Qui, descriviamo un metodo semplice per indurre le ulcere di pressione di pelle clinicamente rilevanti (PUs) in un modello murino di ferita del midollo spinale (SCI). Questo modello può essere utilizzato in studi pre-clinici a schermo per diverse terapie per guarigione PUs nei pazienti di SCI.
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Articolo metodologico
Modello murino di ulcere da pressione dopo la ferita del midollo spinale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ulcere da pressione (PUs) sono comuni debilitanti complicazioni della ferita traumatica del midollo spinale (SCI) e tendono a verificarsi nei tessuti molli intorno prominenze ossee. C'è, tuttavia, poco conosciuto circa l'impatto della SCI sulla guarigione di ferite della pelle nel contesto dei modelli animali in impostazioni sperimentali controllate. In questo studio, un modello di mouse semplice, non invasivo, riproducibile e clinicamente rilevanti di PUs nel contesto della completa SCI è presentato. Topi del maschio adulto (Balb/c, vecchio 10 settimane) erano rasati e depilati. Post-depilazione (24h), topi sono stati sottoposti a laminectomia seguita da transection completo del midollo spinale (vertebre T9-T10). Subito dopo, una piega di pelle sul retro dei topi è stata sollevata e intramezzata fra due dischi magnetici, tenuti in posizione per successivo 12 h, creando così una zona ischemica che sviluppata in un PU nei giorni successivi. Le aree ferite ha dimostrato edema del tessuto ed epidermico scomparsa dall'applicazione del post-magnete di giorno 3. PUs spontaneamente sviluppato e guarito. La guarigione era, tuttavia, più lento nei topi SCI rispetto per non-SCI topi di controllo quando la ferita è stata creata sotto il livello della SCI. per contro, si è osservata nessuna differenza nella guarigione tra topi di non-SCI SCI e controllo quando la ferita è stata creata sopra il livello di SCI. Questo modello è uno strumento potenzialmente utile per studiare la dinamica di sviluppo di PU pelle e guarigione dopo SCI, nonché di testare approcci terapeutici che possono aiutare a guarire queste ferite.
Introduzione
Ulcere da pressione (PUs) sono complicazioni importanti secondarie di traumatico SCI1. PUs sono localizzate le lesioni alla pelle e/o tessuti sottostanti che di solito si verificano sulle prominenze ossee dove il peso corporeo è concentrato mentre il paziente è seduto o sdraiato1. La pelle, grasso e muscolo sono esposti a questa pressione costante che conduce allo sviluppo di ischemia localizzata, l'infiammazione dei tessuti, danni meccanici e necrosi2,3.
Lo sviluppo di PUs è influenzato da diversi fattori locali, tra cui l'entità della pressione e taglio, caricamento di durata, l'umidità della pelle e temperatura, longevità di infortuni e igiene generale della pelle. Ci sono anche fattori sistemici che svolgono un ruolo, come condizione fisica generale, osso e morfologia del tessuto del muscolo e forza4, età del paziente, misure ematologiche, sesso e fattori anche socio-economici tra cui lo stato civile, istruzione, e reddito4,5.
La prevenzione ed il trattamento di PUs rimangono sfide significative nei pazienti di SCI. Pazienti di SCI si sviluppano PUs in ~ 30-40% dei casi, con un tasso di re-avvenimento del 60-85%, probabilmente a causa del debole tessuto cicatriziale e la mancanza di sensazione protettiva1. Così, PUs spesso porta a ri-ospedalizzazione dei pazienti di SCI e nel complesso rappresentano un onere finanziario significativo (80% solo più vs SCI) al sistema di assistenza sanitaria5,6,7,8,9 , 10.
Al meglio della nostra conoscenza, ci sono stati studi in controllato impostazioni sperimentali per studiare l'impatto di SCI sul processo di guarigione PU a causa della mancanza di idonei modelli animali. Qui, un modello riproducibile e clinicamente rilevanti del mouse di PU in pelle è descritto. Questo modello può essere utilizzato per studiare la dinamica dell'inizio di PU e la guarigione successiva, nonché per testare potenziali approcci terapeutici per prevenire PU o migliorare PU guarigione nel contesto di SCI.
