Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

Sommario

Questo protocollo descrive l'immobilizzazione covalente di proteine con un eterobifunzionali silanico per superfici di ossido di silicio progettati per la spettroscopia della forza singola molecola basata di microscopia forza atomica che è esemplificato dalla interazione di RrgA (adesina pilus-1 punta di S. pneumoniae) con fibronectina.

Abstract

Negli ultimi anni, la microscopia a forza atomica (AFM) basata spettroscopia della forza singola molecola (SMF) estesa la nostra comprensione delle proprietà molecolari e funzioni. Ci ha dato l'opportunità di esplorare una molteplicità di meccanismi biofisici, ad esempio, come batterica adhesins bind per i ricevitori di superficie di host in modo più dettagliato. Tra gli altri fattori, il successo di SMF esperimenti dipende il funzionale e nativo di immobilizzazione di biomolecole di interesse su superfici solide e punte dell'AFM. Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'accoppiamento covalente di proteine per superfici di silicio utilizza silano-PEG-carboxyls e la chimica di N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) ben consolidata in ordine per esplorare l'interazione di pilus-1 adesina RrgA dal batterio gram-positivo Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) con la matrice extracellulare della proteina fibronectina (Fn). I nostri risultati indicano che la funzionalizzazione superficiale conduce ad una distribuzione omogenea di Fn sulla superficie del vetro e ad una concentrazione appropriata della RrgA sulla punta AFM a sbalzo, apparente per il valore di destinazione fino al 20% degli eventi di interazione durante SMF misure e ha rivelato che RrgA si lega a Fn con una forza media di 52 pN. Il protocollo può essere regolato a coppia tramite sito specifico gratuito gruppi tiolici. Questo si traduce in un orientamento predefinito di proteina o molecola ed è adatto per altre applicazioni biofisiche oltre le SMF.

Introduzione

Al lato di pinzette ottiche e magnetiche, la forza atomica (AFM) microscopio^1,2 è emersa come uno strumento utile per analizzare e manipolare molecole e sonda di loro proprietà e funzioni, come la loro risposta a una forza esterna^{3 ,4}. Al contrario ai metodi come l'analisi dell'immunosorbente collegata enzima (ELISA), superficie risonanza plasmonica (SPR) o cristallo di quarzo (QCM) microbilancia configurazioni, AFM permette di misurare le interazioni nella singola molecola (SMF)⁵ e il livello di singola cellula (SCFS)⁶ . Queste tecnologie hanno reso informazioni preziose in meccanismi di associazione come i legami di cattura trovati per l'interazione della proteina di e. coli pilus che ripete FimH con mannosio⁷o il tandem β-cerniera formata da proteine leganti Fn da S. aureus legandosi a Fn⁸. Siamo stati recentemente in grado di dimostrare che l'adesina pilus-1 RrgA^9,10 dal batterio gram-positivo Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)¹¹ è in grado di legarsi al fibronectin¹² con i suoi due domini terminal. Ciò ha rivelato un nuovo meccanismo di associazione di due domini che differisce dal tandem β-cerniera e può attivare piliated pneumococchi a formare e mantenere una transitoria host contatto al fibronectin-contenenti superfici¹³.

Il successo di SMF esperimenti dipende criticamente l'immobilizzazione funzionale e nativo di biomolecole su superfici solide e punte dell'AFM. Come forze elevate possono verificarsi durante le misurazioni di SMF, le proteine preferibilmente dovrebbero essere accoppiate covalentemente alla superficie. Ci sono un gran numero di metodi differenti di accoppiamento per l'immobilizzazione di proteine e altre biomolecole, come pure le cellule intere su superfici solide (inorganiche), nano-particelle e altri dispositivi descritti nella letteratura^{14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27}. Questi protocolli fanno spesso uso di sostanze pericolose, sono difficili da eseguire e/o richiedono attrezzature speciali (ad es., plasma cleaner). Un modo semplice per molecole di coppia al vetro è quello di attaccare uno strato più spesso di polimero di reticolanti eterobifunzionali con un gruppo Silano-reattivo su un lato e un gruppo dell'ammina-reattivo loro altro lato. A seconda dell'applicazione, gli agenti di accoppiamento possono essere costituito da catene di idrocarburi flessibili di lunghezza variabile, ad es., polietilenglicole (PEG). Essi sopprimere interazioni non specifiche delle superfici modificate (ad es., idrofobiche, elettrostatiche e van-der-Waals interazioni) e può fornire la libertà rotazionale molecola accoppiati.

Qui, descriviamo un protocollo generale per l'accoppiamento covalente di proteine che contengono uno o più gruppi amminici liberi (-NH₂) superfici di vetro e nitruro di silicio AFM suggerimenti tramite un eterobifunzionali etossi Silano-PEG-carbossilico (-COOH). Questo protocollo può essere usato negli esperimenti di SMF, che è esemplificato basati sull'interazione di RrgA e la proteina della matrice extracellulare Fn (vedere la Figura 1 per una panoramica).

