Qui, descriviamo i protocolli per la validazione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 come un obiettivo della droga nella leucemia utilizzando modelli in vitro e in vivo genetica e umanizzato del topo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.
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Articolo metodologico
Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene
In questo articolo
Sommario
Abstract
La dimostrazione di inibitori della tirosina chinasi (TKI) nel trattamento della leucemia mieloide cronica (CML) ha segnato una nuova era nella terapeutica del cancro. Tuttavia, una piccola popolazione di cellule non risponde al trattamento TKI, con conseguente malattia minima residua (MRD); anche il più potente TKI non riescono a sradicare queste cellule. Queste cellule MRD servono come un serbatoio di sviluppare una resistenza alla terapia. Non è noto perché TKI trattamento è inefficace contro le cellule MRD. Segnalazione di fattore di crescita è implicato nel sostenere la sopravvivenza delle cellule MRD durante il trattamento TKI, ma una comprensione meccanicistica è carente. Studi recenti hanno dimostrato che un elevato c-Fos e Dusp1 espressione come risultato di convergenti oncogeno e segnalazione in cellule di MRD di fattore di crescita mediano resistenza TKI. L'inibizione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 rende squisitamente sensibile a TKI CML e cure CML in entrambi i modelli genetici e umanizzato del mouse. Abbiamo identificato questi geni bersaglio usando i microarrays multiple da TKI-sensibile e - cellule resistenti. Qui, mettiamo a disposizione metodi per la convalida di destinazione utilizzando modelli murini in vitro e in vivo. Questi metodi possono essere applicati facilmente a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.
Introduzione
Attività della chinasi della tirosina costitutiva dell'oncogene di fusione BCR-ABL1 provoca CML, che fornisce una spiegazione razionale per indirizzare l'attività della chinasi di piccole molecole inibitrici. Il successo di TKI nel trattamento di pazienti affetti da LMC ha rivoluzionato il concetto di terapia mirata1,2. Successivamente, la terapia anti-chinasi come medicina di precisione è stata sviluppata per parecchie altre malignità, compreso i tumori solidi. Finora, più di trenta gli inibitori della chinasi sono stati approvati dalla FDA stato Uniti per il trattamento di vari tumori maligni. Mentre TKI tra....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida della cura degli animali istituzionali e uso Committee (IACUC) a di Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC). Esemplari umani (BM normale e che da CML (p210-BCR-ABL +) leucemia) sono stati ottenuti attraverso protocolli approvati Institutional Review Board (Institutional Review Board: Hospital Medical Center di Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children) e consenso informato donatore da CCHMC e l'Università di Cincinnati.
1. in tempo reale qPCR analisi
- Isolare il RNA totale da BaF3 cellule che crescono in RPMI completato con 10% FBS ....
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Risultati
Dipendenza dell'oncogene è stato implicato nell'efficacia terapeutica di TKI. Tuttavia, i meccanismi che guidano la dipendenza dell'oncogene non sono capiti. Abbiamo effettuato l'analisi dell'espressione genica imparziale multipli per identificare la componente genetica coinvolta nell'orchestrare la dipendenza. Queste analisi hanno rivelato il upregulation di tre geni, c-Fos, Dusp1 e Zfp36, in cellule tumorali che non sono dipendenti da oncogeno di segnalazione per la sopravvivenza e, qui.......