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Protocollo
Tutti gli animali gestione e le procedure chirurgiche sono state eseguite in conformità con un protocollo approvato dal comitato di uso e Rutgers University istituzionale Animal Care. Topi sono stati alimentati dieta standard e acqua ad libitum.
1. preparazione di strumenti chirurgici e Non chirurgici
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici e non chirurgici in autoclave.
- Pulire il tavolo operatorio chirurgico con etanolo al 70% e caldo un rilievo di riscaldamento a 37 ° C.
- Collocare il dissipatore di calore sul tavolo operatorio e coprirlo con teli chirurgici sterili.
Nota: In tutte le procedure di sopravvivenza, la tecnica "No Touch" è usata qui per mantenere la sterilità.
2. preparazione di animali e di eseguire la laminectomia spinale T9-T10
- Procurarsi i topi (Balb/c) 10-settimana-vecchio maschio adulti. Indurre l'anestesia in ogni animale con un inizio di inalatore con isoflurano 5% e quindi diminuire a 2-3% per mantenere la sedazione per il resto delle procedure.
- Confermare la completa anestesia suscitando nessuna risposta ad una stimolazione di nocicezione pizzico indotto coda/zampa.
- Radersi i capelli sopra il dorsum (testa alla coda) con un clipper elettrico e quindi applicare la crema depilatoria (3 min) per rimuovere i capelli rimanenti. Infine, lavare il dorsum con esecuzione di macchia di acqua/bagnato e restituire gli animali nelle loro gabbie.
Nota: Ciò è necessario per evitare ulteriori irritazioni alla pelle e contaminazione chimica al momento del ferimento di pelle - Il giorno successivo, applicare unguento oftalmico per le cornee per proteggere gli occhi dalla disidratazione durante la procedura chirurgica e poi, strofinare la pelle con 3 preparazioni alternative di betadine scrub e 70% di etanolo.
- Con un bisturi, è necessario eseguire un'incisione della pelle (~1.0-1.5 cm) lungo la linea mediana sul retro a livello delle vertebre T8-T12.
Nota: Il livello delle vertebre viene identificato mediante il conteggio indietro la vertebra da T13 utilizzando la posizione delle nervature di galleggiante che corrispondono al T13 vertebra11,12. - Deselezionare il tessuto adiposo sottocutaneo per ottenere accesso ai muscoli di paraspinal e poi li sezionava lentamente per esporre i processi spinous e le lamine su entrambi i lati.
Nota: Fare questa procedura con molta attenzione per evitare il sanguinamento in eccesso o qualsiasi lesione al midollo spinale, a questo punto. - Eseguire un laminectomy per esporre la colonna vertebrale (vertebre T9-T10) di staccando delicatamente la lamina spinale usando il forcipe microdissecting.
Nota: Eseguire la laminectomia in modo che un eccesso del midollo spinale è esposto per facilitare la creazione della ferita. Nel gruppo di controllo, viene eseguita solo la laminectomia.
3. eseguire la lesione completa del midollo spinale T9-T10
- Usando il forcipe, sicuro la colonna spinale T8 e ascensore fino ad per esagerare la curvatura spinale.
- Utilizzando le forbici bene, sezione del midollo tra la vertebra T9 e T10 tutto il senso al pavimento del canale vertebrale, affinché la transection completo.
- Dopo aver osservato il transection completo sotto un microscopio operatorio, è necessario applicare un pezzo di grasso sottocutaneo sopra il sito di laminectomia per fornire ulteriore protezione al midollo spinale prima della chiusura del sito chirurgico.
- Infine, chiudere la ferita e suturare i muscoli paravertebrali, fascia superficiale, mediante sutura continua e quindi chiudere la pelle mediante sutura clip12.
- Post-SCI, osservare il movimento di viscere il giorno successivo; Tuttavia, il gestore di vescica urinaria di evacuazione manuale della vescica.
Nota: La scala di Mouse Basso (BMS) può essere utilizzato per monitorare i progressi del hindlimb recupero funzionale post-SCI al giorno 2 e poi settimanale, Vedi complementare figura 111,12,13.
4. induzione di ulcera di pressione della pelle dopo SCI completa
- Immediatamente dopo l'intervento SCI, macchia il dorso dell'animale con betadine e 70% di alcol.
