporto dopo 3 h di incubazione.
  11. Rimuovere la bottiglia dall'incubatrice e rimuovere il supporto con il tessuto rimanente. Aggiungere 3 mL di media espansione fresco alla bottiglia.
  12. Modificare i media ogni 48 h e osservare la bottiglia per cellulare confluenza.
    Nota: Le fasi principali della procedura possono essere osservate nella Figura 1.

3. espansione di cellule staminali mesenchimali da ovaio

  1. Passaggio delle cellule
    1. Quando le cellule raggiungono la confluenza, rimuovere il supporto dalla bottiglia.
    2. Lavare la bottiglia con 3 mL di PBS. Rimuovere il PBS.
    3. Aggiungere 1,5 mL di tripsina e mettere la bottiglia in incubatrice a 38 ° C per 3 min. Picchiettare delicatamente la bottiglia per aiutare le cellule a staccare.
      Nota: Le celle dovrebbero raggiungere la confluenza circa 5 - 7 d dopo la placcatura iniziale.
    4. Aggiungere 3 mL di media espansione e trasferire il contenuto in una provetta conica.
    5. Centrifugare la provetta a 2100 x g per 7 minuti rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di media espansione.
    6. Mescolare delicatamente il contenuto della provetta.
    7. Prendere un'aliquota di 10 µ l di campione per eseguire cella conteggio e rimettere il tubo con le cellule in incubatrice.
    8. Posto 10 µ l della miscela nell'emocitometro.
  2. Contando le cellule
    1. Utilizzare obiettivo del microscopio 10X e concentrarsi sulle linee della griglia dell'emocitometro.
    2. Contare le celle in cinque piccole piazze (Figura 2).
    3. Moltiplicare il numero contato per 50.000 per stimare il numero di cellule per millilitro.

4. la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali da ovaio

Nota: Analisi di differenziazione sono state eseguite secondo le linee guida stabilite in Hill et al. 9.

  1. Cellule di4 seme 1.0 x 10 per pozzetto, in triplice copia, utilizzando una piastra di coltura 4 pozzetti.
  2. Aggiungere 1 mL di media espansione.
  3. Agitare delicatamente il piatto con movimenti circolari.
  4. Dopo 24 h, sostituire i terreni di coltura con i media di differenziazione desiderabile.
  5. Per osteogenica, adipogenico e differenziazione condrogenica, incubare le cellule con il supporto di induzione per 30D, con sostituzione dei supporti ogni 3 kit di differenziazione specifica d. sono stati utilizzati per ciascuno di questi test.
  6. Per differenziazione di lignaggio neurogena, incubare le cellule per 10 d nei media ad induzione, con sostituzione dei supporti ogni d 3. I supporti utilizzati qui contenevano DMEM basso del glucosio, acido valproico 2 mM, 1 idrocortisone µM, 10 µM forskolin, cloruro di potassio di 5 mM, 5 µ g/mL insulina e 200 µM idrossianisolo butilato.
  7. Per precursori endoderma, incubare per 5 d media endoderma secondo le istruzioni del produttore dei reagenti.
  8. Per il differenziamento di cellule germinali primordiali lignaggio, incubare le cellule nei media di induzione per 14 d, con sostituzione dei supporti ogni d 3. I supporti utilizzati qui contenute DMEM 10% FBS, piruvato di sodio di 1 mM, LIF, aminoacidi non essenziali di 1 mM, 2 mM L-Glutammina, 5 µ g/mL insulina, 0,1 mM β-mercaptoetanolo, putrescina di 60 µM, transferrina di 20 µ g/mL, 10 ng/mL del mouse fattore di crescita epidermico, 1 ng/mL umano 10 ng/mL fattore di crescita di base del fibroblasto, 40 ng/mL umani glial cell fattore neurotrophic linea-derivato e penicillina 15 mg/L.

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Risultati

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da ovaio canino:

La procedura di isolamento MSC ovarica è riassunto nella Figura 1. Dopo chirurgia, tessuto tritacarne, digestione della collagenosi e un cambiamento di media 3 h dopo l'inizio della cultura, una popolazione di MSC putativa con rapida plastica-adesivo proprietà era correttamente isolata da tessuto ovarico ...

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Discussione

Qui forniamo la prova che MSCs possono essere isolate da tessuto ovarico canino, che è considerato un rifiuto biologico dopo l'ovariectomia. Dovuto al fatto che molti tipi di cellule possono essere trovati nell'ovaia, abbiamo proposto un protocollo per selezionare MSCs basato sulla loro aderenza rapida alla plastica, che ha selezionato correttamente le cellule che si è sviluppato in un monostrato con una morfologia di fibroblasto-come.

Il primo rapporto della derivazione di cellule staminali m...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono il programma di sterilizzazione canina a UNESP-FCAV per aver gentilmente fornito le ovaie. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da FAPESP (processo n. 2013/14293-0) e mantelle.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DPBS Thermo Fisher14190144
Collagenase IThermo Fisher17100017
Pallone per fazzolettiCorningCLS3056
DMEM a basso contenuto di glucosioThermo Fisher11054020
FBSThermo Fisher12484-010
TrypLE expressThermo Fisher12604021
StemPro Kit di differenziazione per l'adipogenesiThermo FisherA1007001
StemPro Kit per la differenziazione della condrogenesiThermo FisherA1007101
StemPro Kit per la differenziazione dell'osteogenesiThermo FisherA1007201
STEMdiff Kit per endoderma definitivoStemCell5110
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher15070063
CD45AbD SerotecMCA 2035S
CD34AbD SerotecMCA 2411GA
CD90AbD SerotecMCA 1036G
CD44AbD SerotecMCA 1041
NestinMiliporeMAB353
β-Tubulina MiliporeMAB1637
DDX4InvitrogenPA5 -23378
IgG- FITCAbD SerotecSTAR80F
IgG- FITCAbD SerotecSTAR120F

Riferimenti

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