Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene

Sommario

Qui, descriviamo i protocolli per la validazione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 come un obiettivo della droga nella leucemia utilizzando modelli in vitro e in vivo genetica e umanizzato del topo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Abstract

La dimostrazione di inibitori della tirosina chinasi (TKI) nel trattamento della leucemia mieloide cronica (CML) ha segnato una nuova era nella terapeutica del cancro. Tuttavia, una piccola popolazione di cellule non risponde al trattamento TKI, con conseguente malattia minima residua (MRD); anche il più potente TKI non riescono a sradicare queste cellule. Queste cellule MRD servono come un serbatoio di sviluppare una resistenza alla terapia. Non è noto perché TKI trattamento è inefficace contro le cellule MRD. Segnalazione di fattore di crescita è implicato nel sostenere la sopravvivenza delle cellule MRD durante il trattamento TKI, ma una comprensione meccanicistica è carente. Studi recenti hanno dimostrato che un elevato c-Fos e Dusp1 espressione come risultato di convergenti oncogeno e segnalazione in cellule di MRD di fattore di crescita mediano resistenza TKI. L'inibizione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 rende squisitamente sensibile a TKI CML e cure CML in entrambi i modelli genetici e umanizzato del mouse. Abbiamo identificato questi geni bersaglio usando i microarrays multiple da TKI-sensibile e - cellule resistenti. Qui, mettiamo a disposizione metodi per la convalida di destinazione utilizzando modelli murini in vitro e in vivo. Questi metodi possono essere applicati facilmente a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Introduzione

Attività della chinasi della tirosina costitutiva dell'oncogene di fusione BCR-ABL1 provoca CML, che fornisce una spiegazione razionale per indirizzare l'attività della chinasi di piccole molecole inibitrici. Il successo di TKI nel trattamento di pazienti affetti da LMC ha rivoluzionato il concetto di terapia mirata^1,2. Successivamente, la terapia anti-chinasi come medicina di precisione è stata sviluppata per parecchie altre malignità, compreso i tumori solidi. Finora, più di trenta gli inibitori della chinasi sono stati approvati dalla FDA stato Uniti per il trattamento di vari tumori maligni. Mentre TKI trattamento è molto efficace nel sopprimere la malattia, non è curativo. Inoltre, una piccola popolazione di cellule tumorali persiste durante il trattamento: il MRD^3,4,5. Anche i pazienti che hanno mostrato la remissione completa sono lasciati con MRD, che alla fine risultati nella ricaduta se non continuamente repressa. Di conseguenza, l'eliminazione delle cellule MRD è necessario per raggiungere una risposta durevole o curativa. CML rappresenta un paradigma prezioso per definire il concetto di medicina di precisione, meccanismi di oncogenesi, la terapeutica razionale destinazione-diretto, progressione di malattia e resistenza ai farmaci. Tuttavia, ancora oggi, il meccanismo di guida morte TKI-indotta delle cellule in cellule di cancro non è pienamente compreso, né perché sono intrinsecamente resistenti a TKI^4,6celle MRD (costituite da cellule staminali leucemiche [LSCs]). Tuttavia, il fenomeno della "dipendenza dell'oncogene" chinasi mutante oncoproteina è implicato nell'efficacia TKI dove l'inibizione acuta dell'oncogene mirati da TKI provoca uno shock oncogeno che conduce a una risposta massiccia proapoptotic o quiescenza in cella contesto-dipendente^6,7,8,9. Tuttavia, la base meccanicistica della dipendenza dell'oncogene è carente. Studi recenti hanno implicato che fattore di crescita di segnalazione abroga la dipendenza dell'oncogene e di conseguenza conferisce resistenza al TKI terapia^10,11,12. Di conseguenza, per comprendere il meccanismo di dipendenza dell'oncogene, abbiamo effettuato delineamento di espressione intero genoma da BCR-ABL1 addicted e cellule nonaddicted (sviluppate con fattori di crescita), che ha rivelato che il c-Fos e Dusp1 sono mediatori critici di oncogene dipendenza¹³. La delezione genetica di c-Fos e Dusp1 è letale per BCR-ABL1-espressione sintetiche cellule e i topi utilizzati nell'esperimento non hanno sviluppato la leucemia. Inoltre, l'inibizione di c-Fos e DUSP1 di piccole molecole inibitrici curata LMC BCR-ABL1-indotta in topi. I risultati mostrano che i livelli di espressione di c-Fos e Dusp1 definiscono la soglia apoptotica in cellule tumorali, tale che i livelli più bassi conferiscono sensibilità ai farmaci, mentre livelli più elevati causano resistenza alla terapia¹³.