Il primo passo è la silanizzazione della superficie^28,29,30,31. Coinvolge l'idrolisi dei gruppi etossi dell'agente di accoppiamento al fine di formare gruppi SiOH altamente reattivi. Questi possono reagire con i gruppi SiOH sul substrato. In una condensazione primaria passo, questi legami di idrogeno forma silanoli e diffondere sul substrato. In una reazione di condensazione secondario (che di solito richiede calore o vuoto per rimuovere l'acqua), si formano legami silossanici. In questo modo un strato di covalenza allegato organo-silani.

Il secondo passo è l'accoppiamento delle proteine per il funzionale (-COOH) gruppi che si estendono dal polimero³². In primo luogo, l'acido viene convertito in un estere N-hydroxysuccinimid (NHS) reattivo intermedio, che è acquisito attraverso la consolidata NHS/EDC (1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimid chimica³³ e subisce sostituzione nucleofila Infine formare un legame dell'ammide con le ammine primarie sulle proteine.

In questo modo, RrgA è stato accoppiato a punte dell'AFM nitruro di silicio e umano Fn per substrati di vetro in un orientamento casuale e le loro forze di interazione sono stati analizzati a livello di singola molecola. I nostri risultati indicano che la chimica di superficie descritto conduce ad una distribuzione omogenea di Fn sulla superficie del vetro e ad una concentrazione appropriata della RrgA sulla punta, apparente per il valore di destinazione fino al 20% degli eventi di interazione durante le misurazioni di SMF. Questa chimica riduce interazioni aspecifiche sfondo, è soggetto a variazioni poco durante l'acquisizione dei dati e pertanto è perfettamente adatta per gli esperimenti di SMF precisi.

Protocollo

1. immobilizzazione delle proteine tramite agenti di accoppiamento funzionale Silano

Nota: La Figura 1 fornisce una visione sopra la chimica di superficie applicata in questo protocollo.

Attenzione: Nel protocollo seguente, vengono utilizzati prodotti chimici differenti con corrosivo e pelle irritante proprietà. Indossare adeguati guanti (resistenti agli acidi), occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio e lavorare sotto la cappa durante la preparazione di soluzioni al fine di evitare l'inalazione dei vapori.

