Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

Sommario

Per verificare gli effetti inibitori di agenti farmacologici sulla fosfolipasi C (PLC) in diverse regioni del cervello dell'ape mellifica, presentiamo un'analisi biochimica per misurare l'attività del PLC in quelle regioni. Questo test potrebbe essere utile per confrontare attività PLC tra tessuti, così come tra le API che esibiscono comportamenti diversi.

Abstract

L'ape è un organismo modello per la valutazione di comportamenti complessi e funzioni cerebrali superiori, come apprendimento, memoria e divisione del lavoro. Il corpo del fungo (MB) è un centro superiore di cervello proposto per essere il substrato neurale dei comportamenti complessi dell'ape mellifica. Sebbene studi precedenti identificati geni e proteine differenzialmente espressi in MBs e altre regioni del cervello, l'attività delle proteine in ogni regione non sono ancora pienamente compreso. Per rivelare le funzioni di queste proteine nel cervello, analisi farmacologica sono un approccio fattibile, ma è prima necessario confermare che le manipolazioni farmacologiche infatti alterano l'attività della proteina in queste regioni del cervello.

Abbiamo precedentemente identificato un' più alta espressione di geni che codificano la fosfolipasi C (PLC) in MBs che in altre regioni del cervello e farmacologicamente valutato il coinvolgimento di PLC nel comportamento dell'ape mellifica. In quello studio, abbiamo biochimicamente testato due agenti farmacologici e confermato che hanno attività in diminuzione PLC in MBs e altre regioni del cervello. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di come rilevare attività PLC in omogeneato del cervello dell'ape mellifica. In questo sistema di dosaggio, omogeneati derivati dalle regioni differenti del cervello sono ha reagiti con un substrato fluorogenico sintetico e fluorescenza risultanti da attività PLC è quantificato e rispetto tra regioni del cervello. Inoltre descriviamo la nostra valutazione degli effetti inibitori di determinate droghe sulle attività del PLC utilizzando lo stesso sistema. Anche se questo sistema è probabilmente influenzata da altri composti endogeni fluorescenza e/o l'assorbanza dei tessuti e dei componenti di analisi, la misurazione dell'attività PLC utilizzando questo sistema è più sicuro e più facile che quello usando l'analisi tradizionale, che richiede substrati radioattivi. La procedura semplice e manipolazioni consentono di esaminare l'attività PLC nel cervello ed in altri tessuti delle API da miele coinvolti in diverse attività sociali.

Introduzione

L'ape europea (Apis mellifera L.) è un insetto eusociali e API femminile mostrano una riproduzione casta-dipendente ed età-dipendente divisione del lavoro. Ad esempio, nella casta sterile delle API che si riferisce come "lavoratori", i più giovani individui feed nidiate mentre quelli più vecchi foraggio nettare e polline fuori l' alveare¹. Apprendimento e memoria capacità è criticamente importante nella vita dell'ape, perché api bottinatrici devono ripetutamente ad andare avanti e indietro tra fonti alimentari e loro nido e quindi comunicare le posizioni delle origini di buon cibo ai loro membri ancora in vita attraverso la danza comun....

Protocollo

1. acquisizione delle api bottinatrici

1. Acquisto di colonie di API da un distributore locale.
2. Utilizzando una rete dell'insetto, prendere le API forager che tornano all'alveare con i sacchetti di polline sulle zampe posteriori. Trasferire le API a un tubo conico in plastica da 50 mL standard e richiudere la provetta (Figura 1). Inserire il tubo sul ghiaccio per anestetizzare le API.
   Nota: Indossare le giacche designate per l'apicoltura evitare punture di API. Professione d'infermiera API possono anche essere raccolte a seconda dell'esperimento. Cattura le API di infermiera, osservare il comportamento dell'ape sul pet....

Risultati

Concentrazioni di proteina in omogeneati del cervello:
Abbiamo preparato gli omogeneati usando le API foraggiere. Le concentrazioni di proteina calcolati in omogenati di originale sono mostrate in Figura 3. Le concentrazioni di proteina approssimativo nell'omogeneato originale erano come segue: 1,5 mg/mL in MBs e 2,3 mg/mL in altre regioni del cervello. Abbiamo usato due API per lotto e sei lotti sono stati analizzati.

Discussione

L'esame biochimico della attività della proteina è profondamente importante per comprendere la segnalazione molecolare nel cervello, perché l'attività di un enzima è influenzata da varie molecole, quali substrati e inibitori e può, quindi, cambiare lungo con comportamento animale (ad es., apprendimento e memoria)⁵. Negli studi dell'ape mellifica, enzimi come la chinasi AMP ciclico-dipendente della proteina A, protein-chinasi GMP ciclico-dipendente, PKC, CaMKII fosforilato e adenilato cicl.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA	ThermoFisher Scientific	23227	Il kit di reagenti per la misurazione della concentrazione proteica
Pierce Bovine Serum Albumina Standard Ampolle 2mg/mL	ThermoFisher Scientific	23209	I campioni standard utilizzati nel test BCA
Cera di paraffina	GC	13B1X00155000141	Cera dentale utilizzata come stadio di dissezione
Spillo per insetti	Shiga	N. 0	Testa solida e inossidabile
PLCglow	KXT Bio	KCH-0001	Un substrato fluorogenico di micropiastra PLC
a 384 pozzetti	Corning	4511	Piastra a basso volume a fondo tondo in colore nero
Lettore di micropiastre Gemini EM	Molecular Devices
	Inibitore
Neomicina solfato	Santa Cruz Biotechnology	sc-3573	inibitore pan-PLC

pan-PLC Edelfosina Santa Cruz Biotechnology sc-201021