Per identificare i geni che guida la dipendenza dell'oncogene, abbiamo effettuato diversi esperimenti in presenza di fattore di crescita e un TKI (imatinib) utilizzo del mouse - e cellule di derivazione paziente CML (K562) del profilo di espressione di intero genoma. Questi dati sono stati analizzati in parallelo con CML paziente set di dati ottenuti da CD34⁺ cellule staminali ematopoietiche prima e dopo il trattamento con imatinib. Questa analisi ha rivelato tre geni (un fattore di trascrizione [c-Fos], specificità dual fosfatasi 1 [Dusp1] e una proteina di legame al RNA [Zfp36]) che comunemente sono sovraregolati in cellule TKI-resistenti. Per convalidare l'importanza di questi geni che conferiscono resistenza ai farmaci, abbiamo effettuato la dettagliata analisi in vitro e in vivo . I livelli di espressione di questi geni sono stati confermati mediante qPCR in tempo reale (RT-qPCR) e western blotting in cellule resistenti alla droga. Ulteriormente, la sovraespressione di cDNA e atterramento di shRNA forcine di c-Fos, Dusp1, e Zfp36 ha rivelato che elevati c-Fos e Dusp1 espressioni sono sufficienti e necessarie per conferire resistenza TKI. Di conseguenza, abbiamo effettuato una convalida in vivo utilizzando modelli murini con c-Fos e Dusp1 solo. Per la validazione genetica di c-Fos e Dusp1, abbiamo creato ROSACreERT-inducible c-Fos^fl/fl topi (knockout condizionale)¹⁴ e li ha attraversato con Dusp1^{- / -} (dritto knockout)¹⁵ per rendere ROSACreERT2-c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} topi transgenici doppio. Cellule derivate da midollo osseo c-Kit⁺ (da c-Fos^fl/fl-, Dusp1^{- / -}- e c-Fos^fl/flDusp1^{- / -}) che esprimono BCR-ABL1 sono stati analizzati in vitro in un saggio di formazione di colonie unit (CFU) e in vivo da trapianto di midollo osseo in topi irradiati letalmente, per testare il requisito di c-Fos e Dusp1 da soli o insieme a sviluppo di leucemia. Allo stesso modo, le inibizioni chimiche di c-Fos di DFC (difluorinated curcumina)¹⁶ e Dusp1 di BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)¹⁷ sono stati testati in vitro e in vivo usando BCR-ABL1-esprimendo, osso cellule derivate dal midollo c-Kit⁺ dal mouse wild type (WT). Per confermare la richiesta di c-Fos e Dusp1 in cellule staminali leucemiche, abbiamo utilizzato un modello murino CML dove BCR-ABL1 specificamente è stata indotta in sue cellule staminali di doxiciclina (esprime Tet-transactivator sotto cellule staminali murine leucemia (SCL) gene 3' enhancer regolamento)^18,19. Abbiamo usato il midollo osseo Lin^–cellule c-Kit di Sca⁺⁺ (TSS) da questi topi in un'analisi di trapianto in vivo. Inoltre, abbiamo stabilito i livelli di phopsho-p38 e l'espressione di IL-6 come biomarcatori di farmacodinamica per Dusp1 e l'inibizione di c-Fos, rispettivamente, in vivo. Infine, di estendere lo studio per rilevanza umana, CD34 paziente-derivati⁺ cellule (equivalente alle cellule c-Kit⁺ da topi) sono stati sottoposti a lungo termine saggi in vitro d'inizio coltura cellulare (LTCIC) e un modello di topo umanizzato in vivo di CML^20,21. I topi immunodeficienti sono stati trapiantati con cellule di CML CD34 +, seguite da trattamento farmacologico e l'analisi di sopravvivenza delle cellule leucemiche umane.

In questo progetto, sviluppiamo metodi per l'identificazione del target e convalide utilizzando strumenti sia genetici e chimici, utilizzando diversi modelli preclinici. Questi metodi possono essere applicati con successo per convalidare altri obiettivi lo sviluppo di modalità di chimica per lo sviluppo terapeutico.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida della cura degli animali istituzionali e uso Committee (IACUC) a di Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC). Esemplari umani (BM normale e che da CML (p210-BCR-ABL +) leucemia) sono stati ottenuti attraverso protocolli approvati Institutional Review Board (Institutional Review Board: Hospital Medical Center di Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children) e consenso informato donatore da CCHMC e l'Università di Cincinnati.

1. in tempo reale qPCR analisi

1. Isolare il RNA totale da BaF3 cellule che crescono in RPMI completato con 10% FBS e 10% WEHI trascorso il terreno di coltura come fonte di interleukin-3 (IL-3).
2. Raccogliere le cellule in fase logaritmica (99% vivo) trattata (IL-3 e imatinib) così come da campioni non trattati e li Centrifugare a 435 x g per 3 min. La salute e le fasi di crescita delle cellule sono fondamentali in quanto loro profili di espressione genica possono cambiare radicalmente.
3. Isolare gli RNA di purificazione di RNA totale²². Quantificare il RNA totale; quindi, sottoporlo a dnasi trattamento²³. Convertire gli importi uguali di RNA DNA-free (2 µ g) di cDNA con trascrittasi inversa²⁴.
4. Eseguire qPCRs con gli iniettori di gene-specifico (tabella 1). Svolgere PCRs nelle reazioni di 20 µ l a 0,2 mL, sottili provette PCR con tappi ottici, utilizzando una polimerasi 1x mix (Vedi Tabella materiali), 0,5 µM di ogni primer, 1 µ l di DNA e l'acqua. Posizionare la reazione nel termociclatore con il seguente ciclo: passaggio 1, 95 ° C per 10 min; Fase 2, 95 ° C per 15 s; Passaggio da 3 a 60 ° C per 1 min; Passo 4, ripetere i passaggi 2-3 40 volte. Eseguire tutti i PCRs in triplici copie e normalizzare i dati in tempo reale per l'espressione di β-actina prima della stampa.

2. Western Blotting

Nota: Estratti di cellule intere sono stati preparati con l'aggiunta di 250 µ l di tampone di lisi 1x come descritto in Kesarwani et al.¹³ completati con un cocktail di inibitore di proteasi e fosfatasi inibitore 2 cocktail.

1. Raccolto 5 milioni BaF3 cellule in fase logaritmica (99% vivo) da trattati (IL-3 e imatinib) così come da non trattati BaF3 cellule mediante centrifugazione a 435 x g per 3 min a 4 ° C. Lisare le cellule nel buffer di lisi (250 µ l) pipettando su e giù 1 x, seguito da un'incubazione di 5 min a 80 ° C. Sottoporre ad ultrasuoni lisato di abbattere tutto il DNA con 5 – 6 impulsi di 5 s ciascuno in una cella frigorifera a 4 ° C.
2. Trasferire il lisato in una provetta da 1,5 mL e centrifugare esso a 16.000 x g per 5 min rimuovere qualsiasi materiale insolubile. L'estratto può essere memorizzato a-80 ° C fino all'utilizzo. Riscaldare i campioni a 80 ° C per 5 min in un blocco di calore prima del caricamento. Caricare 10 µ l di campione utilizzando una punta di gel-caricamento su gel di SDS-PAGE 10%.
3. Risolvere le proteine a 150 V fino a quando la tintura di riferimento raggiunge il fondo del gel. Trasferimento della proteina a membrane di nitrocellulosa in un trasferimento elettroforetico a 1 amp per 1 h. Dopo il trasferimento, bloccare le membrane in 1 x soluzione fisiologica tamponata + 0.1% Tween 20 (TBST) con 5% senza grassi del latte per 1 h e sonda durante la notte a 4 ° C con gli anticorpi adatti a una diluizione di 1:1,000.
4. Lavare le membrane 3 a 5 volte con TBST per 10 min ciascuno; quindi, sonda con un coniugato HRP appropriato anticorpo secondario (1:5, 000 diluizione) a temperatura ambiente per 1 h. La quantità di TBST utilizzato dipende la dimensione del contenitore. Assicurati di sommergere completamente la membrana in TBST. Lavare l'anticorpo secondario 3 x per 5 minuti ciascuno con TBST.
5. Sviluppare la macchia usando reagente substrato chemiluminescente. Mescolare volumi uguali del substrato e il buffer da due bottiglie, proprio prima dell'uso. Aggiungere il substrato nella parte superiore della membrana per coprire l'intera membrana con una pipetta da 1 mL e incubare per 1 min. Le macchie dovrebbero essere imaged entro 1 – 10 min all'aggiunta del substrato.
6. Con attenzione usando il forcipe smussato, posizionare la membrana sulla piattaforma del sistema di imaging (Vedi Tabella materiali), evitando gran parte del liquido. Selezionare una vista dal vivo e scegli le macchie e chemiluminiscence dal menu. Utilizzando acquisizione manuale, acquisire esposizioni multiple in diversi momenti. Questi file possono essere visualizzati e quantificati tramite software di imaging.

