Articolo metodologico

Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

DOI:

10.3791/58173

⸱

14 settembre 2018

 ,  , 
1Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per verificare gli effetti inibitori di agenti farmacologici sulla fosfolipasi C (PLC) in diverse regioni del cervello dell'ape mellifica, presentiamo un'analisi biochimica per misurare l'attività del PLC in quelle regioni. Questo test potrebbe essere utile per confrontare attività PLC tra tessuti, così come tra le API che esibiscono comportamenti diversi.

Abstract

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L'ape è un organismo modello per la valutazione di comportamenti complessi e funzioni cerebrali superiori, come apprendimento, memoria e divisione del lavoro. Il corpo del fungo (MB) è un centro superiore di cervello proposto per essere il substrato neurale dei comportamenti complessi dell'ape mellifica. Sebbene studi precedenti identificati geni e proteine differenzialmente espressi in MBs e altre regioni del cervello, l'attività delle proteine in ogni regione non sono ancora pienamente compreso. Per rivelare le funzioni di queste proteine nel cervello, analisi farmacologica sono un approccio fattibile, ma è prima necessario confermare che le manipolazioni farmacologiche infatti alterano l'attività della proteina in queste regioni del cervello.

Abbiamo precedentemente identificato un' più alta espressione di geni che codificano la fosfolipasi C (PLC) in MBs che in altre regioni del cervello e farmacologicamente valutato il coinvolgimento di PLC nel comportamento dell'ape mellifica. In quello studio, abbiamo biochimicamente testato due agenti farmacologici e confermato che hanno attività in diminuzione PLC in MBs e altre regioni del cervello. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di come rilevare attività PLC in omogeneato del cervello dell'ape mellifica. In questo sistema di dosaggio, omogeneati derivati dalle regioni differenti del cervello sono ha reagiti con un substrato fluorogenico sintetico e fluorescenza risultanti da attività PLC è quantificato e rispetto tra regioni del cervello. Inoltre descriviamo la nostra valutazione degli effetti inibitori di determinate droghe sulle attività del PLC utilizzando lo stesso sistema. Anche se questo sistema è probabilmente influenzata da altri composti endogeni fluorescenza e/o l'assorbanza dei tessuti e dei componenti di analisi, la misurazione dell'attività PLC utilizzando questo sistema è più sicuro e più facile che quello usando l'analisi tradizionale, che richiede substrati radioattivi. La procedura semplice e manipolazioni consentono di esaminare l'attività PLC nel cervello ed in altri tessuti delle API da miele coinvolti in diverse attività sociali.

Introduzione

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L'ape europea (Apis mellifera L.) è un insetto eusociali e API femminile mostrano una riproduzione casta-dipendente ed età-dipendente divisione del lavoro. Ad esempio, nella casta sterile delle API che si riferisce come "lavoratori", i più giovani individui feed nidiate mentre quelli più vecchi foraggio nettare e polline fuori l' alveare1. Apprendimento e memoria capacità è criticamente importante nella vita dell'ape, perché api bottinatrici devono ripetutamente ad andare avanti e indietro tra fonti alimentari e loro nido e quindi comunicare le posizioni delle origini di buon cibo ai loro membri ancora in vita attraverso la danza comunicazione1. Gli studi precedenti hanno dimostrato che il MB, un centro superiore di cervello negli insetti, è coinvolto nella capacità di apprendimento e la memoria del honeybee2,3,4. Proteine e geni differenzialmente espressi sono stati identificati in varie regioni del cervello del honeybee5,6,7,8,9,10 ,11, suggerendo che sono collegate alle funzioni uniche di ogni regione del cervello. Sebbene l'inibizione farmacologica o l'attivazione di una proteina di interesse è un approccio ben utilizzato per rivelare la funzione della proteina dell'ape mellifica comportamento12,13,14, non si sa se tutti farmaci hanno effetti funzionali in diverse regioni del cervello dell'ape mellifica. La convalida delle funzioni di tali farmaci rafforzerà conclusioni negli studi di farmacologia comportamentale.