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Discussione
Per la maggior parte delle cellule tumorali, la risposta terapeutica a TKI è mediata da un blocco di tirosina-chinasi-oncoproteina segnali a cui il tumore è assuefatto. Tuttavia, relativamente poco è conosciuto circa come una minoranza delle cellule tumorali, contribuendo alla MRD escape l'oncogene dipendenza e terapia4. Studi recenti hanno rivelato che la segnalazione di fattore di crescita media farmacoresistenza in leucemia e tumori solidi dell'organo. Ciò suggerisce che vari meccanismi molecol.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a G. Q. Daley per fornire le cellule BaF3 e WEHI e Reya T. per la MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP costruisce. Gli autori sono grati a Carroll M. per la fornitura dei campioni da crisi di scoppio CML. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni a M.A. da NCI (1RO1CA155091), la leucemia Research Foundation e Fondazione V e da NHLBI (R21HL114074-01).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali biologici | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| Frammento di fibronectina umana ricombinante con retroNectina | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (metilcellulosa per CFU di topo) | Cellule staminali | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (metilcellulosa per CFU umana) | Cellule staminali | 4434 | |
| 4-idrossitamoxifene | Sigma | H6278 | |
| Ricombinante Murino SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Ricombinante Murino Flt3-Ligando | Prospec | CYT-340 | |
| Ricombinante Urina IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Ricombinante Urina IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratorio | I-5508 | |
| Curcumina | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biologico | S11150 | |
| Tripsina EDTA 1x | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutammina | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5 mg/mL stock in acqua |
| Puromicina | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamina solfato | Sigma | P3369 | 5 mg/mL stock in acqua |
| Soluzione di Trypan Blue (0,4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0,45 μ Filtro a dischi acro M | PALL | 2016-10 | |
| 70 μ m nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polisaccarosio) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Cocktail Inibitore della Proteasi | Roche | CO-RO | |
| Cocktail Inibitore della Fosfatasi 2 | Sigma | P5762 | |
| Membrana di nitrocullulosio | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Substrato di durata estesa (substrato di chemiluminescenza) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | ||
| CD117 APC | BD | ||
| BD Pharm Lyse | BD | ||
| BD Cytofix/Cytoperm (Soluzione fissante e permeabilizzante) | BD | ||
| BD Perm/Lavaggio (permeabilizzazione e soluzione di lavaggio per flusso fosfogenico) | BD | ||
| fosfo p38 | Tecnologie di segnalazione cellulare | 4511S | |
| totale p38 | Tecnologie di segnalazione cellulare | 9212 | |
| Controllo IgG del topo | BD | ||
| Alexa Flour 488 coniugato | Invitrogen | A-11034 | |
| Cloruro di calcio | Invitrogen | K278001 | |
| 2x HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Provette per capillari sanguigni | Fisher | 22-260-950 | |
| Provetta per prelievo di sangue | Giene Bio-One | 450480 | |
| Siero di vitello neonato | Atlanta biologico | S11295 | |
| Eritropoieina | Amgen | 5513-267-10 | |
| umano SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Umano IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (terreni per il test LTCIC) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Idrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 siringa da insulina 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestello | Coor tek | 60316 e 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillina | Sigma | A0166 | 100 mg/mL stock in acqua |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Brodo formidabile | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarosio | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxiciclina chow TestDiet.com | 52662 | RMH1500 modificato, autoclavabile 5LK8 con 0,0625% di doxiciclina | |
| Tamoxifene | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolio cloruro | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Kit per sangue e tessuti | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polimerasi con colorante Green loadign | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (Kit di isolamento dell'RNA) | Qiagen | 217084 | |
| Kit Dnase senza DNA (trattamento con DNAsi per RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (trascrittasi inversa per la sintesi di cDNA) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (miscela di taq polimerasi con colorante intercalante verde per qPCR) | Kit | ||
| CD117 MicroBead | Miltenyi | 130-091-224 | |
| umano a lungo termine per l'avvio di colture cellulari | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubatore | Thermo scientific | ||
| Pivot bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 contatore di cellule automatizzato | Bio-RAD | ||
| C-1000 Termociclatore | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (sistema di imaging per gel e western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet (contatore di boold) | Drew-Scientific | ||
| LSR II (analizzatore FACS) | BD | ||
| Fortessa I (analizzatore FACS) | BD | ||
| FACSAriaII (Smistatore FACS) | BD | ||
| Supporto magnetico | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Modello 68A | sorgente Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dott.ssa Claudia Huettner' s laboratorio | ||
| BoyJ | impianto di carote di topo presso CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | impianto di carotaggio del topo presso CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Prodotto in casa | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Prodotto in casa | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Regalo da George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Regalo da George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ e cellule | CD34+ normaliOspedale universitario, Università di Cincinnati |
Riferimenti
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. E....
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Ristampe e permessi