3. generazione di topi Knockout

1. Croce di c-Fos^fl/fl topi con i topi di ROSACreERT2 per generare ROSACreERT2c-Fos^fl/fl topi¹³. Per creare topi doppio knockout (KO), razza topi^fl/fl ROSACreERT2c-Fos con Dusp1^{- / -} mouse per generare ROSACreERT2c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} topi¹³. Genotipo i topi da clips di coda seguirono da PCR, come descritto di seguito.
2. Genotipizzazione:
   1. Per preparare il DNA, una piccola porzione della coda di clip con le forbici e metterlo in una provetta da 1,5 mL. Cauterizzare la coda con le forbici riscaldate. Aggiungere 200 µ l di NaOH di 50 mM a coda ritagliata nel tubo e incubare a 95 ° C in un blocco di calore per 1 h.
   2. Vortice il tubo ben e, quindi, neutralizzare aggiungendo 50 µ l di 1 M Tris-HCl pH 6.8 e vortex nuovamente. Centrifugare la provetta a velocità massima per 1 min.
   3. Eseguire PCRs in 20 µ l le reazioni in 0,2 mL, sottili provette per PCR usando 1 x Taq mix master della polimerasi contenente colorante, 0,5 µM di ogni primer, 1 µ l di DNA e l'acqua. Disporre le provette secondo il termociclatore ed eseguire i cicli appropriati, come illustrato nella tabella 2.
   4. Eseguire il prodotto PCR su gel di agarosio al 2% e immagine utilizzando un sistema di documentazione del gel.

4. isolamento di cellule c-Kit⁺ dal midollo osseo

1. Sacrificare i topi secondo le linee guida istituzionali.
   Nota: Qui, i topi sono stati esposti a biossido di carbonio (CO₂) a un secondo per il AVMA portata consigliata fino a quando la morte è stata determinata mediante la cessazione della respirazione e il battito cardiaco, seguita da dislocazione cervicale.
2. Raccogliere leossa dal mouse — due femori, delle due tibie, due iliacs. Pulire tutti i tessuti dalle ossa raschiando via con un bisturi. Mettere le ossa della gamba in PBS 1X freddo sul ghiaccio — 5 mL in una provetta da 15 mL. Versare il contenuto della provetta in un mortaio e distruggerlo con un pestello.
3. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella di 70 µm in una provetta da 50 mL tappo a vite con una pipetta 10ml collegata mediante una pipetta. Lavare il mortaio e pestello più volte con PBS 1X freddo, raccogliendo e aggiunta di sospensione cellulare per il tubo da 50 mL. Rotazione verso il basso del midollo osseo a 1.200 x g a 4 ° C per 5 min, rimuovere il surnatante tramite un vuoto con una pipetta di vetro attaccato. Sospendere il pellet cellulare in 5 mL di 1X PBS con una pipetta.
4. Con una pipetta, aggiungere lentamente sospeso del midollo osseo nella parte superiore di 5 mL di temperatura (la temperatura è critica) polysucrose, prestando la massima attenzione per non disturbare l'interfaccia. Spin a 400 x g a temperatura ambiente per 20 min con il freno disattivato.
5. Raccogliere l'interfaccia nuvoloso totale mono-nucleare delle cellule (TMNC) con una pipetta e metterlo in una provetta da 15 mL nuovo. Portare il volume fino a 10 mL con PBS 1X per il lavaggio, prendendo 20 µ l per il conteggio e spin a 1.200 x g a 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante e salvare il pellet in ghiaccio per passaggio 4.6.1.
6. Eseguire c-Kit⁺ cella di isolamento.
   1. Seguire un protocollo di kit della microperla per il c-Kit⁺ cella di isolamento. Risospendere il pellet cellulare in 80 µ l di PBS 1X + EDTA + BSA a 10⁷ cellule. La sospensione cellulare, aggiungere 20 µ l di microsfere CD117/10⁷ cellule totali. Mescolare bene nel vortex e incubare per 10 min a 4 ° C. Portare il volume fino a 10 mL con l'aggiunta di 1X PBS + EDTA + BSA e spin a 1.200 x g a 4 ° C per 5 min.
   2. Eliminare il surnatante tramite un vuoto e sospendere il pellet cellulare in 500 µ l/10⁸ cellule totali in 1X PBS + EDTA + BSA. Utilizzando il supporto magnetico con colonna magnetica associata, aggiungere 3 mL di PBS + EDTA + BSA: 1x e permettono di fluire attraverso la gravità in una provetta di raccolta 15 mL.
   3. Al termine del passaggio attraverso la colonna la prima aggiunta di buffer, è possibile aggiungere la sospensione cellulare alla colonna, facendolo fluire attraverso via gravità nel tubo di raccolta di 15 mL. Questo attraversamento è la frazione di cellule indesiderate.
   4. Lavare la colonna 3 volte con 3 mL di PBS 1X + EDTA + BSA ogni volta, facendolo fluire attraverso via gravità nella provetta di raccolta. Rimuovere la colonna dal magnete e posto sulla parte superiore di un tubo da 15 mL.
   5. Aggiungere 5 mL di PBS + EDTA + BSA: 1x e sciacquare immediatamente con lo stantuffo fornito con la colonna. Togliere lo stantuffo e ripetere il flush con un ulteriore 5 mL di 1X PBS + EDTA + BSA. Contare le celle in volume totale usando i metodi standard.
   6. Rotazione verso il basso le cellule a 1.200 x g a 4 ° C per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in completa IMDM (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] + FLT3 ligand [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) per la cultura. Cultura di che queste cellule durante la notte in 2 x 10⁶ cellule/1 mL di multimediale completo di cella IMDM inserendoli in un incubatore a 37 ° C e 5% CO₂.