1. Funzionalizzazione di superfici di vetro e a sbalzo di nitruro di silicio con agenti di accoppiamento del silano
   1. Rimuovere la polvere grossolana e contaminazioni da lastre di vetro con isopropanolo e privo di lanugine precisione wipes e tagliare le diapositive nella dimensione desiderata (opzionale).
      Nota: Al lato di vetro, la superficie solida può essere silice, quarzo e ossidi di alluminio, rame, stagno, titanio, ferro, cromo, zirconio, nichel e zinco.
      Attenzione: Le diapositive di vetro di taglio può causare bordi taglienti.
   2. Posto il vetro i vetrini in una vaschetta di colorazione riempita di acido cloridrico (33% HCl) diluito con acqua bidistillata (ddH₂O) da 3-5% (v/v), chiudere il vasetto con coperchio appropriato e inserirlo in un bagno ad ultrasuoni per 90 min a temperatura ambiente.
      Nota: Il vaso utilizzato ha un diametro di 6 cm e una dimensione approssimativa di 65-70 mL. È un volume appropriato di HCl diluito per il vaso 50 mL contenente 5 mL 33% HCl e 45 mL di ddH₂O. L'HCl efficacemente rimuove ioni metallici non vincolanti, soprattutto sodio, potassio e calcio e riduce il silicio per produrre una superficie di vetro saturato di idrossile.
      Attenzione: HCl è corrosivo e irritante della pelle. Indossare adeguati guanti resistenti agli acidi, occhiali di sicurezza e laboratorio cappotto e lavorare sotto la cappa mentre si prepara la soluzione al fine di evitare l'inalazione dei vapori.
   3. Posizionare il nitruro di silicio AFM a sbalzo sonde su un vetrino pulito con la punta rivolta verso l'alto e irradiare con luce dall'alto per almeno 90 min ultravioletta.
      Nota: Per spettroscopia della forza singola molecola, cantilever con una costante primavera nominale di 0.01-0.1 N m^-1 sono adatti. Irradiazione della superficie a sbalzo con luce UV sarà rimuovere contaminanti organici, principalmente sostanze grasse e renderla idrofila su un lato. Se l'altro lato è fortemente contaminato - che non dovrebbe essere il caso, o se le sonde a sbalzo vengono utilizzate freschi fuori scatola dei fornitori - può colpire la misurazione di SMF. Una pulizia accurata del chip a sbalzo intero utilizzando la soluzione piranha, che è stato utilizzato in molti studi³⁴, può aiutare.
      Attenzione: La luce UV è dannosa per gli occhi; quindi, irradiazione delle sonde a sbalzo dovrebbe svolgersi in un alloggiamento impermeabile luce UV. Soluzione piranha è altamente reattivo e può bruciare la pelle, carta e altri materiali organici. Non utilizzare contenitori in plastica. Se inserito in piatti o vasi anche con piccole quantità di contaminazioni superficiali organici (per esempio, dall'uso precedente), può reagire rapidamente.
   4. Sostituire l'acido cloridrico nella vaschetta di colorazione con ddH₂O senza lasciare che la superficie di vetro asciutto e mettete il contenitore nel bagno ad ultrasuoni per un altro 10 min sostituire l'acqua due volte per 10 min rispettivamente a lavare correttamente il cloridrico acido.
   5. Nel frattempo, sciogliere etossi (o metossi) Silano polietilenglicole acido (Si (OC₂H₅)³-PEG-COOH) in una miscela di etanolo e ddH₂O (v/v 95% / 5%, pH 4.6 regolato con acido acetico) ad una concentrazione finale di 0,1 mg mL ^-1. Conservare la soluzione sigillata ermeticamente per evitare l'evaporazione dell'etanolo.
      Nota: Agenti di accoppiamento del Silano sono sensibili all'umidità e temperatura. Di conseguenza, devono essere conservati sotto gas inerte (N₂), a bassa temperatura (-20 ° C) e in condizioni di asciutto. Prima di aprire la muffola, assicurarsi che i silani hanno raggiunto la temperatura ambiente per ridurre al minimo idratazione e quindi passivazione dei gruppi reattivi. PEG eterobifunzionali agenti di accoppiamento sono disponibili con numerosi gruppi funzionali differenti e distanziale differenti lunghezze. Per casuale immobilizzazione di proteine tramite loro gruppi amminici liberi (NH₂), come descritto in questo protocollo, il gruppo funzionale supplementare per il silano etossi/metossi devono essere un estere di NHS. Accanto l'acquisto di un agente silano con estere NHS, un modo semplice per ottenere tali estere NHS è quello di attivare un gruppo carbossilico (-COOH) con 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) e NHS (vedere 1.2.1. e 1.2.2.).
      Attenzione: L'etanolo è infiammabile e irritante della pelle. L'acido acetico è corrosivo e infiammabile. Fare attenzione a non per ottenere silani reattivi sulla pelle o negli occhi. Indossare adeguati guanti, occhiali e camice da laboratorio e lavorare sotto la cappa al fine di evitare l'inalazione dei vapori.
   6. Versare la soluzione di silano in due piatti separati di Petri, posizionare le sonde preparate a sbalzo e vetrini in una capsula di Petri rispettivamente, chiudere ermeticamente (ad es., parafilm) per evitare l'evaporazione dell'etanolo e incubare stazionario per 90 min a a temperatura ambiente.
      Nota: La dimensione ottimale del piatto Petri dipende il numero di sonde a sbalzo e le dimensioni delle diapositive di vetro che dovrebbe essere funzionalizzati. Una dimensione di diametro per buona maneggevolezza e reagente basso volume è 50-60 mm. Per evitare di piegare indesiderato del cantilever, penetrando attraverso l'interfaccia di acqua aria cantilever dovrebbero tenersi verso l'interfaccia acqua-aria con un'angolazione di 90°. L'incubazione i vetrini (ma non le sonde a sbalzo) può essere trasportato su agitatore orbitale.
   7. Sciacquare i vetrini a sbalzo e vetro in tre consecutivi becher contenente etanolo puro per lavare completamente i composti di silano non associato.
      Nota: Per evitare flessioni indesiderate del cantilever, penetrando attraverso l'interfaccia di acqua aria, il cantilever dovrebbe tenersi ad un angolo di 90°.
   8. Posizionare i vetrini funzionalizzati nella vaschetta di colorazione e il a sbalzo su un vetrino pulito e la cura a 110 ° C per 30 min.
      Nota: Curare con il calore induce la formazione di legami covalenti silossano e la rimozione dell'acqua. Come i vetrini sono stati funzionalizzati solo da un lato, assicuratevi di indicare correttamente il lato patinato.
   9. Conservare i campioni di vetro silanizzata e a sbalzo sonde in un essiccatore sotto vuoto fino ad una settimana.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Casuale immobilizzazione delle proteine su cantilever di nitruro di silicio e vetro silanizzata
   Nota: Per evitare di piegare indesiderato dello sbalzo, la sonda a sbalzo dovrebbe tenersi ad un angolo di 90°, penetrando tutte le interfacce aria-acqua.
   1. Preparare una soluzione contenente 42 mg mL^-1 di EDC e 20 mg mL^-1 NHS in tampone standard di fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4).
      Attenzione: EDC è corrosivo e irritante della pelle e può causare gravi lesioni oculari. Indossare adeguati guanti, occhiali e camice da laboratorio.
   2. Coprire i vetrini Silano rivestito con la soluzione e mettere silanizzata a sbalzo sonde in una goccia della soluzione EDC/NHS e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
      Nota: Per l'incubazione delle sonde a sbalzo, la scatola originale a sbalzo è adatta. Per accoppiare proteine tramite loro gruppi amminici liberi ad il carboxyls (-COOH) degli agenti Silano-PEG eterobifunzionali, il gruppo - COOH è attivato con la chimica EDC/NHS ampiamente usata. EDC coppie NHS per l'acido carbossilico, formando un estere NHS "stabile" che permette di coniugazione efficiente di ammine primarie a pH fisiologico in un passaggio successivo.
   3. Sciacquare i vetrini a sbalzo e vetro accuratamente con PBS in tre bicchieri consecutivi al fine di lavare completamente eccessivo EDC/NHS.
      Nota: Questa fase di lavaggio è critica come rimanenti può crosslink proteine EDC/NHS e quindi alterare la loro funzionalità.
   4. Incubare i vetrini attivati con e il cantilever sonde in una goccia della soluzione della proteina desiderata in una camera umida a temperatura ambiente. Il tempo di concentrazione e l'incubazione di proteina dovrebbe essere adattato per soddisfare i requisiti dell'esperimento. In generale, una concentrazione tra 0,5 e 1 mg mL^-1 e incubazione volte da 30 min a 2 h sono adatti per la maggior parte delle proteine. Nel caso di fibronectina (su lastra di vetro) e punta pilus-1 proteina RrgA (su cantilever), una concentrazione molare di 1,5 µM e 3 µM, rispettivamente e un tempo di incubazione di 2 h sono sufficienti.
   5. Lavare i vetrini e cantilever sonde accuratamente con PBS in tre bicchieri consecutivi al fine di lavare via proteine non associati.
   6. Saturare l'estere NHS rimanente con tris (idrossimetil)-aminomethan posizionando le sonde in soluzione fisiologica tamponata (TBS; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6) per 20 min a temperatura ambiente.
      Nota: Questo passaggio riduce indesiderato accoppiamento covalente di proteine tra la superficie funzionalizzata della punta dell'AFM e il vetro, perché gruppi amminici di Tris possono associare ai rimanenti gruppi COOH attivati sulla superficie a sbalzo e substrato.
   7. Lavare i vetrini e cantilever sonde accuratamente con PBS e store li in piatti separati Petri coperto in PBS fino all'utilizzo.
      Nota: I campioni devono essere preparati fresca e utilizzato lo stesso giorno.