- Per un PU sotto il sito SCI, iniettare nella pelle dorsale vicino l'osso sacro, un volume molto piccolo (10 µ l) di soluzione di bupivacaina 0,125% utilizzando un ago 25 G al equidistanti posti ~0.5-1.0 cm tra loro, in un ellisse intorno al sito di applicazione del magnete.
Nota: Per un PU sopra il sito SCI, iniettare la pelle dorsale vicino alla regione cervicale. - Sollevare una piega di pelle sul retro del mouse delicatamente e a sandwich tra 2 dischi magnetici (5 × 12 mm di diametro, 2,4 g ciascuna, forza magnetica 3800g) (Figura 1). 11 , 12
- Subito dopo inserito l'applicazione del magnete, ritorno gli animali nelle gabbie singole un rilievo di riscaldamento fino a quando è piena coscienza riguadagnata (Figura 1).
- Dopo 12 h di applicazione del magnete, leggermente anestetizzare l'animale con isoflurano e rimuovere i magneti. Fotografare i siti di ferita, per registrare l'aspetto iniziale del PU (giorno 0 tempo di punto). Coprire la ferita con la pellicola di medicazioni trasparenti (3M) essiccazione o contaminazione.
5. post-operatorio cura degli animali, l'eutanasia e raccolta di tessuto per istologia
- Subito dopo della chirurgia, iniettare l'animale con 1 mL di soluzione fisiologica allo 0,9% per via sottocutanea per l'idratazione.
- Iniettare per via sottocutanea buprenorfina-SR (1 mg/kg) immediatamente per analgesia.
- Iniettare per via sottocutanea animale quotidiano meloxicam (1 mg/kg) e cefazolina (50 mg/kg per 3-7 giorni) e due volte il evacuazione giornaliera di manuale della vescica.
- Posizionare gli animali in gabbie singole e fornire cibo accessibile e acqua ad libitum. Topi con SCI completa possono camminare con le loro zampe anteriori e avvicinarsi al cibo e acqua senza alcuna difficoltà.
- Rimuovere la clip chirurgiche 7 giorni dopo l'intervento chirurgico SCI.
- Presso i punti di tempo desiderato dopo SCI e ferendone pelle, eutanasia animali da inalazione di CO2 (3-5 min.), in conformità degli orientamenti AVMA eutanasia14.
- Raccogliere campioni di pelle ferita, fissare in formalina al 10% per 24 h e quindi memorizzare in etanolo al 70% a 4 ° C fino al sezionamento.
- Per elaborare tessuti, incorporare in paraffina e generare sezioni sottili (5 µm) su un microtomo. Macchia con ematossilina ed eosina (H & E) per visualizzare la morfologia del tessuto (Figura 3). Per gli studi di immunoistochimica (Figura 4), macchia sezioni utilizzando gli anticorpi adatti per Ki67 (proliferazione), CD31 (angiogenesi) e l'actina alfa-liscia del muscolo (α-SMA) come descritto nel Kumar et al.12
Nota: Software di analisi di immagine consente di quantificare le caratteristiche di immagine12.
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Risultati
Questo protocollo crea un PU nella cornice del completo SCI. brevemente (come illustrato nella Figura 1), tutti i mouse con o senza SCI completa tollerato i magneti molto bene, che è rimasto nella loro posizione originale per la versione completa 12h (figure 1C, 1D, 1f, 1h ). Tutti i topi hanno sviluppato due ferite circolari separate da un ponte di tessuto normale (Figura 1e, 1G, 1i). La risposta iniziale ferime...