5. trasduzione

1. Transfezione di plasmide retrovirali
   1. Appena scongelare le cellule HEK293 impostata il pomeriggio prima in un bagno di acqua a 37 ° C. Spin lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA contenente le cellule HEK a 435 x g a temperatura ambiente per 3 minuti rimuovere il surnatante tramite un vuoto e sospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM supplementato con 10% FBS, penicillina, streptomicina e glutamina.
   2. Contare le celle e aggiungere il volume appropriato per un piatto di 10 cm trattati (~ 4 x 10⁶ HEK293T cellule). Aggiungere mL 14 dei media DMEM 10 al piatto e mescolare bene facendo scorrere su e giù per un'equa distribuzione. Mettere il piatto in un 37 ° C, 5% CO₂ incubatore durante la notte.
   3. La mattina successiva, verifica la confluenza delle cellule sotto un microscopio ottico invertito (50% o più funziona bene).
   4. Combinare il DNA (plasmide retrovirale desiderato), PclEco (plasmide imballaggio), 2m CaCl₂e H₂0 in una provetta da 1,5 mL (= 500 µ l) utilizzando una micropipetta i seguenti importi: 7,5 µ g di DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 µ g di pCLeco, 62 µ l di 2m CaCl₂ e l'acqua ad un volume finale di 500 µ l. aggiungere 500 µ l 2 x HBS in un'altra provetta da 1,5 mL.
   5. Continuando a mescolare, aggiungere il DNA mescolare goccia a goccia per la provetta da 1,5 mL contenente 500 µ l di 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES e 1,5 mM Na₂HPO₄). Raggiungere questo obiettivo impostando un vortice per la velocità più bassa e tenere il tubo HBS su di esso per la miscelazione costante mentre aggiungere la miscela di transfezione.
   6. Consentire il mix di transfezione Incubare per 20 – 30 min a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, aggiungere 25 clorochina nM per le cellule HEK e rimetterli in incubatrice. Dopo l'incubazione, aggiungere goccia a goccia il mix di transfezione delle cellule HEK e, quindi, ruotare delicatamente il supporto per mescolare il mix di transfezione in tutta la piastra.
   7. Incubare le cellule con il mix per ~ 8 h a 37 ° C, 5% CO₂ incubator. Modificare i media su queste cellule molto lentamente aggiungendo 14 mL di fresco DMEM 10 media. Pipettare lentamente contro la parete del piatto aiuta a prevenire qualsiasi stripping delle cellule HEK. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO₂ incubator.
   8. Raccogliere il surnatante virale con una siringa da 10 mL, aspirare il surnatante nella siringa e collegare il siringa filtro da 0,45 µm. Immergere il surnatante virale in una nuova provetta di raccolta. Prendere la prima collezione di virale surnatante ~ 16 h più successivamente.
2. Trasduzione e concentrazione virale di fibronectina
   1. Aggiungere 2 mL di un frammento di fibronectina umana ricombinante di 0,1 mg in 1X PBS a piastre di coltura 6 pozzetti non trattate. Preparare tanto fibronectin come necessario, che dipende dal numero delle cellule e dei genotipi. Uno ben può sufficientemente trasdurre 10 milione cellule c-Kit⁺ . Incubare la piastra durante la notte a 4 ° C.
   2. Il giorno successivo, rimuovere la fibronectina dai pozzi con una pipetta, pipettare 2 mL di sterile 2% BSA in PBS 1X per bloccare la piastra e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere la BSA tramite un vuoto e lavare accuratamente di pipettaggio 2 mL di 1X PBS poi rimuoverlo tramite un vuoto.
   3. Aggiungere immediatamente appena raccolto e filtrato (a 0,45 µm) surnatante virale fino a 5 mL. Centrifugare a 435 x g a 32 ° C per 2 h. rimuovere il surnatante tramite un vuoto e ripetere questo passaggio con ulteriori surnatante virale appena raccolti e girare di nuovo. Rimuovere il surnatante tramite un aspirapolvere e lavare i pozzetti con l'aggiunta di 2 mL di 1X PBS; quindi, rimuoverlo tramite un vuoto.
   4. Aggiungere che il mouse di c-Kit⁺ cellule che era coltivata pernottamento (passo 4.6.6) virale dei pozzetti rivestiti da mescolando bene le sospensioni delle cellule e pipettaggio li nella piastra virale fibronectina concentrato ora. Spin a 1.200 x g a 25 ° C per 90 min mettere le cellule in un 37 ° C, 5% CO₂ incubator.
   5. posttransduction di 48h, agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 1.200 x g a 4 ° C per 5 min e risospendere li nel buffer di FACS #1 (1x PBS + 0,5% BSA) di 6 x 106/ml. Determinare la percentuale di cellule positive BCR-ABL1 misurando la percentuale di YFP positivo mediante citometria a flusso.
   6. Acquisire gli eventi con la procedura standard. In primo luogo, cancello le cellule dal vivo basate su dispersione avanti e laterali. Quindi, porta le cellule vive positive di YFP escluse YFP-negativecells determinato dal controllo negativo (Figura 4).