2. atomic Force Microscopy base singola molecola spettroscopia della forza

Nota: In questo lavoro, è stato utilizzato un microscopio a forza atomica di JPK Instruments e il set up per ottenere curve di forza-distanza è stata definita con il RampDesigner di forza.

1. Calibrazione a sbalzo con il metodo di rumore termico³⁵
   Nota: Per la calibrazione a sbalzo, seguire il passo nel manuale del produttore. La maggior parte a sbalzo stato fornitori una costante primavera approssimativa, che è di solito calcolata dalla forma nominale a sbalzo (lunghezza, larghezza, spessore) e pertanto non è molto affidabile. Come la costante elastica corretta è fondamentale, si consiglia di effettuare la calibrazione a sbalzo descritta di seguito in triplice copia e utilizzare i valori medi di sensibilità ottica leva e costante elastica. Può essere utile registrare la deflessione a sbalzo in volt (V) durante l'esperimento e convertire a forza (pN) in seguito, con la sensibilità ottica leva e molla costante valori medi. La sensibilità di leva costante ed ottiche di primavera può essere determinata prima e/o dopo l'esperimento, fino a quando non viene modificata la posizione di laser su cantilever (la posizione del laser riflessa può essere riadattata il fotodiodo).
   1. Difficoltà un vetrino pulito, fresco il supporto del campione AFM e coprirlo con il tampone PBS.
      Nota: La calibrazione deve essere effettuata su una superficie dura (ad esempio, vetro) e nello stesso buffer come esperimenti reali.
   2. Difficoltà la sonda a sbalzo preparati presso il titolare a sbalzo, posizionarlo nella testa del AFM e accuratamente bagnato il cantilever con una goccia di tampone PBS.
      Nota: La bagnatura del cantilever riduce la tensione superficiale che appaiono durante la penetrazione nel buffer di PBS sul vetrino di calibrazione e quindi indesiderabile di piegamento del cantilever.
   3. Spostare lentamente il cantilever verso la superficie di calibrazione fino a quando il cantilever è completamente immerso nel buffer di PBS, ma ancora lontano dalla superficie di calibrazione.
   4. Utilizzare il microscopio ottico di vista superiore del AFM o (se disponibile) il microscopio invertito sotto l'AFM per posizionare il laser di AFM sul retro del cantilever. Posto vicino alla fine del cantilever vicino dove si trova la punta del laser.
      Nota: Il punto del laser deve essere posizionato vicino all'estremità del cantilever, ma dovrebbe essere ancora completamente il cantilever. Se nessun microscopio ottico è disponibile, utilizzare un pezzo di carta per diodi laser visibili o una carta di rilevatore laser per diodi laser a infrarossi, metterlo sotto la testa AFM e spostare il punto di laser verso il bordo del cantilever-chip, dove si trovano i cantilever , fino a quando vedrete il posto sulla scheda di carta o rivelatore. Poi spostare il laser parallelo al bordo. Quando la macchia scomparirà, è su un braccio a sbalzo. Per cantilever lineare, spostare il punto verso la fine del braccio di leva finché viene visualizzata sulla scheda carta/rivelatore e sposta indietro fino a quando è di nuovo il braccio della leva (scompare dalla carta/card). Per triangolare, posizionare il punto a metà tra due braccia del cantilever e spostarla verso la fine del cantilever, fino a scomparire dalla carta/card. Verificare che siete nel bel mezzo dello sbraccio spostando il punto perpendicolare all'asse longitudinale del cantilever.
   5. Regolare la posizione del fotodiodo rilevatore quattro quadranti di AFM in modo tale che il raggio laser riflesso è posizionato al centro del fotodiodo.
      Nota: Procedere come segue: utilizzare le viti micrometriche vicino il diodo rivelatore per spostare il diodo in orizzontale che in senso verticale, fino a quando il segnale di somma da tutti e quattro i quadranti è ingrandito. Quindi spostare il diodo in direzione verticale, fino a quando il segnale di deflessione verticale è pari a zero e spostare il diodo in direzione orizzontale, fino a quando il segnale di flessione laterale è zero. Cantilever di nitruro di silicio solitamente hanno un rivestimento in oro e quindi sono un bimetallo con due diversi coefficienti di dilatazione termica. Ciò provoca una deriva termica (apparente del segnale di deflessione verticale) specialmente in soluzione. Per ridurre questa deriva durante le misurazioni, lasciate che l'intero sistema equilibrare per pochi minuti prima di iniziare la taratura.
   6. Aprire il gestore di calibratura del software AFM e calibrare la sensibilità a sbalzo e la costante elastica del cantilever con il metodo di rumore termico come segue.
   7. Attentamente la superficie del substrato si avvicinano e registrare una curva forza-distanza.
   8. Determinare la sensibilità della leva ottica in nm/V inserendo una linea retta alla parte più ripida della curva di forza di ritrazione, dove la punta è a contatto con la superficie del substrato. La sensibilità consente di convertire la costante della molla a sbalzo a pN/nm.
      Nota: La pendenza della curva di ritrazione è il piezo viaggia distanza vs. la variazione di tensione del fotodiodo (misurata in nm/V).
