Un tempo, accurato e riproducibile efficiente quantitativa PCR (qPCR) metodo per enumerare fago T7 è descritto qui. Il protocollo descrive chiaramente la preparazione di DNA genomico dei fagi, preparazione di reazione di PCR, qPCR ciclismo condizioni e analisi dei dati di qPCR.
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Articolo metodologico
PCR quantitativa del batteriofago T7 da Biopanning
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive l'uso della PCR quantitativa (qPCR) per enumerare T7 fagi da esperimenti di selezione dei fagi (cioè, "biopanning"). qPCR è un approccio basato su fluorescenza per quantificare il DNA, e qui, è adattato a quantificare i genomi dei fagi come un proxy per particelle dei fagi. In questo protocollo, un metodo di preparazione del DNA dei fagi facile è descritto mediante riscaldamento ad alta temperatura senza ulteriore purificazione del DNA. Il metodo deve solo piccoli volumi di fagi trattato termicamente e piccoli volumi di reazione qPCR. qPCR è alto-rendimento e veloce, in grado di elaborare e ottenere dati da una piastra a 96 pozzetti delle reazioni in 2 – 4 h. rispetto ad altri metodi di enumerazione dei fagi, qPCR è più efficiente in termini di tempo. Qui, qPCR viene utilizzato per enumerare T7 fagi identificati da biopanning contro il modello in vitro fibrosi cistica-come muco. Il metodo di qPCR può essere esteso per quantificare T7 fagi da altri esperimenti, compresi altri tipi di biopanning (ad es., screening di fagi immobilizzato il legame con le proteine, in vivo ) e da altre fonti (ad esempio, sistemi di acqua o fluidi corporei). In sintesi, questo protocollo può essere modificato per quantificare eventuali virus DNA-incapsulato.
Introduzione
Tecnologia di visualizzazione del batteriofago (fago), sviluppata da George Smith nel 1985, è un approccio potente, ad alta produttività per identificare ligandi del peptide o della proteina contro bersagli o recettori dalla membrana cellulare, gli antigeni malattia, organelli cellulari o specifici organi e tessuti in passato due decenni1,2. Qui, librerie casuale di polipeptidi o singola catena anticorpi vengono visualizzate sulle proteine cappotto di fagi (in genere M13 o T7) e ligandi specifici possono essere identificati da panning contro proteine immobilizzate in vitro o in vivo sistemi b....
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Protocollo
1. primer Design e analisi di DNA Genomic di fago T7
- Disegno primer per l'amplificazione del DNA genomico di fago T7.
Nota: F (in avanti) e R (retromarcia) primer (Vedi Tabella materiali) amplificano la sequenza del DNA T7 situato a Monte della regione variabile libreria (Figura 1). - Scegliere un analizzatore di primer appropriato per valutare i parametri degli iniettori, compreso temperatura di fusione (Tm), contenuto percentuale di GC (GC %), dimeri dell'iniettore, tornante formazione e idoneità PCR (Figura 1).
- Ordinare gli oligonucleotidi primer (oligos) e a....
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Risultati
Strumenti di progettazione di differenti dell'iniettore possono essere utilizzati per disegnare primers qPCR. In genere, disegno dell'iniettore di programmi hanno i propri algoritmi incorporati per calcolare e convalidare i parametri chiave del primer, per esempio GC %, Tm, dimero di primer o formazione di tornante, ecc. in generale, i criteri principali sono simili in diverse strumenti di progettazione di primer e primer può essere progettato seguendo le loro istruzioni.......
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Discussione
Abbiamo sviluppato metodi di qPCR per quantificazione di DNA genomico dei fagi5, e qui abbiamo descritto e adattato un metodo qPCR per enumerare T7 fagi selezionati contro una barriera di CF-come muco. Informazioni minime per le linee guida di pubblicazione di quantitativa Real-Time PCR esperimenti (MIQE) sono stati adattati per sviluppare e validare il metodo qPCR per l'enumerazione di T7 fagi15. Il protocollo che abbiamo sviluppato per quantificare i fagi da esperimenti d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da PhRMA Foundation Research Grant Starter e cuore nazionale, polmone e sangue Institute of National Institutes of Health concedere sotto numero premio R01HL138251.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali e reagenti | |||
| Primer per DNA genomico T7 IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT | ||
| T7 Seleziona il controllo dell'imballaggio DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp piastra di reazione ottica a 96 pozzetti | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| Kit di pellicole adesive ottiche MicroAmp | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Kit di clonazione | EMD Millipore | 70015 | Protocolli utente : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| Soluzione DNasi I | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| Piastra transwell a 24 pozzetti | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNasi/RNase-Free H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (1x) | Corning | 21040CV | |
| strong>Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Sistema di PCR in tempo reale con blocco rapido a 96 pozzetti | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuga | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Miscelatore a vortice digitale | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Riscaldatore Multi-Blok | ThermoFisher Scientific Modello | : 2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuga | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Micropiastra Rotore a secchio oscillante | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Nome | Azienda | Numero catalogo | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Software per PCR in tempo reale | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Progettazione di primer qPCR in tempo reale | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
Riferimenti
- Smith, G. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).
- Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W.
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Ristampe e permessi