6. formazione di colonie UnitAssays

1. Scongelare la metilcellulosa con citochine per mouse a temperatura ambiente per 1 – 2 h. aliquota 3 mL di metilcellulosa in un tubo di FACS usando una siringa da 5 mL senza ago. Ordinare le celle di YFP-positivi su un sorter delle cellule.
2. Selezione delle cellule verso il basso e sospendere il pellet in multimediale completo IMDM. Contare le celle per essere placcato e diluirli per ottenere 5.000 cellule YFP-positive in 100 µ l di multimediale completo IMDM.
3. Aggiungere 100 µ l di sospensione cellulare contenente 5.000 cellule YFP-positive e gli inibitori appropriati a 3 mL di metilcellulosa (Vedi Tabella materiali). Vortice in alto per mescolare per 10 – 30 s.
4. Dopo la maggior parte dell'aria bolle sono scappati, utilizzare una siringa da 1 mL per piastra 1 mL di media in tre piatti di replicare cm 3 rimozione del supporto su un lato e lentamente inclinando la piastra in un movimento circolare per diffondere in modo uniforme.
5. La concentrazione finale degli inibitori di utilizzare sono imatinib a 3 µM, DFC a 0,2 µM e BCI a 0,5 µM, da soli o in combinazioni. Ove opportuno, le cellule di placcatura con 4-hydroxytamoxifen (1 µ g/mL) aggiunto per la metilcellulosa eliminare c-Fos.
6. Dopo il placcaggio, mettere le piastre in un grande piatto di Petri con un piatto aperto contenente 2 mL di acqua sterile nel mezzo. Coprire il grande piatto di Petri e attentamente Incubare a 37 ° C, 5% CO₂ incubator. Registrare i numeri di Colonia dopo una settimana di placcatura contando il numero totale delle colonie sotto un microscopio.
7. Analizzare alcune colonie da apposite piastre per l'eliminazione di c-Fos mediante PCR. Raccogliere le colonie di li succhia con una punta di P1000. Sloggiare le cellule in 500 µ l di PBS 1X lavando la punta in PBS più volte. Gira le sospensioni delle cellule a 6.000 x g per 1 min ed estrarre il DNA dal pellet cellulare utilizzando un kit di isolamento del DNA genomico.
8. Utilizzare il DNA genomico per la PCR utilizzando i primer mFos-FP3 e mFos-RP5, come descritto nella tabella 2. Analizzare i prodotti PCR su un gel di agarosio al 2% e l'immagine utilizzando un sistema di documentazione del gel.
9. Per una presentazione grafica delle colonie, macchia le colonie, utilizzando cloruro di Iodonitrotetrazolium. Sciogliere 10 mg di cloruro di Iodonitrotetrazolium in 10 mL di acqua per ottenere una soluzione di 1 mg/mL. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando un Luer lock con filtro 0,2 µm collegato a una siringa da 10 mL in condizioni di sterilità in un cappuccio di coltura del tessuto.
10. Nella coltura del tessuto cappa, aggiungere 100 µ l di soluzione colorante goccia a goccia intorno alla piastra CFU; fare attenzione a non scivolare o disturbare colonie. Incubare le piastre durante la notte in un 37 ° C, 5% CO₂ incubatrice della coltura cellulare. Le colonie si trasformeranno marrone rossastro scuro. Utilizzando uno sfondo bianco nella cappa sterili per coltura, scattare foto della piastra CFU macchiata.

7. trapianto e analisi di mortalità

1. Letalmente irradiare i topi con radiazione di Spalato utilizzando un 137 basati su Cs raggi ad un dosaggio di 7.0 Gy seguita da 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h apart prima del trapianto.
2. Trapianto di 4 x 10⁴ senza pettorale YFP-positivi (calcolato in base alla percentuale di YFP) cellule con 3 x 10⁵ cellule normali del midollo osseo come un vettore in ogni mouse attraverso la coda della vena di iniezione.
3. Dopo una settimana di trapianto, è necessario determinare il engraftment analizzando le cellule di YFP-positive dal sangue periferico mediante FACS.
4. Eseguire una coda vena sanguinare e analisi al FACS.
   1. Scaldare la gabbia dei topi sotto una lampada di calore con cautela non surriscaldare o masterizzarli.
   2. Trattenere un topo in un dispositivo di ritenuta del mouse e nick la vena della coda con una lama sterile. Delicatamente il latte la coda dall'anteriore al posteriore, permettendo una goccia di sangue ad accumularsi. Raccogliere il sangue con un tubo capillare eparinato fino a quando è pieno (raccogliere intorno a 75-100 µ l). Immergere il sangue dal tubo capillare riempito in una provetta contenente EDTA e mescolare bene.
   3. Lyse globuli rossi con l'aggiunta di 30 – 40 µ l di sangue a 3 mL di tampone di lisi RBC 1x (150 mM di cloruro di ammonio, bicarbonato di potassio 10 mM e 0,13 mM EDTA). Mescolare bene, invertendo il tubo più volte. Incubare a temperatura ambiente per 10 – 15 min Spin a 1.200 x g a 4 ° C per 5 minuti rimuovere il surnatante tramite un vuoto e sospendere il pellet in 2 mL di 1X PBS per un lavaggio.
   4. Spin a 1.200 x g a 4 ° C per 5 min, rimuovere il supernatante e sospendere nel buffer di FACS #1. Effettuare analisi FACS come descritto in precedenza in passaggio 5.2.5–5.2.66. Negozio a breve termine il sangue rimanente nel tubo di raccolta, che può essere utilizzato per vari scopi, a 4 ° C.
5. Per l'esperimento sono stati utilizzati topi trapiantati che hanno mostrato 10 – 40% cellule YFP-positive nel sangue periferico. Topi che avevano meno del 2% delle cellule YFP-positive sono stati esclusi dallo studio.
6. Preparare il tamoxifene 20 mg/ml in olio di mais a 60 ° C con intermittente nel vortex fino a quando completamente sciolto e conservarlo a 4 ° C al buio per tutta la durata del trattamento. Dopo una settimana di trapianto, Elimina l'allele di c-Fos^fl/fl iniettando tamoxifen (100 mg/kg in olio di mais) per via intraperitoneale (i.p.) in topi, ogni giorno per tre giorni consecutivi. È importante che i topi sono pesati per determinare quanto tamoxifene per iniettare. Dopo il trattamento di tamoxifene (ove necessario), i topi per trattamenti farmacologici di gruppo (n = 5/gruppo).
7. Monitorare i topi per leucemia progressione e sopravvivenza e determinare fino a otto settimane nella sopravvivenza di topi download leucemiche onere (cellule di YFP-positive di FACS).
8. Analizzare il sangue per l'eliminazione di c-Fos ovunque appropriato, come descritto sopra nella sezione 6. Registrare il numero di topi di ogni giorno e tracciare la curva di sopravvivenza alla fine dell'esperimento utilizzando un software di grafico.