Qui, ci concentriamo su PLC, uno degli enzimi implicati in mouse cognizione15,16,17,18. PLC attiva segnalazione degradando fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) in inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG)19,20,21calcio. IP3 apre recettori di3 IP il reticolo endoplasmatico (ER), che conduce al rilascio di ioni calcio dall'ER. Il calcio rilasciato attiva sia calcio/calmodulina-dipendente della proteina chinasi II (CaMKII) con calmodulina e protein chinasi C (PKC) in presenza di DAG. Entrambi chinasi di proteina sono coinvolti nell'apprendimento e nella memoria22,23, coerente con il coinvolgimento di PLC in questo processo. PLC sono suddivisi in sottotipi, tra cui PLCβ, PLCγ e PLCε, basato sulle loro strutture20. Ogni sottotipo PLC viene attivato in un contesto diverso20e geni che codificano per tali sottotipi sono differenzialmente espressi in tessuti differenti. Precedentemente abbiamo dimostrato che honeybee MBs esprimono geni che codificano per sottotipi PLCβ e PLCε a livelli più alti del restante cervello regioni24, e che due inibitori di pan-PLC (edelfosine e neomicina solfato [neomicina]) diminuiscono PLC attività in differenti regioni del cervello e, infatti, influenzare la capacità di apprendimento e la memoria del honeybee24.

Tradizionalmente, l'attività enzimatica di PLC è stato misurato usando radiomarcato PIP225, che richiede strutture, attrezzature e formazione adeguata. Recentemente, un substrato fluorogenico sintetico di PLC è stato stabilito26, rendendo facile valutare l'attività PLC in laboratorio standard. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare l'attività PLC nelle regioni differenti del cervello dell'ape usando il substrato fluorogenic e successivamente testare gli effetti inibitori di edelfosine e neomicina su PLC in questi tessuti. Poiché il protocollo richiede solo manipolazioni di base, può essere applicabile agli studi di PLC attività in altri tessuti o aree del cervello nelle API assegnate ai diversi compiti sociali.

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Protocollo

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1. acquisizione delle api bottinatrici

  1. Acquisto di colonie di API da un distributore locale.
  2. Utilizzando una rete dell'insetto, prendere le API forager che tornano all'alveare con i sacchetti di polline sulle zampe posteriori. Trasferire le API a un tubo conico in plastica da 50 mL standard e richiudere la provetta (Figura 1). Inserire il tubo sul ghiaccio per anestetizzare le API.
    Nota: Indossare le giacche designate per l'apicoltura evitare punture di API. Professione d'infermiera API possono anche essere raccolte a seconda dell'esperimento. Cattura le API di infermiera, osservare il comportamento dell'ape sul pettine di cera e rilevare API infermiera, che attizzare le loro teste in cellette per nutrire le larve, dall'ala o torace con una pinzetta. Quindi, posizionare le API in un tubo di plastica da 50 mL, richiudere la provetta e mettilo nel ghiaccio, come indicato al punto 1.2.
  3. Cattura 12 raccoglitrici in modo casuale.
    Nota: Questo protocollo utilizza due API per lotto, risultante in sei lotti. Le API multiple possono essere catturate in una provetta, e il numero delle API in un singolo tubo non è importante, come le API in ogni lotto vengono combinate più tardi (Vedi punto 3.1.1). Mantenere il fresco di tubo in estate, come l'alta temperatura nel tubo ferisce le API.