   9. Registrare diversi spettri di rumore termico del cantilever con il cantilever circa 100 µm o più lontano dalla superficie al fine di escludere qualsiasi superficie smorzamento.
   10. Determinare la costante elastica del cantilever in pN/V inserendo un oscillatore armonico fornito dal software AFM per gli spettri di rumore termico.
   11. Lentamente ritrarre il cantilever e ritirarlo dalla soluzione.
   12. Sostituto la superficie del vetro usato per la calibrazione a sbalzo con la superficie del campione contenente le proteine immobilizzate. Assicurarsi che la trave a mensola e la superficie del campione (e quindi le proteine) non a secco mentre si cambia i vetrini.
2. Interazione della forza esperimenti a livello di singola proteina
   1. Spostare lentamente l'umido a sbalzo verso la superficie del campione fino a quando il cantilever è completamente coperto da tampone PBS, ma ancora lontano la superficie del substrato.
      Nota: Per ridurre la deriva termica durante l'esperimento, lascia l'intero sistema impostare per pochi minuti prima di iniziare le misure di spettroscopia di forza.
   2. La superficie si avvicinano e registrare più curve di forza-distanza (≥ 500) alle posizioni differenti della superficie del campione, con una forza di contatto di pN 250, un tempo di contatto di 1 s, una lunghezza di ritrazione di 2 µm e una velocità di retrazione di 1 µm s^-1.
      Nota: Per registrazioni di spettroscopia di forza generale, seguire il manuale del produttore. Variazioni: La velocità di retrazione può essere variata tra 0,1 e 5 µm s^-1 per calcolare cinetica dei dati a seconda del carico di forza crescente. Il tempo di interazione possa essere variato per analizzare il tempo dipendente bond rafforzamento. Invece di mantenere costante la velocità di retrazione, uno può mantenere costante la forza (forza morsetto modalità).
3. Analisi dei dati
   Nota: L'analisi dei dati è stato effettuato utilizzando il software di elaborazione dati. A seconda delle proteine immobilizzate, il tempo di contatto o la velocità di retrazione, se un'impronta è stata costituita o non e altri parametri variabili, le curve di forza-distanza contengono più informazioni diverse. Interpretazione e analisi dei dati può variare notevolmente tra diversi esperimenti di SMF e pertanto non può essere descritto in dettaglio qui. Per quanto riguarda l'interazione di RrgA e Fn, il seguente protocollo può essere un primo passo per l'analisi dei dati di SMF.
   1. Aprire i file di curva di forza misurata selezionando l'icona Apri Batch di scansione forza ed elaborare le curve forza-distanza come segue:
   2. Convertire la deflessione a sbalzo (V) alla forza direttamente proporzionale (F) selezionando l'icona di (Re) calibra la V-deflessione di regolazione sensibilità e primavera costante .
      Nota: Se a sbalzo calibrazione è stata effettuata prima dell'esperimento, i valori vengono salvati in file di scansione di forza e vengono utilizzati automaticamente durante la calibrazione della V-deflessione. Se la calibrazione è stata effettuata dopo l'esperimento, il software utilizza i valori predefiniti, che possono essere cambiati ai valori misurati.
   3. Sottrarre la linea di base del canale retrazione in una regione della curva forza lontano dalla superficie per impostare il livello di forza zero selezionando l'icona Sottrazione della linea di base.
      Nota: In alcuni casi, la retrazione non può avere lo stesso valore di forza costante e la curva potrebbe essere visualizzato un tilt lineare, che può essere rimosso selezionando Offset + Tilt.
   4. Definire il punto dove la punta diventa a contatto con il campione selezionando l'icona di Determinazione di punto di contatto .
   5. Convertire il segnale di altezza di separazione del suggerimento-campione selezionando l'icona di Separazione del suggerimento-campione . Oltre a sottrarre la posizione del punto di contatto, questa procedura sottrae il cantilever flessione per calcolare la distanza tra la superficie del substrato e AFM-tip.
      Nota: Per il montaggio di modelli elastici di polimero, come l'estensibile modello a vite senza fine-come-catena e la determinazione delle lunghezze di interazione, la separazione del suggerimento-campione, che è stato corretto per la curvatura a sbalzo, è necessario. Per determinare la forza tasso di carico dalla pendenza della curva di forza e la velocità di z-piezo, le curve di forza non corretta devono essere utilizzate.
   6. Schermo le tracce di forza-distanza per picchi di forza che si verificano a lunghezze di rottura sopra 70 nm (lunghezza del distanziale PEG allungato)³⁶ per risolvere interazioni non specifiche e applicare il modello di vite senza fine-come-catena estensibile alle vette selezionate selezionando il Icona di un modello di catena di polimeri in forma e ha scelto l' estensibile modello catena Worm-like. I picchi della curva di forza di retrazione saranno dotati di questo modello e forze di rottura e lunghezze sono ottenute, insieme con i parametri elastici del polimero.
   7. Visualizzare i dati come istogrammi mostrando le distribuzioni di forza e lunghezza. Utilizzare almeno 100 eventi non vincolanti per gli istogrammi.