8. animali transgenici modello di BCR-ABL1 leucemia

1. Isolamento di LSK
   1. Mantenere i topi transgenici Scl-tTA su chow di doxiciclina per prevenire un'espressione di BCR-ABL1. Quattro settimane prima del trapianto, prendere i topi fuori la doxiciclina chow per espressione di BCR-ABL1.
   2. Isolare TMNCs da topi transgenici Scl-tTA come descritto sopra nella sezione 4. Sospendere il TMNCs nel buffer di FACS #2 (1x PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) per ottenere 10⁶ cellule/mL.
   3. Impoveriscono il TMNCs per cellule lignaggio-positive aggiungendo 10 µ l di biotina cocktail per il rilevamento delle cellule lignaggio (biotina-coniugati di anticorpi monoclonali contro CD5 [ratto IgG2a], CD11b [ratto IgG2a], CD45R [B220] [ratto IgG2a], Anti-7-4 [ratto IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, ratto IgG2a] e Anti-Ter-119 [ratto IgG2b]) per 1 x 10⁶ cellule. Incubare le cellule a 4 ° C per 10 min al buio, seguita da un lavaggio con 5 mL di tampone di FACS #2 e girare a 1.200 x g a 4 ° C per 5 min, aspirare il surnatante completamente e sospendere le cellule in 400 µ l di tampone di FACS #2.
   4. Aggiungere 5 µ l di coniugato anti-biotina anticorpo-FITC, 1,2 µ l di PECy7 Ly-6A/E (Sca1) e 2,4 µ l di anticorpi APC CD117 (c-Kit) per fino a 10 celle di⁸ milioni. Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 min Wash portando il volume fino a 5 mL con tampone di FACS #2; Centrifugare a 1.200 x g a 4 ° C per 5 min, rimuovere il sopranatante, quindi sospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone di FACS #2.
   5. Filtrare la sospensione cellulare in un tubo di FACS filtro-tappo blu.
   6. Cellule vive cancello usando la dispersione laterale e in avanti. Quindi, selezionare le celle di lin^– che ha mostrato MFI (significa che l'intensità di fluorescenza di meno di 10²) per ottenere LSK cellule c-Kit⁺ e Sca1⁺ su un biesponenziale trama dall'oggetto padre di Lin^– e ordinarli (Figura 7 C).
   7. Raccogliere le cellule ordinate e li Centrifugare a 1.200 x g a 4 ° C per 5 min.
2. Trapianto
   1. Letalmente irradiare i topi di BoyJ con un dosaggio di radiazioni di Spalato di 7.0 Gy seguita da 4,75 Gy dopo 3 h, prima del trapianto.
   2. Iniettare 3 x 10³ a 5 x 10³ BCR-ABL1-LSK celle con 0,3 x 10 cellule di midollo osseo dell'assistente⁶ da topi WT BoyJ via vena caudale (i.v.) in topi irradiati BoyJ.
   3. Posttransplantation di quattro settimane, analizzare i topi destinatari per CD45.1 e CD45.2. Ottenere il TMNC dal sangue periferico di coda vena sanguinamento come descritto al punto 7.4. Risospendere le cellule in 100 µ l di tampone di FACS. Incubare le cellule con 1 µ l di anticorpo CD45.1-FITC e CD45.2-PE a temperatura ambiente per 1 h.
   4. Lavare le cellule portando il volume a 3 mL con tampone di FACS e spin a 1.200 x g a 4 ° C per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere le in 200 µ l di 1X PBS.
   5. Analizzare la percentuale su CD45.1 e CD45.2 di primo gating cellule vive basate sulla dispersione in avanti e laterale, seguita da gating cellule PE-positive e di FITC - basate sul campione senza macchia.
   6. I topi del gruppo in quattro gruppi (n = 6 per gruppo). Iniziare il trattamento con imatinib (75 mg/kg 2 volte al giorno) da solo e in combinazione con DFC + BCI (entrambe le droghe sono stati dati ad una dose di 10 mg/kg 2 volte al giorno).
   7. Trattare allo stesso modo, altri gruppi con combinazioni di curcumina (150 mg/kg), imatinib (75 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) e imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) per tre mesi, 2 volte al giorno, da iniettato i.p.
   8. Analizzare i topi 1 volta al mese per sei mesi per chimerismo leucemica determinando la percentuale di CD45.2 positivo cellule nel sangue periferico di coda della vena sanguinamento come descritto al punto 7.4.

