Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene

Summary

Qui, descriviamo i protocolli per la validazione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 come un obiettivo della droga nella leucemia utilizzando modelli in vitro e in vivo genetica e umanizzato del topo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Abstract

La dimostrazione di inibitori della tirosina chinasi (TKI) nel trattamento della leucemia mieloide cronica (CML) ha segnato una nuova era nella terapeutica del cancro. Tuttavia, una piccola popolazione di cellule non risponde al trattamento TKI, con conseguente malattia minima residua (MRD); anche il più potente TKI non riescono a sradicare queste cellule. Queste cellule MRD servono come un serbatoio di sviluppare una resistenza alla terapia. Non è noto perché TKI trattamento è inefficace contro le cellule MRD. Segnalazione di fattore di crescita è implicato nel sostenere la sopravvivenza delle cellule MRD durante il trattamento TKI, ma una comprensione meccanicistica è carente. Studi recenti hanno dimostrato che un elevato c-Fos e Dusp1 espressione come risultato di convergenti oncogeno e segnalazione in cellule di MRD di fattore di crescita mediano resistenza TKI. L'inibizione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 rende squisitamente sensibile a TKI CML e cure CML in entrambi i modelli genetici e umanizzato del mouse. Abbiamo identificato questi geni bersaglio usando i microarrays multiple da TKI-sensibile e - cellule resistenti. Qui, mettiamo a disposizione metodi per la convalida di destinazione utilizzando modelli murini in vitro e in vivo. Questi metodi possono essere applicati facilmente a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Introduction

Attività della chinasi della tirosina costitutiva dell'oncogene di fusione BCR-ABL1 provoca CML, che fornisce una spiegazione razionale per indirizzare l'attività della chinasi di piccole molecole inibitrici. Il successo di TKI nel trattamento di pazienti affetti da LMC ha rivoluzionato il concetto di terapia mirata^1,2. Successivamente, la terapia anti-chinasi come medicina di precisione è stata sviluppata per parecchie altre malignità, compreso i tumori solidi. Finora, più di trenta gli inibitori della chinasi sono stati approvati dalla FDA stato Uniti per il trattamento di vari tumori maligni. Mentre TKI tra....

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida della cura degli animali istituzionali e uso Committee (IACUC) a di Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC). Esemplari umani (BM normale e che da CML (p210-BCR-ABL +) leucemia) sono stati ottenuti attraverso protocolli approvati Institutional Review Board (Institutional Review Board: Hospital Medical Center di Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children) e consenso informato donatore da CCHMC e l'Università di Cincinnati.

1. in tempo reale qPCR analisi

1. Isolare il RNA totale da BaF3 cellule che crescono in RPMI completato con 10% FBS ....

Results

Dipendenza dell'oncogene è stato implicato nell'efficacia terapeutica di TKI. Tuttavia, i meccanismi che guidano la dipendenza dell'oncogene non sono capiti. Abbiamo effettuato l'analisi dell'espressione genica imparziale multipli per identificare la componente genetica coinvolta nell'orchestrare la dipendenza. Queste analisi hanno rivelato il upregulation di tre geni, c-Fos, Dusp1 e Zfp36, in cellule tumorali che non sono dipendenti da oncogeno di segnalazione per la sopravvivenza e, qui.......

Discussion

Per la maggior parte delle cellule tumorali, la risposta terapeutica a TKI è mediata da un blocco di tirosina-chinasi-oncoproteina segnali a cui il tumore è assuefatto. Tuttavia, relativamente poco è conosciuto circa come una minoranza delle cellule tumorali, contribuendo alla MRD escape l'oncogene dipendenza e terapia⁴. Studi recenti hanno rivelato che la segnalazione di fattore di crescita media farmacoresistenza in leucemia e tumori solidi dell'organo. Ciò suggerisce che vari meccanismi molecol.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiali biologici
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
Frammento di fibronectina umana ricombinante con retroNectina	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (metilcellulosa per CFU di topo)	Cellule staminali	3434
MethoCult H4434 Classic (metilcellulosa per CFU umana)	Cellule staminali	4434
4-idrossitamoxifene	Sigma	H6278
Ricombinante Murino SCF	Prospec	CYT-275
Ricombinante Murino Flt3-Ligando	Prospec	CYT-340
Ricombinante Urina IL-6	Prospec	CYT-350
Ricombinante Urina IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratorio	I-5508
Curcumina	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biologico	S11150
Tripsina EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutammina	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in acqua
Puromicina	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamina solfato	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in acqua
Soluzione di Trypan Blue (0,4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0,45 μ Filtro a dischi acro M	PALL	2016-10
70 μ m nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polisaccarosio)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Cocktail Inibitore della Proteasi	Roche	CO-RO
Cocktail Inibitore della Fosfatasi 2	Sigma	P5762
Membrana di nitrocullulosio	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Substrato di durata estesa (substrato di chemiluminescenza)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD
CD117 APC	BD
BD Pharm Lyse	BD
BD Cytofix/Cytoperm (Soluzione fissante e permeabilizzante)	BD
BD Perm/Lavaggio  (permeabilizzazione e soluzione di lavaggio per flusso fosfogenico)	BD
fosfo p38	Tecnologie di segnalazione cellulare	4511S
totale p38	Tecnologie di segnalazione cellulare	9212
Controllo IgG del topo	BD
Alexa Flour 488 coniugato	Invitrogen	A-11034
Cloruro di calcio	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Provette per capillari sanguigni	Fisher	22-260-950
Provetta per prelievo di sangue	Giene Bio-One	450480
Siero di vitello neonato	Atlanta biologico	S11295
Eritropoieina	Amgen	5513-267-10
umano SCF	Prospec	CYT-255
Umano IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (terreni per il test LTCIC)	Stem Cell Technologies	5100
Idrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 siringa da insulina 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestello	Coor tek	60316 e 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillina	Sigma	A0166	100 mg/mL stock in acqua
Bacto agar (agar)	Difco	214050
Brodo formidabile	Becton Dickinson	243820
Agarosio	Genemate	E-3119-500
Doxiciclina chow TestDiet.com		52662	RMH1500 modificato, autoclavabile 5LK8  con 0,0625% di doxiciclina
Tamoxifene	Sigma	T5648
Iodonitrotetrazolio cloruro	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Kit per sangue e tessuti	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq polimerasi con colorante Green loadign	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (Kit di isolamento dell'RNA)	Qiagen	217084
Kit Dnase senza DNA (trattamento con DNAsi per RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (trascrittasi inversa per la sintesi di cDNA)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (miscela di taq polimerasi con colorante intercalante verde per qPCR)	Kit
CD117 MicroBead	Miltenyi	130-091-224
umano a lungo termine per l'avvio di colture cellulari	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubatore	Thermo scientific
Pivot bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 contatore di cellule automatizzato	Bio-RAD
C-1000 Termociclatore	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (sistema di imaging per gel e western blots)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (contatore di boold)	Drew-Scientific
LSR II (analizzatore FACS)	BD
Fortessa I (analizzatore FACS)	BD
FACSAriaII (Smistatore FACS)	BD
Supporto magnetico	Miltenyi
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Modello 68A	sorgente Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dott.ssa Claudia Huettner' s laboratorio
BoyJ	impianto di carote di topo presso CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	impianto di carotaggio del topo presso CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Prodotto in casa
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Prodotto in casa
Cells
BaF3	Regalo da George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Regalo da George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ e cellule	CD34+ normaliOspedale universitario, Università di Cincinnati