Risultati

Il protocollo descritto qui risultati in un'immobilizzazione covalente di proteine tramite loro accessibile ammine primarie con orientazione casuale (Figura 1). Figura 2 Mostra un'immagine AFM di una superficie di vetro silanizzata con (a sinistra) e senza (a destra) Fn immobilizzato, registrata dopo la disidratazione dei campioni sotto una leggera corrente di azoto. Lo strato di polimero Silano presenta solo piccole ondulazioni superficiali con un'altezza di circa 2-5 nm (Figura 2, destra), mentre sulla superficie funzionalizzata con Fn, circa 10 nm alta Fn molecole sono apparente (Figura 2, sinistra). In primi piani, la struttura dimerica della Fn possa essere riconosciuta. Le molecole di Fn sembrano essere compatto con un'altezza di 4-5 nm sopra il rivestimento di superficie di PEG e una lunghezza di ~ 120 nm (vedere inserti).

Per studiare le forze di interazione di RrgA con Fn, che recentemente è stato descritto dettagliatamente dal nostro gruppo¹³, RrgA è stato accoppiato ad una punta AFM del nitruro di silicio e Fn umano al substrato di vetro (Figura 3a). Figura 3 Mostra la punta rappresentanza curve di separazione dell'interazione di RrgA con Fn registrato ad una velocità di trazione di 1 µm s^-1. La chimica delle superfici usata ha condotto ad un'interazione di basso fondo ed eventi di interazione ben sagomato singola (o doppia) (Figura 3a), che sono stati montati utilizzando un worm extensible come modello di catena (eWLC) (curve rosse). Visualizzazione dei risultati della fit (forza di rottura e - lunghezza, Vedi Figura 4) dimostra che dopo aver superato interazioni aspecifiche tra punta AFM e substrato e si estende il linker di PEG (> 70 nm), fino a ~ 19% delle curve di forza ha mostrato la rottura eventi con una rottura media forza per la RrgA - interazione Fn di ~ 52 pN contemporaneamente a una distanza punta-campione di circa 100 nm. In contrasto, una chimica di superficie inapplicabile (qui, tempra omesso con Tris buffered saline Figura 3b) ostacolerà una chiara valutazione degli eventi singola interazione a causa di interazioni aspecifiche, la proteina più vincolanti (traccia 2 e 3) e/o accoppiamento covalente di proteine tra la superficie del campione e la punta AFM a sbalzo. Questo porta a forze di rottura alta (traccia 1) eventualmente accompagnate dal dispiegarsi dei domini della proteina (Fn) (traccia 4 e 5).