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Discussione
Il protocollo in questo studio descrive un nuovo modello sperimentale di PUs per valutare l'impatto della SCI sulla guarigione della ferita. La pelle di PUs sono state indotte tramite un'applicazione di 12h di due magneti di disco di diametro di 12 mm su una piega di pelle dorsale, impostare sopra o sotto il sito SCI. I dati mostrano che SCI rallenta cicatrizzazione della pelle nei topi. D'importanza, queste osservazioni sono state fatte in particolare nelle ferite della pelle sotto il livello di innervazione del SIC, co...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalla New Jersey, il midollo spinale Research (CSCR15IRG010), il Ministero della difesa (SC160029) e Yale dipartimento di chirurgia Ohse Research Grant programma. Grazie Sean o ' Leary dal W.M. Keck Center for Neuroscience collaborativo, Rutgers per assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Magneti | Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO | CD14C | 3800 G Forza magnetica |
| Topi dieta standard | PMI Nutrition International, Brentwood, MO | Standard Food Pellet | |
| Isoflurano | HENRY SCHEIN Salute degli animali | SKU 029405 | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | Software di analisi delle immagini | |
| BETADINE Scrub chirurgico | HENRY SCHEIN Salute degli animali | ||
| Unguento oftalmico | HENRY SCHEIN Salute animale | SKU 008897 | |
| NAIR-Lozione Depilante | Chiesa & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ | ||
| ELOXIJECT (meloxicam) Iniezione | HENRY SCHEIN Salute degli animali | SKU 049755 | 5 mg/mL, 10 mL |
| Cefazolina Sodica | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 054846 | 1 g, 10 mL flacone |
| Buprenorfina-SR | ZooPharm, Windsor, CO | - | - |
| 0,9% di cloruro di sodio per iniezione USP | BRAUN, Irvine, CA | S8004-5384 | |
| 10% di formalina tamponata neutra. | VWR, Radnor, PA | 16004-130 | |
| BALB/C Topo maschio | Charles River Lab., Wilmington, MA | 28 | |
| Applicatore sterile con punta in cotone | Puritan, Guilford, ME | SKU#: 25-806 | |
| Michel Suture Clips | Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA | 12040-01 | |
| Sutura chirurgica, U.S.P. | Henry Schein Salute degli animali | Codice 101-2636 |
Riferimenti
- Rappl, L. M. Physiological changes in tissues denervated by spinal cord injury tissues and possible effects on wound healing. International Wound Journal. 5 (3), 435-444 (2008).
- Salcido, R., Popescu, A., Ahn, C. Animal models in pressure ulcer research. The Journal of Spinal Cord Medicine. 30 (2), 107-116 (2007).
- Mak, A. F., Zhang, M., Tam, E. W. Biomechanics of pressure ulcer in body tissues interacting with external forces during locomotion. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 29-53 (2010).
- National Pressure Ulcer Advisory Panel. Prevention and Treatment of Pressure Ulcers: Clinical Practice Guideline. , Cambridge Media. Osborne Park, Western Australia. (2014).
- Marin, J., Nixon, J., Gorecki, C. A systematic review of risk factors for the development and recurrence of pressure ulcers in people with spinal cord injuries. Spinal Cord. 51 (7), 522-527 (2013).
- Krause, J. S. Skin sores after spinal cord injury: relationship to life adjustment. Spinal Cord. 36 (1), 51-56 (1998).
- Redelings, M. D., Lee, N. E., Sorvillo, F. Pressure ulcers: more lethal than we thought? Advances in Skin & Wound. 18 (7), 367-372 (2005).
- Kruger, E. A., Pires, M., Ngann, Y., Sterling, M., Rubayi, S. Comprehensive management of pressure ulcers in spinal cord injury: current concept and future trends. The Journal of Spinal Cord Medicine. 36 (6), 572-585 (2013).
- Lala, D., Dumont, F. S., Leblond, J., Houghton, P. E., Noreau, L. Impact of pressure ulcers on individuals living with a spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 95 (15), 2312-2319 (2014).
- Li, C., DiPiro, N. D., Krause, J. A latent structural equation model of risk behaviors and pressure ulcer outcomes among people with spinal cord injury. Spinal Cord. 55 (6), 553-558 (2017).
- Kumar, S., Yarmush, M. L., Berthiaume, F. Impact of complete spinal cord injury on neovascularization and tissue granulation in mouse model of skin pressure ulcers. Journal of Neurotrauma. 34 (13), A72-A73 (2017).
- Kumar, S., Yarmush, M. L., Dash, B. C., Hsia, H. C., Berthiaume, F. Impact of complete spinal cord injury on healing of skin ulcers in mouse models. Journal of Neurotrauma. 35 (6), 815-824 (2018).
- Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois, USA. (2013).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 17 (4), 221-227 (2004).
- Peirce, S. M., Skalak, T. C., Rodeheaver, G. T. Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation: a skin model in the rat. Wound Repair and Regeneration. 8 (1), 68-76 (2000).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 969618-969625 (2011).
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