2. dissezione del cervello dell'ape mellifica

  1. In laboratorio, posizionare il tubo da 50 mL in ghiaccio per almeno 30 min6 ad anestetizzare le API.
  2. Per preparare la fase di dissezione, piegare un pezzo di Cera dentaria a metà (la dimensione risultante è circa 3.5 x 7,5 cm) e spingerlo in un piatto di plastica (60 x 15 mm).
    Nota: La cera piegata tiene saldamente gli spilli entomologici.
  3. Sotto un microscopio binoculare, separare la testa dell'ape dal suo corpo con le pinzette e fissarlo sulla cera dentale inserendo spilli entomologici alla base di ogni antenna per tenere l'anteriore della testa in una posizione verso l'alto (Figura 2A).
    Nota: Lavare le pinzette prima dell'uso, utilizzando etanolo o acqua sterilizzata.
  4. Versare abbastanza soluzione salina (0,13 mol/L NaCl, KCl di 5 mmol/L e 1 mmol/L CaCl2-2 H2O) sulla testa per coprirlo. Bucare la testa ancora una volta con i perni se la testa galleggia nella soluzione. Utilizzare una soluzione salina ghiacciata, se necessario.
    Nota: Tuttavia, questo protocollo funziona senza la soluzione salina fredda.
  5. Rimuovere le antenne con pinzette (Figura 2B).
  6. Fare un taglio orizzontale vicino le basi delle antenne e longitudinalmente al bordo degli occhi compound, usando un bisturi. Quindi, fare un taglio orizzontale nella parte superiore della testa. Rimuovere la cuticola per aprire una finestra sopra il cervello (Figura 2C).
    Nota: Se necessario, lavare il bisturi con etanolo o acqua sterile prima dell'uso.
  7. Rimuovere le retine dagli ocelli e le trachee sulla superficie anteriore del cervello, usando la pinzetta (Figura 2D).
  8. Espandere il taglio al bordo degli occhi compound dorsalmente e ventralmente, utilizzando il bisturi (Figura 2E). Successivamente, rimuovere il tessuto connettivo tra la cuticola degli occhi compound e retine inserendo le pinzette direttamente sotto la cuticola dell'occhio (Figura 2F).
  9. Scartare la cuticola degli occhi compound. Scegli le punte dorsale delle retine degli occhi compound con pinzette e spostare le pinzette in direzione ventrale per rimuovere con cautela le retine (Figura 2G).
  10. Rimuovere con cautela le trachee rimanenti sulla superficie anteriore del cervello, usando la pinzetta (Figura 2H).
  11. Tagliare il tessuto connettivo tra il cervello e intorno ai tessuti, con una pinzetta e sezionare il cervello dalla testa capsula (Figura 2H).
  12. Staccare le trachee sulla superficie posteriore del cervello, con le pinzette (Figura 2ho).
  13. Con un bisturi, tagliare la connessione tra la MBs e altre regioni del cervello accanto i lobi verticali, che sono una parte di MBs (Figura 2J).
  14. Posto la MBs dissecato e restanti tessuti cerebrali in provette da 1,5 mL e rapidamente congelarli con ghiaccio secco o azoto liquido (Figura 2K). Conservare i tessuti congelati a-80 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Maneggiare azoto liquido con i guanti designati e la ventilazione per evitare il soffocamento e ustione fredda. Ghiaccio secco anche dovrebbe essere maneggiato con cura con i guanti. Il protocollo può essere messo in pausa qui. La dissezione e la conservazione del cervello tessuti dovrebbero essere eseguita uno ape alla volta per evitare la degradazione della proteina.

3. preparazione degli omogeneati del cervello

  1. Aggiungere 10 µ l di buffer di omogeneizzazione che comprende 50 mmol/l HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl e 1,0 mmol/L CaCl2 a frozen del tessuto del cervello e omogeneizzare il tessuto nel tubo da 1,5 mL applicando manualmente la pressione con un pestello di plastica. Corsa il tessuto almeno 200 x.
    Nota: Eseguire le modifiche descritte nella sezione 3 sul ghiaccio. Utilizzare un pestello in raccordo nel tubo sufficientemente distruggere i tessuti, che facilmente galleggiare nel buffer di omogeneizzazione.
    1. Trasferire la soluzione di tessuto omogeneizzato al tessuto successivo nel lotto ed omogeneizzare il tessuto allo stesso modo.
      Nota: L'API in ogni lotto vengono combinate in questa fase. Questo protocollo utilizza sei lotti.
  2. Aggiungere 30 µ l di buffer di omogeneizzazione.
  3. Centrifugare il campione di tessuto omogeneizzato per 10 min a circa 900 x g27 e 4 ° C.
  4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1,5 mL e centrifugare esso nuovamente per 20 min a circa 9.500 x g27 e 4 ° C.
  5. Posto il surnatante in una nuova provetta 1,5 mL. Memorizzare l'omogeneizzato a-20 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
  6. Determinare la concentrazione di proteina usando l'analisi (BCA) acido bicinconinico.
    1. Diluire 2,5 µ l di omogenato con 17,5 µ l di acqua sterilizzata (così diluire l'omogeneizzato ottuplo) e utilizzare tutti i l'omogenato diluito.
      Nota: Campionamento omogeneato utilizzando una micropipetta deve essere eseguita con cura a causa della sua elevata viscosità.
    2. Eseguire l'analisi BCA utilizzando 0, 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 e 2,0 mg/mL di albumina di siero bovino (BSA) in 20 µ l come standard.
      Nota: Modifica la scala del dosaggio BCA come necessario, basato sul volume dell'omogeneato e campioni standard. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. PLC reazione in omogeneati del cervello