Figura 1: panoramica sopra la chimica delle superfici. L'idrolisi di etossi Silano-PEG-carbossilico è seguita dal processo di condensazione sulla superficie del vetro idratata e la formazione di legami incrociati silossano. La reazione di EDC con gruppi carbossilici si traduce in un reattivo o- acylisourea, un mediatore dell'ammina-reattivo con un tempo di dimezzamento estremamente breve in soluzione acquosa (idrolisi). L'intermedio è stabilizzato dalla formazione di un estere NHS che subisce sostituzione nucleofila per infine formano un legame dell'ammide con le ammine primarie sulle proteine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immobilizzazione del fibronectin su un vetro substrato tramite eterobifunzionali etossi Silano PEG agente accoppiante carbossilico. Immagini AFM di vetro funzionalizzato superfici con (a sinistra) e senza (a destra) FN. numeri indicare singole molecole di Fn, che sono distribuite in modo omogeneo sulla superficie del substrato (inserti). Le molecole adottano una struttura dimerica e compatta con un'altezza di 4-5 nm sopra il piolo di rivestimento e una lunghezza di > 100 nm. Questo assomiglia alla struttura del Fn in soluzione ed è coerenza con i dati su altre superfici, per esempio, mica precedenti-AFM (barra della scala di intarsi = 500 nm)³⁷. Di seguito l'AFM immagini sono profili di altezza lungo le linee indicate nelle immagini AFM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: illustrazione di un esperimento di SMF e rappresentante forzare le curve di distanza di RrgA - interazione Fn. (a) RrgA e Fn erano covalentemente via Silano etossi eterobifunzionali PEG agente accoppiante carbossilico di un AFM al nitruro di silicio a sbalzo punta e una superficie di vetro, rispettivamente. Rappresentante SMFS forza distanza curve ottenute per RrgA - interazione Fn a una velocità di retrazione di 1 µm s^-1 con l'immobilizzazione descritto di RrgA e Fn sono mostrate. Curve rosse rappresentano i PF di extensible vite senza fine-come catena applicati per ottenere forze di rottura e lunghezze. La figura è stata modificata da Becke, et al., ACSnano 2018¹³. (b) rappresentante SMFS forza curve distanza ottenute per il RrgA - interazione Fn senza tempra con tamponata Tris Salino. In questo caso, l'ammina primaria di Tris era assente così che rimangono attivi esteri NHS sono stati lasciati insaturi durante l'esperimento. Ciò ha condotto alla proteina multi vincolanti (traccia 2 e 3) e il bloccaggio delle proteine tra la superficie e la punta AFM che ha provocato la rottura alta forza accompagnato da (Fn-) dominio spiegamento (tracce 1, 4 e 5; notare le diverse scale). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: distribuzione di forza e lunghezza del singolo RrgA - interazioni Fn. Rottura forza e corrispondenti istogrammi di lunghezza di rottura ottenuti da RrgA - misurazioni di interazione a Fn SMF (n = 1400) ad una velocità di retrazione di 1 µm s^-1. Gli istogrammi rivelano un più probabile rottura forza f_MP di 51,6 pN (Gauss adatta, linea nera) e un accumulo di lunghezze di rottura circa 100 nm. La figura è stata modificata da Becke, et al., ACSnano, 2018¹³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Poiché l'introduzione del AFM basato SMF, si è evoluto in una tecnica ampiamente utilizzata per sondare direttamente intra e forze intermolecolari di singole proteine, acidi nucleici e altre biomolecole^3,4,5. Per esperimenti riusciti di SMF, una superficie appropriata strategia di accoppiamento è un prerequisito. Per sondare le forze intramolecolari in polimeri naturali e sintetici, i polimeri possono essere accoppiati direttamente alla superficie del substrato e AFM punta^{36,38,39,40,41}. Per l'indagine sulle interazioni inter-molecolari, quali legami molecolari, tuttavia, si consiglia di utilizzare molecole linker flessibile come etero-bifunzionale PEG linker, o catene polipeptidiche, per collegare i partner di interazione alla punta dell'AFM e la superficie del substrato, al fine di consentire il corretto orientamento dei partner di legame, per superare le forze di superficie a corto raggio e per evitare la denaturazione e svolgersi delle proteine^{21,22,23, 24,25,26,27,42}. Abbiamo pertanto descritto un protocollo semplice e dritto in avanti per l'immobilizzazione covalente di proteine tramite loro ammine primarie accessibile tramite etero-bifunzionale PEG distanziali.

Abbiamo dimostrato la sua applicabilità con l'indagine dell'interazione delle forze tra adesina RrgA da S. pneumoniae e la proteina della matrice extracellulare Fn, come recentemente descritto dettagliatamente altrove¹³.

La chimica di superficie è ben consolidata e approcci analizzati e simili sono stati utilizzati con successo in molteplici funzioni SMF esperimenti^{19,42,43,44,45}. Il silylether utilizzato per accoppiare il polimero silano sulla superficie, è soggetto a idrolisi. Il grado di idrolisi dipende dalla quantità di legami silossanici formata, che può essere controllato durante il processo di silanizzazione. Se forze di interazione elevate (≥ 1000 pN) sono attesi durante le misurazioni di SMF, la silanizzazione dovrebbe essere eseguita tramite deposizione di vapore-fase³⁰ che provoca la formazione di uno strato continuo di silossani. Per quanto riguarda molti esperimenti (ad esempio, molte proteine – interazioni della proteina), le forze di interazione sono nel range di pochi centinaia pN e la procedura descritta, in quale silossano formazione è effettuato dalla deposizione da una fase acquosa e non associati organo-silani minuziosamente vengono lavati via con etanolo (punto 1.1.7) seguita da trattamento con calore (passaggio 1.1.8), è sufficienti.