9. valutazione in Vivo della BCI e DFC attività

1. Analisi di phospho-p38
   1. Prendere tre topi leucemici (8 – 12 settimane di età) che sono stati trapiantati con BCR-ABL1-esprimendo le cellule c-Kit⁺ , come descritto nella sezione 7. Iniettare i topi con BCI (10 mg/kg) iniettando i.p. quattro settimane posttransplant.
   2. Misurare i livelli di phospho-p38 sangue periferico TMNC utilizzando il kit di citometria a flusso di fosforilazione secondo le istruzioni del fornitore. Raccogliere il sangue da ogni mouse prima e 6 h dopo l'iniezione di droga. Isolare il TMNCs da svuotamento di RBC e correggerli come segue.
   3. Aggiungere 4 mL di soluzione di lisi di RBC per 100 µ l di sangue periferico. Miscelare e incubare in ghiaccio per 5 min lisare il RBCs. Centrifugare le cellule a 1.200 x g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Ripetere la lisi 1 x altro.
   4. Dopo il secondo passaggio di Lisi, lavare il pellet cellulare con 1 mL di 2% BSA in PBS. Fissare le cellule aggiungendo 100 µ l delle soluzioni di fissaggio e permeabilizzazione ed incubare per 20 min a 4 ° C al buio. Pallina della cella mediante centrifugazione a 1.200 x g per 5 min a 4 ° C.
   5. Lavare il pellet con 1 mL di 1x lavaggio permeabilizzazione. Bloccare le cellule aggiungendo 300 µ l di 2% BSA in tampone di lavaggio di permeabilizzazione a temperatura ambiente per 20 min. dividere le celle in uguale tre aliquote di 100 µ l (~ 1 x10⁶).
   6. Ad ogni aliquota di celle fisse aggiungere 1 µ l di anticorpo p-38 totale, 1 µ l di anticorpo phospho-p38 o 1 µ l di isotipo IgG Controllo, rispettivamente e incubare per una notte a 4 ° C.
   7. Lavare le cellule 1 x 5 ml di 2% BSA in PBS e incubare con anticorpo secondario (1 µ l di coniugato Alexa Fluor-488) per 1 h a temperatura ambiente. Lavare le cellule 1 x nuovo e sospenderle in 200 µ l di PBS 1X.
   8. Acquisire i dati da FACS e analizzarli da software di analisi di citometria a flusso.
   9. Detrarre l'IFM del controllo IgG dal MFI dei campioni sperimentali. I valori MFI di phospho-p38 quindi sono normalizzati a quella di p-38 totale per determinare i livelli di phospho-p38 dopo l'iniezione di BCI.
2. Analisi dell'espressione genica quantitativa dei geni target di c-Fos
   1. Prendere tre topi leucemici (8 – 12 settimane), che sono stati trapiantati con cellule di c-Kit⁺ BCR-ABL1-esprimendo come descritto nella sezione 7. Raccogliere il sangue periferico da ogni mouse e poi iniettare i topi con 10 mg/kg ogni di DFC + BCI.
   2. Raccogliere il sangue periferico 6 h dopo l'iniezione di droga. Isolare TMNCs da svuotamento di RBC, come descritto in precedenza. Il TMNCs di pellet e sospenderle in un buffer di lisi fenolo-basato (Vedi Tabella materiali).
   3. Effettuare analisi di RT-qPCR (come descritto nella sezione 1) per Bcl2l11, Lif e IL-6 usando gli iniettori di gene-specific (riportati nella tabella 1).

10. a lungo termine cultura-avviare l'analisi delle cellule

Nota: Un'analisi LTCIC è stata eseguita come descritto in precedenza²⁵.

1. Crescere una linea di cellulare dei fibroblasti di topo MS-5 in MEMα alla confluenza in un matraccio di cultura del tessuto T175. Tripsinizzano le celle come descritto sopra per HEK293T. Sospendere le cellule in MEMα a 2 x 10⁶ cellule/mL. Prendere 10 x 10⁶ cellule in una provetta conica da 50 mL e irradiare a 80 Gy. Diluire le cellule a 0,5 x 10⁶ cellule/mL in MEMα completati con media di 10% FBS (M10). Piastra da 2 mL per pozzetto in un piatto di 12-pozzetti e viene quindi incubato in un 37 ° C, 5% CO₂ incubatore durante la notte.
2. Il giorno successivo, è necessario preparare l'idrocortisone sodio hemisuccinate sciogliendo 2,5 mg in 5 mL di MEMα (soluzione 1 M). Filtro-sterilizzare la soluzione di idrocortisone utilizzando una siringa filtro 0,2 µm in cappa di sicurezza biologica. Diluire l'idrocortisone di diluizione seriale in MEM per ottenere una soluzione di 100 µM. Aggiungere 250 µ l di questa a 25 mL di terreno di coltura a lungo termine umano (HLTM) (Vedi Tabella materiali) appena prima dell'uso, per ottenere una concentrazione finale di 1 µM.
3. Rotazione verso il basso la CML-CD34⁺ e TMNCs di UCP3 sospenderli nella HLTM breve nel vortex e determinare i conteggi di un emocitometro.
4. Vuoto disattivare il supporto di M10 dalla piastra 12-pozzetti seminato con cellule dello stroma e sostituirlo con 1 mL di cella paziente (CML-CD34⁺ [10.000] e UCP3 TMNCs [1 x 10⁶]) sospensione in HLTM. Utilizzare tre pozzi per ogni combinazione di droga per ogni tipo di cellula.
5. Diluire le scorte di farmaci a 2x della concentrazione necessaria in HLTM. Aggiungere 1 mL di media con farmaci per le suddette cellule per ottenere una concentrazione di farmaco di 1x. Sostituire metà dei media con HLTM preparata al momento ogni settimana per cinque settimane.
6. Alla fine del periodo di analisi di sei settimane LTC-IC, raccogliere cellule nonadherent in una provetta da culture. Tripsinizzano cellule aderenti e combinarle con le corrispondenti cellule nonadherent.
7. Lavare le cellule e le analisi per CFUs in metilcellulosa Media contenente 30% siero fetale di vitello, eritropoietina (3 unità/mL), SF (50 ng/mL) e IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL) e del fattore distimolazione del granulocyte/macrofago (GM-CSF) (20 ng / mL). i conteggi per determinare un emocitometro.
8. Piastra 5 x 10⁴ cellule in tre repliche. Congelare giù le celle rimanenti nella 20% FBS e 10% DMSO. Organizzare le piastre in un grande piatto di Petri con un piatto aperto contenente acqua nel mezzo. Coprire il grande piatto di Petri con attenzione e viene quindi incubato in un 37 ° C, 5% CO₂ incubatore per due settimane.
9. Punteggio ottenuto le colonie due settimane più tardi. In alcuni casi, solo una parte del raccolto viene analizzata per CFUs). Calcolare che il numero totale di LTCIC presenti in sospensione iniziale delle cellule estrapolando basato su CFUs ottenuta da parte del raccolto delle cellule. La produzione media di CFU per LTC-IC è 8.
   Nota: Ad esempio, se inizialmente 1 x 10⁶ cellule erano placcate in un pozzo, dopo cinque settimane, 0,5 x 10⁶ cellule sono state raccolte e per CFU, 5 x 10⁴ cellule erano cromate e 50 CFUs sono stati ottenuti. Questo equivale a 500 CFUs/1 milione cellule placcate. Dividere questo numero per 8 per ottenere il LTCIC, che è 62,5.