  1. Preparare la soluzione di riserva della fluorogenic substrato WH-1526 disciolto in acqua sterilizzata a 50 µmol/L e conservare a-80 ° C.
    Nota: Coprire le soluzioni contenenti il substrato con stagnola per evitare la sbiadisc.
  2. Preparare la premiscela di reazione nel volume richiesto per raggiungere la seguente composizione in 10 µ l di miscela di reazione: 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl, 1,0 mmol/L CaCl2, 2,0 mmol/L dithiothreitol, 50 mg/L BSA e 12,5 µmol/L WH-15.
  3. Diluire l'omogeneizzato con buffer di omogeneizzazione, se necessario.
  4. Mescolare la premiscela di reazione e l'omogenato contenente 1,3 µ g di proteine in un tubo di reazione a catena (PCR) polimerasi per ottenere un volume finale di 10 µ l di miscela di reazione.
    1. Preparare due tipi di miscele di controllo per l'analisi statistica: mettere l'omogenato ma non WH-15 nella miscela (controllo miscela 1) e viceversa (controllo miscela 2).
      Nota: Preparare le miscele di reazione e miscele di controllo sul ghiaccio per impedire la degradazione della proteina e la reazione del PLC. Miscele di controllo 1 e 2 sono utilizzate per rilevare la fluorescenza dall'omogenato e substrato libero, rispettivamente.
  5. Lavare il tubo e viene quindi incubato in un termociclatore per 30 min a 25 ° C.
  6. Fermare la reazione aggiungendo 2 µ l di bis di glicole etilenico 25 mmol/L (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico.
    Nota: Proteina adeguata quantità e tempi di reazione variano tra esperimenti. Così, per ottimizzare le condizioni di reazione, potrebbe essere necessario ripetere le procedure descritte nei passaggi 4.1-5.3 negli esperimenti preliminari modificando l'importo e l'incubazione ora proteina fino a quando la fluorescenza aumenta linearmente. Per riferimento, quando viene utilizzato l'omogenato derivato da altre regioni del cervello, la reazione di solito funziona linearmente con 1,3 µ g o meno delle proteine all'interno di 30 min, ma la linearità diminuisce almeno 2,7 µ g di proteine o con un tempo di incubazione di 90 min o nger.

5. rilevazione della fluorescenza risultanti da attività PLC

  1. Centrifugare la miscela di reazione e le miscele di controllo per 5 min a circa 310 x g28 e trasferire 10 µ l del surnatante a diversi pozzetti su una micropiastra 384 pozzetti applicabile per la rilevazione della fluorescenza.
    Nota: Per evitare di dissolvenza e una contaminazione con polvere, coprire la piastra con un foglio.
  2. Lavare la micropiastra utilizzando una centrifuga per la micropiastra.
  3. Mettere la piastra in un lettore di micropiastre e rilevare la fluorescenza con un triplice copia tecnica.
    Nota: Le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione sono 344 nm e 530 nm, rispettivamente. Se applicabile (a seconda del lettore di micropiastre), mescolare le miscele campione per 5 s prima di ogni rilevazione. Il protocollo può essere fermato qui.

6. test dell'azione inibitoria di agenti farmacologici

  1. Preparare soluzioni di riserva di edelfosine e neomicina alle concentrazioni appropriate e conservarli fino all'utilizzo: edelfosine a 5,0 mmol/L e -20 ° C; neomicina 550 mmol/L e 4 ° C.
  2. Quando si prepara la premiscela di reazione come descritto al punto 4.2., aggiungere gli inibitori di premiscela per ottenere le concentrazioni finali di appropriato: edelfosine, 1,0 mmol/L; neomicina, 0.55 mmol/L.
  3. Aggiungere l'omogeneizzato per le miscele di reazione premiscela e appropriato controllo come descritto al punto 4.4.
    1. Preparare tre tipi di miscele di controllo: mettere l'omogeneizzato e inibitore, ma non il substrato in miscela di controllo 1; aggiungere il substrato ed inibitore ma non omogeneizzato controllo composto 2; e mettere l'inibitore, ma non l'omogenato o substrato in miscela di controllo 3.
  4. Eseguire la reazione di PLC e la rilevazione della fluorescenza come descritto nei passaggi 4.5-5.3.

7. elaborazione statistica

  1. Per la rilevazione di attività PLC utilizzando le miscele descritte nella sezione 4, calcolare la fluorescenza derivata dalla reazione fra PLC e il substrato sottraendo la fluorescenza emessa dall'omogeneato o substrato gratuito come segue.