Un altro passo fondamentale è quello di lavare il restante EDC e molecole di NHS fuori la superficie (punto 1.2.3), come gli avanzi porterà all'attivazione di gruppi carbossilici sulle proteine. Questo può sia risultato in reticolazione delle proteine sulla superficie stessa, che può alterare la loro funzionalità o covalenza coppia attivato proteine ad altre proteine sulla superficie opposta. Questo può portare a delle proteine tra la superficie e la punta AFM, che si traduce in alta rottura forze eventualmente accompagnate dal dominio dispiegarsi di bloccaggio (Vedi Figura 3b, traccia 1, 4 e 5, dispiegarsi di domini Fn)⁴⁶. Lo stesso problema può verificarsi, se gli esteri NHS attivi del distanziatore PEG sono lasciati insaturi. Pertanto, l'incubazione con soluzione salina tamponata Tris si consiglia (punto 1.2.6), come l'ammina primaria di Tris disseta i restanti gruppi amminici reattivi.

Seguendo il protocollo graduale conduce ad una distribuzione omogenea di Fn sul vetro silanizzata superficie (vedere Figura 2), lasciando una forma dimerica della proteina. Questo assomiglia Fn´s struttura in soluzione ed è coerenza con i dati su altre superfici di campione³⁷precedenti-AFM. Inoltre, si ottiene una concentrazione appropriata della RrgA sulla punta AFM, che genera un valore di destinazione del ~ 20% di eventi di interazione ben definiti durante le misurazioni di SMF (Figura 3 e Figura 4). Un altro modo elegante per controllare la quantità di molecole accoppiato all'estremità del substrato e a sbalzo di campione oltre variando i tempi di concentrazione e/o incubazione di proteina, è la combinazione di silano-agenti con diversi gruppi funzionali secondarie. Modificando il rapporto di gruppi reattivi della proteina, che si estende da PEG-polimero, il numero delle proteine immobilizzate può essere controllata^15,16,17,18.

Il protocollo descritto qui è utilizzabile anche per immobilizzare altre molecole contenenti di -NH₂ o essere regolato alle proteine di coppia a altra superficie di ossido di silicio oltre nitruro di silicio e vetro. A seconda della struttura della proteina, il gruppo carbossilico reattiva di ammina sono modificabili per un gruppo reattivo solfidrilico (ad es., maleimide o ortho-piridil disolfuro) per accoppiare la proteina tramite il suo libero – gruppi SH. Per Fn, questo comporta un orientamento predefinito^13,17,20.

In sintesi, questo protocollo può essere registrato per soddisfare diversi requisiti ed è adatto per altre applicazioni biofisiche oltre gli esperimenti di spettroscopia di forza singola molecola.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiale
2-propanolo	Carl Roth	6752
1-(3-dimetilamminopropil)-3-etilcarbodiimmide	Sigma-Aldrich	03450	EDC
Acido acetico	Carl Roth	3738	100 %; purezza analitica
Acqua
Etanolo	Carl Roth	9065	≥ 99,8 %; purezza analitica
Etossi silano polietilenglicole acido	Nanocs	PG2-CASL-5k	5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3
Acido cloridrico	Carl Roth	X896	32 %
N-Idrossisuccinimide	Merck	804518	NHS; per sintesi
Soluzione salina tamponata con fosfato - Dulbecco	Biochrom	L1825	PBS
Sonda molecolare es. Fibronectina, plasma umano	Sigma-Aldrich	F1056
Molecola sonda es. RrgA			Prodotto in laboratorio
cloruro di sodio	Carl Roth	9265	NaCl
Tris(idrossimetil)-amminometano	Carl Roth	AE15	≥ 99,3 %; TRIS; Grado tampone
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipment
Becherers
Tagliavetro
Vetrini	Carl Roth	0656
Essiccatore a gas inerte	Sicco
- Zeiss Axiovert 200	Zeiss
JPK NanoWizard 1	JPK Instruments
Software JPK NanoWizard SPM e DP	JPK Instruments
Forno da laboratorio	Legante
Agitatore magnetico	IKA
Micro spatola
Provette
Microsoft Excel	Microsoft
Parafilm M Marca		701606
piastre
pHmetro	Knick
Pipette	Starlab		10-100 & micro; l, 50-200 µ l, 100-1000  µ l
Bilancia di precisione	Acculab
Cantilever in nitruro di silicio - MLCT	Bruker AXS S.A.S Costante di		molla ≤ 100 pN/nm
Bagno di sonicazione	Barattolo
Stereomicroscopio - Zeiss Stemi	Zeiss
Barra
Kimtech scienza salviette di precisione	Kimberly-Clark
Twezzers
UV PenRay	UVP, LLC	90-0012-01	Spettro di mercurio con l'energia primaria a 254  nm
Essiccatore
Pompa
Miscelatore a vortice	VWR
Carta di pesatura	Carl Roth	TP64