Salmonella spp /Shigella spp sono agenti patogeni comuni attribuiti alla diarrea. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per lo screening della Salmonella spp /Shigella spp usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidato.
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Articolo metodologico
Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.
In questo articolo
Sommario
Abstract
Trasmissione feco-orale di gastroenterite acuta si verifica di tanto in tanto, soprattutto quando le persone che hanno gestito il cibo e l'acqua sono infetti da Salmonella spp./Shigella spp. Il metodo gold standard per la rilevazione della Salmonella spp./Shigella spp è coltura diretta ma questo è laborioso e che richiede tempo. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per Salmonella spp./Shigella spp., screening, usando reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) combinata con cultura guidata. Ci sono due fasi principali: PCR in tempo reale e la cultura guidata. Per la prima fase (Real-Time PCR), spieghiamo ogni passaggio del metodo: esempio di collezione, pre-arricchimento, estrazione del DNA e PCR in tempo reale. Se il risultato in tempo reale di PCR è positivo, allora viene eseguita la seconda fase (guidata cultura): coltura selettiva, identificazione biochimica e sierologica caratterizzazione. Illustriamo anche risultati rappresentativi generati da esso. Il protocollo descritto qui sarebbe una valida piattaforma per lo screening rapido, specifico, sensibile ed alta-velocità di trasmissione di Salmonella spp /Shigella spp.
Introduzione
La diarrea è ancora un problema di salute comune con un'alta incidenza globalmente tasso1,2. Anche se la mortalità è relativamente bassa, alcuni pazienti mostrano vari sintomi per settimane (come sgabelli allentati e acquosi, l'urgenza di andare in bagno), che rendono l'impatto socio-economico molto alto3,4. Più seriamente, alcuni pazienti possono anche sviluppare sindrome dell'intestino irritabile se lasciato non trattato5. Ci sono vari tipi di batteri, virus e parassiti che possono causare diarrea6.
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Protocollo
Il protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana di Zhuhai International Travel Healthcare Center. Si prega di utilizzare standard di funzionamento sterile durante l'esperimento.
1. preparazione e composizione di terreni di coltura
- Preparare il brodo nutritivo: Sciogliere 1% peptone, 0,3% di Estratto di carne di manzo, 0,5% cloruro di sodio, 0,1% di glucosio in H2O, regolare il pH a 7,5 e autoclave a 121 ° C per 15 min.
- Preparare il supporto di Selenite cistina: sciogliere 0,5% peptone, lattosio 0,4%, 1% Na2HCO3, selenito di 0,4% sodio idrogeno, 0.001% L-cistina in H....
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Risultati
Il protocollo è stato applicato per lo screening della Salmonella spp /Shigella spp nelle feci anale campioni da chi dovrebbe gestire cibo e acqua.
In fase PCR in tempo reale, come mostrato in Figura 5A, c'era un'amplificazione successo nel canale di HEX, che significava che il misto del campione era positivo per Salmonella spp. Quindi un ulteriore PCR in .......
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Discussione
Da Salmonella spp /Shigella spp sono spesso associati con l'intossicazione alimentare e trasmissione fecale-orale di gastroenterite acuta28,29 e il metodo di routine è laborioso o richiede molto tempo 7, descriviamo una piattaforma ad alta produttività per la Salmonella spp / proiezione diShigella spp., usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidata.
Ci sono divers.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da scienza e tecnologia programma di Zhuhai, Cina (concessione numero 20171009E030064), la scienza e tecnologia programma del Guangdong, Cina (concessione numero 2015A020211004) e scienza e tecnologia programma dell'amministrazione generale di supervisione della qualità, ispezione e quarantena della Repubblica popolare cinese (concessione numero 2016IK302, 2017IK224).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premiscela) | Takara | R040Q | |
| Brodo Nutriente LandBridge | CM106 | ||
| Nutriente agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cistina medio | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella agar cromogenico | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella siero diagnostico | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella siero diagnostico | Tianrun | SHI54 | |
| tampone anale (tubo di raccolta plus) | Huachenyang | ||
| diapositiva | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubatore | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| bagno a secco | Jinghong | KB-20 | |
| sistema automatizzato di identificazione microbica | bioMé rieux | VITEK2 | potrebbe essere utilizzato un altro sistema equivalente |
| una macchina fluorescente per PCR in tempo reale | ThermoFisher | ABI7500 | potrebbe essere utilizzata un'altra macchina equivalente |
Riferimenti
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in G....
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Ristampe e permessi