    FL (attività PLC) = Fl (mix di reazione) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}
    ​
    Nota: Fl (attività PLC), Fl (mix di reazione), Fl (ctrl 1) e Fl (ctrl 2) denotano bona fide fluorescenza derivato dall'attività PLC, fluorescenza rilevata nella miscela di reazione e miscele di controllo 1 e 2, rispettivamente.
    1. Dopo la misurazione della fluorescenza nelle miscele come descritto ai punti 4.1-5.3, è possibile calcolare Fl (attività PLC) secondo l'equazione al punto 7.1 e poi la media Fl (attività PLC) della tecnica triplice copia per ogni omogeneato.
    2. Utilizzando la media Fl (attività PLC) della tecnica triplice copia ottenuta al passaggio 7.1.1, calcolare nuovamente la media Fl (attività PLC) di replicati biologici di MBs e altre regioni del cervello e confrontare i valori tra i tessuti del cervello.
  2. Per l'esame delle attività PLC in presenza di inibitori utilizzando le miscele descritte nella sezione 6, calcolare la fluorescenza derivata dalla reazione fra l'omogenato, substrato ed inibitore come segue.

    FL (attività PLC con inibitore) = Fl (mix di reazione) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)

    Nota: Qui, Fl (attività PLC con inibitore) è bona fide fluorescenza risultanti da attività PLC in presenza dell'inibitore. FL (mix di reazione), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) e Fl (ctrl 3) sono segnali di fluorescenza rilevati nella miscela di reazione, controllo miscela 1, controllano miscela 2 e controllo miscela 3, rispettivamente.
    1. Dopo la misurazione della fluorescenza nelle miscele come descritto ai punti 6.1-6.4, calcolare Fl (attività PLC con inibitore) secondo l'equazione al punto 7.2. Quindi, ottenere la media Fl (attività PLC con inibitore) della tecnica triplice copia per ogni omogeneato.
    2. Utilizzando il valore medio calcolato al punto 7.2.1, calcolare la media Fl (attività PLC con inibitore) delle ripetizioni biologici derivato da ogni tessuto cerebrale. Confrontare il Fl (attività PLC con inibitore) e Fl (attività PLC) ottenuto nel passaggio 7.1.2 in ogni tessuto cerebrale.

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Risultati

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Concentrazioni di proteina in omogeneati del cervello:
Abbiamo preparato gli omogeneati usando le API foraggiere. Le concentrazioni di proteina calcolati in omogenati di originale sono mostrate in Figura 3. Le concentrazioni di proteina approssimativo nell'omogeneato originale erano come segue: 1,5 mg/mL in MBs e 2,3 mg/mL in altre regioni del cervello. Abbiamo usato due API per lotto e sei lotti sono stati analizzati.

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'esame biochimico della attività della proteina è profondamente importante per comprendere la segnalazione molecolare nel cervello, perché l'attività di un enzima è influenzata da varie molecole, quali substrati e inibitori e può, quindi, cambiare lungo con comportamento animale (ad es., apprendimento e memoria)5. Negli studi dell'ape mellifica, enzimi come la chinasi AMP ciclico-dipendente della proteina A, protein-chinasi GMP ciclico-dipendente, PKC, CaMKII fosforilato e adenilato cicl...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figura 4B - 4D è stata modificata da Suenami et al. 24 con il permesso della biologia Open. Gli autori sono grati all'editore per l'autorizzazione. Questo lavoro è stato supportato da Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) a Shota Suenami e Ryo Miyazaki.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCAThermoFisher Scientific23227Il kit di reagenti per la misurazione della concentrazione proteica
Pierce Bovine Serum Albumina Standard Ampolle 2mg/mLThermoFisher Scientific23209I campioni standard utilizzati nel test BCA
Cera di paraffinaGC13B1X00155000141Cera dentale utilizzata come stadio di dissezione
Spillo per insettiShigaN. 0Testa solida e inossidabile
PLCglowKXT BioKCH-0001Un substrato fluorogenico di micropiastra PLC
a 384 pozzettiCorning4511Piastra a basso volume a fondo tondo in colore nero
Lettore di micropiastre Gemini EMMolecular Devices
Inibitore
Neomicina solfatoSanta Cruz Biotechnologysc-3573inibitore pan-PLC
pan-PLC Edelfosina Santa Cruz Biotechnology sc-201021

Riferimenti

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