11. umanizzato Mouse modello utilizzando CML CD34 cellule⁺

1. Riproducubile irradiare i 8 topi settimana-vecchio NOD scid gamma, esprimendo umano IL3, GM-CSF e SCF (NSGS), con una singola dose di 7.0 Gy (700 Rad) con 50 GY/min.
2. Iniettare 3 x 10⁶ CD34⁺ celle selezionate da pazienti in fase cronica BCR-ABL1-positive CML in topi irradiati per iniezione endovenosa.
3. Dopo due settimane di trapianto, è necessario determinare il engraftment leucemico nel midollo osseo di FACS usando gli anticorpi specifici del mouse e umani contro CD45.
4. Eseguire un'analisi di FACS.
   1. Prendere il midollo osseo aspirato da femori dei topi trapiantati. Lyse RBCs utilizzando il buffer di lisi RBC come descritto sopra e raccogliere il TMNCs mediante centrifugazione. Lavare la pallina 1 x con PBS 1X freddo.
   2. Bloccare le cellule con umano FcR blocco e blocco di FcR mouse seguita dalla macchiatura con anti-umani CD45 FITC e anti-topo CD45 APC^Cy7 durante la notte a 4 ° C. Eseguire l'analisi di FACS su LSRII e analizzare i dati utilizzando software di analisi di citometria a flusso.
5. Raggruppare i topi in quattro gruppi differenti (n = 6/gruppo) per il trattamento con veicolo, imatinib (75 mg/kg), DFC, BCI (entrambi a 10 mg/kg), o imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (entrambi a 10 mg/kg). Diluire i farmaci stock in PBS 1X (veicolo) e amministrarli iniettando loro i.p. 2 volte al giorno.
6. Trattare i topi per sei settimane e determinare l'onere leucemica ogni due settimane, fino a otto settimane dopo il trapianto, come descritto in precedenza in 11,4.

Risultati

Dipendenza dell'oncogene è stato implicato nell'efficacia terapeutica di TKI. Tuttavia, i meccanismi che guidano la dipendenza dell'oncogene non sono capiti. Abbiamo effettuato l'analisi dell'espressione genica imparziale multipli per identificare la componente genetica coinvolta nell'orchestrare la dipendenza. Queste analisi hanno rivelato il upregulation di tre geni, c-Fos, Dusp1 e Zfp36, in cellule tumorali che non sono dipendenti da oncogeno di segnalazione per la sopravvivenza e, qui...

Discussione

Per la maggior parte delle cellule tumorali, la risposta terapeutica a TKI è mediata da un blocco di tirosina-chinasi-oncoproteina segnali a cui il tumore è assuefatto. Tuttavia, relativamente poco è conosciuto circa come una minoranza delle cellule tumorali, contribuendo alla MRD escape l'oncogene dipendenza e terapia⁴. Studi recenti hanno rivelato che la segnalazione di fattore di crescita media farmacoresistenza in leucemia e tumori solidi dell'organo. Ciò suggerisce che vari meccanismi molecol...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali biologici
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
Frammento di fibronectina umana ricombinante con retroNectina	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (metilcellulosa per CFU di topo)	Cellule staminali	3434
MethoCult H4434 Classic (metilcellulosa per CFU umana)	Cellule staminali	4434
4-idrossitamoxifene	Sigma	H6278
Ricombinante Murino SCF	Prospec	CYT-275
Ricombinante Murino Flt3-Ligando	Prospec	CYT-340
Ricombinante Urina IL-6	Prospec	CYT-350
Ricombinante Urina IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratorio	I-5508
Curcumina	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biologico	S11150
Tripsina EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutammina	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in acqua
Puromicina	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamina solfato	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in acqua
Soluzione di Trypan Blue (0,4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0,45 μ Filtro a dischi acro M	PALL	2016-10
70 μ m nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polisaccarosio)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Cocktail Inibitore della Proteasi	Roche	CO-RO
Cocktail Inibitore della Fosfatasi 2	Sigma	P5762
Membrana di nitrocullulosio	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Substrato di durata estesa (substrato di chemiluminescenza)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD
CD117 APC	BD
BD Pharm Lyse	BD
BD Cytofix/Cytoperm (Soluzione fissante e permeabilizzante)	BD
BD Perm/Lavaggio  (permeabilizzazione e soluzione di lavaggio per flusso fosfogenico)	BD
fosfo p38	Tecnologie di segnalazione cellulare	4511S
totale p38	Tecnologie di segnalazione cellulare	9212
Controllo IgG del topo	BD
Alexa Flour 488 coniugato	Invitrogen	A-11034
Cloruro di calcio	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Provette per capillari sanguigni	Fisher	22-260-950
Provetta per prelievo di sangue	Giene Bio-One	450480
Siero di vitello neonato	Atlanta biologico	S11295
Eritropoieina	Amgen	5513-267-10
umano SCF	Prospec	CYT-255
Umano IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (terreni per il test LTCIC)	Stem Cell Technologies	5100
Idrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 siringa da insulina 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestello	Coor tek	60316 e 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillina	Sigma	A0166	100 mg/mL stock in acqua
Bacto agar (agar)	Difco	214050
Brodo formidabile	Becton Dickinson	243820
Agarosio	Genemate	E-3119-500
Doxiciclina chow TestDiet.com		52662	RMH1500 modificato, autoclavabile 5LK8  con 0,0625% di doxiciclina
Tamoxifene	Sigma	T5648
Iodonitrotetrazolio cloruro	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Kit per sangue e tessuti	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq polimerasi con colorante Green loadign	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (Kit di isolamento dell'RNA)	Qiagen	217084
Kit Dnase senza DNA (trattamento con DNAsi per RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (trascrittasi inversa per la sintesi di cDNA)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (miscela di taq polimerasi con colorante intercalante verde per qPCR)	Kit
CD117 MicroBead	Miltenyi	130-091-224
umano a lungo termine per l'avvio di colture cellulari	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubatore	Thermo scientific
Pivot bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 contatore di cellule automatizzato	Bio-RAD
C-1000 Termociclatore	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (sistema di imaging per gel e western blots)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (contatore di boold)	Drew-Scientific
LSR II (analizzatore FACS)	BD
Fortessa I (analizzatore FACS)	BD
FACSAriaII (Smistatore FACS)	BD
Supporto magnetico	Miltenyi
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Modello 68A	sorgente Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dott.ssa Claudia Huettner' s laboratorio
BoyJ	impianto di carote di topo presso CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	impianto di carotaggio del topo presso CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Prodotto in casa
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Prodotto in casa
Cells
BaF3	Regalo da George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Regalo da George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ e cellule	CD34+ normaliOspedale universitario, Università di Cincinnati